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基于代謝組學研究高產(chǎn)與低產(chǎn)奶牛血漿差異代謝物及代謝通路分析

2022-12-08 12:42:26張力莉徐曉鋒
動物營養(yǎng)學報 2022年11期
關鍵詞:色氨酸膽酸膽汁酸

楊 靖 火 苗 茍 妍 張力莉 徐曉鋒

(寧夏大學農(nóng)學院,銀川 750021)

同等條件飼養(yǎng)的奶牛,個體間的產(chǎn)奶量差異較大,產(chǎn)奶量受到較多因素的影響,包括奶牛遺傳改良、生理階段、飼養(yǎng)管理和飼糧組成等[1-3],但與泌乳相關重要代謝物差異是影響奶牛泌乳性能的重要因素[4-5]。因此,開展對奶牛產(chǎn)奶過程中變化顯著的血漿代謝物和代謝通路的研究,對提高奶牛產(chǎn)奶量、獲得最大的經(jīng)濟效益具有重要的實用價值和現(xiàn)實意義。

代謝組學是使用高通量技術對生物樣品中的小內(nèi)源性代謝物進行檢測[6]。由于代謝組學技術具有較高的分辨率和靈敏度等特點,近年來,在篩選瘤胃代謝物生物標志物方面被廣泛應用,從而揭示飼糧對動物健康和生產(chǎn)性能的影響[7],研究疾病或生理學的潛在代謝物生物標記物[8-9],并檢查飲食誘導的瘤胃代謝譜的代謝改變及其對反芻動物產(chǎn)奶相關性狀的影響[6,10-11]。利用代謝組學技術對產(chǎn)奶牛能力不同的奶牛進行血漿代謝物檢測,比較分析代謝的差異,便于了解不同產(chǎn)奶量奶牛體內(nèi)物質(zhì)代謝途徑的變化[12]。本試驗采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析高產(chǎn)與低產(chǎn)奶牛的血漿差異代謝物,旨在研究高產(chǎn)與低產(chǎn)奶牛血漿代謝組特征,從代謝角度探索高產(chǎn)與低產(chǎn)奶牛血漿代謝物特點,為開展飼糧營養(yǎng)調(diào)控奶牛產(chǎn)奶性能提高理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與管理

試驗選擇健康、胎次[(2.04±0.81)胎]相近、泌乳天數(shù)[(23.58±8.80) d]相近、體重相近的高產(chǎn)[產(chǎn)奶量(40.56±1.57) kg/d]和低產(chǎn)[產(chǎn)奶量(25.17±1.66) kg/d]荷斯坦奶牛各12頭,分為高產(chǎn)組(Hca組)和低產(chǎn)組(Lca組)。在飼養(yǎng)期間,奶牛自由飲水,飼喂全混合日糧(TMR),飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

1.2 血漿樣品采集與處理

在晨飼前,用含肝素鈉的一次性真空采血管尾根靜脈采血,1 500×g離心10 min,將收集到的上層血漿置于液氮速凍后,在-80 ℃冰箱中凍存,用于后續(xù)樣品分析。

1.3 血漿代謝物提取

將在4 ℃下解凍的每個樣品取100 μL,加入100 μL預冷水和800 μL預冷的甲醇/乙腈1∶1,混合均勻,冰水浴中超聲60 min后,于-20 ℃孵育1 h進行蛋白質(zhì)沉淀,16 000×g、4 ℃離心20 min,取上清液在高速離心機中揮干。加入100 μL乙腈-水1∶1混合溶液用于質(zhì)譜檢測時的復溶,離心15 min(4 ℃、14 000×g),取上清液用于樣品分析。

1.4 LC-MS/MS分析

1.4.1 色譜分離

采用1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC,安捷倫科技有限公司)對放于4 ℃進樣器的樣品進行色譜分離,設定5 μL的進樣量,25 ℃的溫度,0.3 mL/min的流速;水、乙酸銨(25 mmol/L)、氨水(25 mmol/L)為流動相A,乙腈為流動相B。梯度洗脫程序:0~0.5 min,流動相B的線性為95%;0.5~7.0 min,流動相B的線性從95%降至65%;7.0~9.0 min,流動相B的線性從65%降至40%;9.0~10.0 min,流動相B的線性保持在40%;10.0~11.1 min,流動相B的線性從40%增至95%;11.1~16.0 min,流動相B的線性保持在95%。

1.4.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集

采用電噴霧電離(ESI)對每例樣品進行正離子和負離子模式檢測。采用Triple-TOF5600質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)對UHPLC分離后的樣品進行分析。ESI源條件:離子源氣體1為60 psi,離子源氣體2為60 psi,簾式氣體(CUR)為30 psi,源溫度為600 ℃,離子空間電壓浮動(ISVF)±5 500 V(正、負2種模式);飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)掃描范圍:質(zhì)荷比(m/z)60~1 200,生產(chǎn)掃描范圍:m/z 25~1 200,TOF-MS掃描累積時間0.15 s/譜,產(chǎn)品離子掃描累積時間0.03 s/譜。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理和分析

峰面積的提取以及峰對齊、保留時間的校正均來自于格式轉(zhuǎn)換后的原始數(shù)據(jù)經(jīng)MSDIAL軟件的XCMS程序。通過相關方式檢索MassBank、HMDB等自建的代謝物標準品庫和公共數(shù)據(jù)庫來鑒定代謝物的結構。

采用SIMCA-P 14.1軟件對刪除數(shù)據(jù)組內(nèi)缺失值>50%離子峰后的正負離子模式進行識別,通過多維統(tǒng)計分析經(jīng)Pareto scaling預處理后的數(shù)據(jù),包括無監(jiān)督主成分分析(PCA)、有監(jiān)督偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。

2 結果與分析

2.1 血漿樣品代謝質(zhì)譜及數(shù)據(jù)分析

由圖1和圖2可知,正、負離子檢測模式下質(zhì)量控制(QC)樣品各色譜峰的響應強度和保留時間基本重疊,總粒子流圖(TIC)重疊圖的重疊程度可以說明儀器穩(wěn)定,且所得數(shù)據(jù)有效。

利用PCA對色譜峰的數(shù)據(jù)進行分析,由PCA得分圖(圖3)可知,Hca組和Lca組血漿樣品之間有堆疊,但表現(xiàn)出明顯的分離趨勢,Hca組和Lca組之間模型解釋率(R2X)為0.325。進一步使用有監(jiān)督PLS-DA和OPLS-DA來評估Hca組和Lca組之間的血漿樣品差異,進而判斷LC-Q/TOF-MS的X變量(峰強度)與Y變量(分組信息)之間的相關性。為了預測樣品差異,本試驗通過PLS-DA和OPLS-DA建立代謝物表達量與樣品差異之間的關系模型,結果見圖4,2模型的R2Y、Q2均大于0.5且趨近于1,說明該模型預測能力較高且穩(wěn)定性良好。

橫坐標為正離子檢測模式下質(zhì)量控制樣品各色譜峰的保留時間(min),縱坐標為正離子檢測模式下質(zhì)量控制樣品各色譜峰的響應強度。The abscissa is the retention time (min) of each chromatographic peak of the QC sample in the positive ion detection mode, and the ordinate is the response intensity of each chromatographic peak of the QC sample in the positive ion detection mode.

橫坐標為負離子檢測模式下質(zhì)量控制樣品各色譜峰的保留時間(min),縱坐標為負離子檢測模式下質(zhì)量控制樣品各色譜峰的響應強度。The abscissa is the retention time (min) of each chromatographic peak of the QC sample in the negative ion detection mode, and the ordinate coordinate is the response intensity of each chromatographic peak of the QC sample in the negative ion detection mode.

OPLS-DA是在PLS-DA的基礎上,進行了正交變換的矯正,可以濾除與分類信息無關的噪音,提高了模型的解析能力和有效性。并將得到的OPLS-DA模型進行置換檢驗用來檢測構建的模型是否“過擬合”(圖5)。在OPLS-DA模型下,Hca組和Lca組血漿樣品區(qū)分狀況良好(圖6)。其中,R2X為0.197,R2Y為0.986,表明利用19.7%的LC-Q/TOF-MS數(shù)據(jù)可以反映2組血漿樣品之間的差異,但Q2為0.761,高于0.5,表明模型具有較高的可預測性。所以,由圖3和圖6可知,Hca組和Lca組奶牛血漿樣品代謝物有明顯差異。

圖中每個點代表了1個樣品。橫坐標為第1主成分,縱坐標為第2主成分,2點之間在橫、縱坐標上的距離代表了樣品受第1主成分或第2主成分影響下的相似性距離。Each point in the figure represents a sample. The abscissa is the first principal component, the ordinate is the second principal component, and the distance between the two points on the abscissa and ordinate represents the similarity distance of the sample under the influence of the first principal component or second principal component.

2.2 血漿差異代謝物的篩選

利用t檢驗的P值和差異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)對預處理后的數(shù)據(jù)繪制火山圖。由圖7可知,差異代謝物的分布說明篩選鑒定該數(shù)據(jù)可行。由表3可知,本試驗中,2組奶牛血漿中共篩選出27個差異代謝物,與Lca組比較,Hca組奶牛血漿中?;撬帷⒛懰?、豬膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、脫氧膽酸、L-亮氨酸、吲哚-3-甲醇、吲哚-3-乙酰胺等18個代謝物上調(diào),而苯乙酰甘氨酸、苯乙酸及、對羥基苯乙醇等9個代謝物下調(diào)。

橫坐標為第1主成分,縱坐標為第2主成分,R2Y為0.997,Q2為0.838。The abscissa is the first principal component, and the ordinate is the second principal component. R2Y is 0.997, and Q2 is 0.838.

橫坐標代表隨機分組的Y與原始分組Y的相關性,縱坐標代表R2和Q2的得分。7次置換檢驗。The abscissa represents the correlation of randomly grouped Y to the original grouping Y, and the ordinate represents the scores of R2 and Q2. Seven permutation tests.

2.3 代謝通路分析

對差異代謝物富集的通路進行KEGG數(shù)據(jù)庫分析(圖8),其是利用P值或Q值最小的前10個KEGG通路來作圖,縱坐標為Pathway,橫坐標為富集因子,大小表示數(shù)量多少,顏色越紅P/Q值越小。經(jīng)通路富集分析共得到10條代謝通路,篩選出的代謝通路為:色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、初級膽汁酸生物合成、膽汁分泌、礦物質(zhì)吸收以及葉酸拮抗劑抗性等。由KEGG數(shù)據(jù)庫分析可知,Hca組和Lca組奶牛血漿中苯丙氨酸代謝、膽汁分泌代謝以及葉酸拮抗劑抗性差異極顯著(P<0.01),色氨酸代謝、初級膽汁酸生物合成等代謝途徑差異顯著(P<0.05)。且Hca組奶牛血漿中膽汁分泌、初級膽汁酸生物合成、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路和礦物質(zhì)吸收相對于Lca組增強,而苯丙氨酸代謝、葉酸拮抗劑抗性以及溶酶體代謝通路相對于Lca組減弱。

圖中橫坐標表示預測主成分,縱坐標表示正交主成分,百分比表示該成分對數(shù)據(jù)集的解釋率。R2Y為0.986,Q2為0.761。The abscissa represents the predicted principal component, the ordinate represents the orthogonal principal component, the percentage represents the interpretation rate of the component to the dataset. R2Y is 0.986, and Q2 is 0.761.

3 討 論

3.1 膽汁分泌與膽酸的初級生物合成對產(chǎn)奶量的影響

膽汁分泌產(chǎn)生膽酸,主要是膽汁酸,其是生命活動的重要調(diào)節(jié)因子,參與葡萄糖、脂肪和能量代謝的調(diào)節(jié),與腸道激素、微生物群和能量平衡密切相關[13]。肝細胞色素膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)催化膽固醇轉(zhuǎn)化為7α-羥基膽固醇,在線粒體中3β-羥基-Δ5-C27-羥基類固醇脫氫酶的催化下產(chǎn)生7α-羥基-4-膽甾烯-3-酮,經(jīng)過一系列反應最終生成膽酸,并迅速結合?;撬峄蚋拾彼?,形成結合的膽汁酸,然后從膽管流入十二指腸。初級膽汁酸轉(zhuǎn)化為次級游離膽汁酸[14-15],主要是脫氧膽酸,并在肝臟和腸道代謝后發(fā)生硫酸化、糖基酯化和糖基化等反應。有研究發(fā)現(xiàn),奶牛血漿中的膽固醇含量顯著降低,膽固醇分解代謝增強,導致初級膽汁酸的合成增加[16]。本研究中,與低產(chǎn)奶牛相比,高產(chǎn)奶牛血漿中的膽酸、豬膽酸、甘氨熊脫氧膽酸和脫氧膽酸顯著增加。初級膽汁酸和甘氨酸或?;撬峤Y合,產(chǎn)生甘膽酸及?;悄懰幔媚戸]o酶A,并協(xié)助脂肪在奶牛小腸中消化和吸收[17],脂肪的消化產(chǎn)物甘油通過糖異生作用進入糖酵解和三羧酸循環(huán)(TCA)[18-19],為奶牛泌乳供能,增加奶牛產(chǎn)奶量。有研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群對膽汁酸進行去共軛化、脫羥基化和差向異構化等生物學修飾,進而影響膽汁酸的合成與代謝[20-22]。同時,腸道菌群也可通過對膽汁酸合成途徑中關鍵酶調(diào)節(jié)影響膽汁酸合成[23]。又有研究表明,膽汁酸在腸道中乳化脂肪的同時也能對腸道部分微生物起到抑制作用[24],進而提高奶牛泌乳量,改善能量負平衡,而汪悅等[25]研究發(fā)現(xiàn),奶?!澳c道-乳腺通路”存在,關于血漿膽酸與腸道微生物及奶牛產(chǎn)奶量的關系需要深入研究。

橫坐標為log2(差異倍數(shù)),縱坐標為t檢驗顯著性檢驗P值的負對數(shù)-log10(P值)。The abscissa is log2 (FC), and the ordinate is the negative logarithm -log10 (P-value) of the P-value of the t test significance test.

表2 Hca組和Lca組血漿差異代謝物

3.2 氨基酸代謝對產(chǎn)奶量的影響

本研究分析表明,苯丙氨酸途徑在2組間的差異顯著,與Lca組相比較,Hca組苯丙氨酸代謝中的主要底物中3種下調(diào)代謝產(chǎn)物所致(苯乙酰甘氨酸、苯乙酸及對羥基苯乙醇)。苯乙酸和苯乙醇用于合成苯乙酰輔酶A,而苯乙酰輔酶A是合成乙酰輔酶A的重要代謝物,且乙酰輔酶A合成量下降會促進糖酵解或者糖異生過程,使機體ATP含量增加[26]。ATP能在胞內(nèi)傳輸化學能進行新陳代謝,為奶牛產(chǎn)奶過程提供能量,在本試驗中,與Lca組奶牛相比,Hca組奶牛由于苯丙氨酸代謝途徑中下游代謝產(chǎn)物苯乙酰甘氨酸、苯乙酸及對羥基苯乙醇含量下調(diào)導致生成的ATP增加,從而造成奶牛的產(chǎn)奶量增加。除了提供能源外,基本代謝途徑之一的糖酵解的部分中間產(chǎn)物能用于其他物質(zhì)的合成,以關聯(lián)碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝[27]。例如,丙酮酸可轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼岷鸵阴]o酶A,而乙酰輔酶A是合成脂肪酸的原料,這對奶牛的泌乳維持也非常重要[28]。

色氨酸代謝與碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)的合成、脂肪代謝等途徑關系密切。在吲哚胺-2,3-雙加氧酶或色氨酸-2,3-雙加氧酶的催化下,色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿虬彼?KYN),通過多級酶促反應后,生成喹啉酸、吡啶羧酸類及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)等[29]。Viljoen等[30]研究表明,色氨酸經(jīng)氧化生成煙酸,其不僅是合成NAD和NADP的前體,也是參與機體的氧化還原反應無氧脫氫酶的輔酶,進而參與機體能量代謝、糖脂代謝、氧化應激和炎癥調(diào)控[31-32]。有研究表明,色氨酸合成煙酸的速度加快,體內(nèi)糖原含量減少,使腺苷酸環(huán)化酶活性增加,導致為機體提供的ATP增加。與低產(chǎn)奶牛相比,高產(chǎn)奶牛色氨酸代謝途徑中血漿代謝物濃度上調(diào),致使為奶牛泌乳提供的能量增加,造成蛋白質(zhì)合成速度加快,產(chǎn)奶量增加。L-色氨酸在多種微生物參與下,經(jīng)過脫氨和脫羧作用生成吲哚、吲哚乙酸及吲哚丙酮酸等[33]。與低產(chǎn)組相比,高產(chǎn)奶牛血漿中吲哚-3-甲醇和吲哚-3-乙酰胺含量上調(diào),經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),在該代謝通路中,吲哚-3-甲醇和吲哚-3-乙酰胺可以用于合成乙酰輔酶A,而乙酰輔酶A可以參與TCA及脂肪酸的合成,增加了奶牛泌乳所需的能量,導致產(chǎn)奶量上升[34-35]。這說明奶牛色氨酸代謝途徑中血漿代謝物濃度上調(diào)會使產(chǎn)奶量增加,苯丙氨酸代謝與色氨酸均為含有苯環(huán)的氨基酸,本研究發(fā)現(xiàn),二者在奶牛體內(nèi)均參與乙酰輔酶A的合成,乙酰輔酶A作為體內(nèi)高能化合物,可以作為脂肪酸合成原料,也可以作為脂肪酸合成過程中ATP的來源,對于促進乳脂合成和泌乳能量提供發(fā)揮重要作用,苯丙氨酸代謝與色氨酸互作及協(xié)同代謝對于高產(chǎn)奶牛產(chǎn)奶的調(diào)控作用需要深入研究。

Tryptophan metabolism:色氨酸代謝;Primary bile acid biosynthesis:初級膽汁酸生物合成;Phenylalanine metabolism:苯丙氨酸代謝;mTOR signaling pathway:哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路;Mineral absorption:礦物質(zhì)吸收;Lysosome:溶酶體;Choline metabolism in cancer:癌癥中的膽堿代謝;Central carbon metabolism in cancer:癌癥的中樞碳代謝;Bile secretion:膽汁分泌;Antifolate resistance:葉酸拮抗劑抗性。圖中每個圖形為一個KEGG通路,縱坐標為KEGG通路,橫坐標為富集因子,大小表示數(shù)量多少,顏色越紅P/Q值越小。Each graph in the figure is a KEGG pathway, the ordinate is the KEGG pathway, the abscissa is the enrichment factor, the size indicates the number, and the more red the color, the smaller the P/Q value.

3.3 葉酸拮抗劑抗性對產(chǎn)奶量的影響

在機體中,一碳單位參與蛋白質(zhì)、核苷酸、泛酸的合成及分子的甲基化,而葉酸是介導一碳單位的輔助因子[36],在NADPH參與下,葉酸被其還原酶還原成四氫葉酸(THFA或FH4),參與機體合成嘌呤及嘧啶,進而參與DNA合成[37]。而葉酸拮抗劑是一類抗代謝類抗癌藥物[38],在惡性、微生物、寄生蟲和慢性炎癥性疾病的藥物治療中發(fā)揮了關鍵作用,其與葉酸結構相似,并能抑制葉酸代謝中的關鍵酶,導致嘌呤和胸腺嘧啶的生物合成中斷,抑制DNA復制和細胞死亡。葉酸是DNA合成的重要物質(zhì),而腫瘤細胞的快速增殖需要以更多DNA為原料,所以,腫瘤細胞增殖可以被葉酸拮抗劑有效抑制[39]。本研究中,與Lca組奶牛相比,Hca組奶牛葉酸拮抗劑抗性增強,有效抑制了炎癥等疾病的DNA復制和腫瘤細胞的增殖,使更多能量用于奶牛泌乳,這可能是增加奶牛泌乳能力的一個因素。

4 結 論

① 通過對高產(chǎn)與低產(chǎn)奶牛血漿代謝組特征的研究表明,高產(chǎn)與低產(chǎn)奶牛血漿中共篩選出27個差異代謝物,與Lca組相比,Hca組奶牛血漿中?;撬?、膽酸、豬膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、脫氧膽酸、L-亮氨酸、吲哚-3-甲醇、吲哚-3-乙酰胺等18個代謝物含量顯著增加,而苯乙酰甘氨酸、苯乙酸及、對羥基苯乙醇等9個代謝物含量顯著下降。

② 代謝通路富集分析表明,與Lca組相比,Hca組奶牛膽汁分泌、色氨酸代謝、初級膽汁酸生物合成顯著增強,而苯丙氨酸代謝、葉酸拮抗劑抗性相對減弱。

③ 研究結果為通過飼糧營養(yǎng)成分調(diào)控奶牛產(chǎn)奶潛力發(fā)揮提供了理論依據(jù),苯丙氨酸、色氨酸以及葉酸等營養(yǎng)物質(zhì)具有一定研究潛力,膽汁酸分泌調(diào)控對于奶牛產(chǎn)奶性能發(fā)揮也具有一定理論研究價值。

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