徐天樂 朱 浩 劉 潤 梁 艷 曹海南 楊章平,*

(1.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院(國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室)，揚(yáng)州 225000;2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225000)

乳腺炎、子宮炎和蹄葉炎是影響奶牛生產(chǎn)的3種常見疾病[1]。其中，乳腺炎直接影響奶牛的產(chǎn)奶能力和牛奶品質(zhì)，是人們一直關(guān)注的焦點(diǎn)[2]。乳腺炎一般是由細(xì)菌感染引起，根據(jù)細(xì)菌病原體的不同，將乳腺炎分為2種類型，即傳染性乳腺炎和環(huán)境性乳腺炎，這2種類型的乳腺炎分別由金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染引起[3-4]。由大腸桿菌引起的奶牛臨床乳腺炎給世界各地的奶牛場(chǎng)造成了重大的奶產(chǎn)量損失和動(dòng)物福利問題。脂多糖是大腸桿菌等革蘭氏陰性桿菌的細(xì)胞壁成分[5]。大量研究表明，革蘭氏陰性菌釋放的脂多糖可以誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激[6]。氧化應(yīng)激和炎癥可以互相誘導(dǎo)激活，機(jī)體失衡產(chǎn)生的氧化應(yīng)激不僅會(huì)損傷蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物大分子，還會(huì)激活產(chǎn)生炎癥的轉(zhuǎn)錄因子，加重炎癥反應(yīng)[7-8]。初步研究表明，脂多糖通過與Toll樣受體(TLR)4結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而TLR4的激活參與了一系列TLR信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的產(chǎn)生[9]。

在奶牛的日常管理過程中，抗生素常作為治療乳腺炎的藥物，但如果大劑量使用抗生素會(huì)造成奶牛體內(nèi)有很多殘留，導(dǎo)致經(jīng)奶牛乳房擠下來的牛奶中通常會(huì)含有抗生素[10]。國內(nèi)飼料“禁抗令”全面施行之前，抗生素還作為飼料添加劑，用來預(yù)防疾病并促進(jìn)乳畜生長，但這容易危害生態(tài)安全以及影響乳品質(zhì)量，牛奶中殘留的抗生素還會(huì)進(jìn)入環(huán)境中造成污染，飲用殘留有抗生素的牛奶會(huì)引起人體過敏反應(yīng)，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)以及免疫能力下降[11]。2020年，我國要求飼料端全面“無抗”，天然植物因其安全有效的優(yōu)勢(shì)成為了替代抗生素研究與應(yīng)用的熱點(diǎn)[12]。植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)畜禽具有促生長、抑菌、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)控及調(diào)節(jié)腸道菌群等作用，是理想的抗生素替代品[13]。許多植物提取物，如植物精油也已經(jīng)被證明可以緩解奶牛乳腺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，起到保護(hù)乳腺的作用[14]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶多酚的主要組成部分，具有抑菌、抗炎和抗氧化等功能[15-16]。EGCG在家禽生產(chǎn)中應(yīng)用較多，是一種良好的飼料添加劑，可以改善雞蛋品質(zhì)，提高雞蛋的抗氧化能力以及提高肉雞的生產(chǎn)性能[17-18]。Xue等[19]研究表明，在肉仔雞飼糧中添加600 mg/kg EGCG，能夠顯著提高肉仔雞的體重、平均日增重和平均日采食量。但關(guān)于EGCG對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥的影響少見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)利用大腸桿菌建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及氧化損傷模型，通過添加EGCG，分析EGCG對(duì)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞(pbMEC)的修復(fù)作用和調(diào)節(jié)機(jī)制，為EGCG在改善奶牛健康方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用pbMEC由揚(yáng)州大學(xué)奶牛遺傳資源與健康創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供；EGCG購買于Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶和胎牛血清購買于Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購買于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；BeyoClickTM5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、免疫熒光染色試劑盒、CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒和抗體購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FuturePAGETM蛋白預(yù)制膠、快速轉(zhuǎn)移緩沖液和MOPS-SDS電泳緩沖液購買于南京艾思易生物科技有限公司；倒置熒光顯微鏡(DMi8)購買于德國徠卡公司，酶標(biāo)儀(SPARK)購買于瑞士Tecan公司，蛋白印跡成像系統(tǒng)(FluorChem Q)購買于美國Protein Simple公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(QuantStudio3)購買于美國賽默飛公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

試驗(yàn)采用傳代2～5代的細(xì)胞，每24 h更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶消化；然后1 000×g離心3 min，棄上清液，將細(xì)胞接種在6孔板和96孔板上。

1.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定

在pbMEC中加入不同濃度的EGCG[0(對(duì)照)、20、40、60、80和100 μmol/mL]培養(yǎng)12 h，每孔加入含10 μL CCK-8試劑的100 μL RPMI 1640培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量每孔的吸光度(OD)值。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室研究成果，選用1×107CFU大腸桿菌構(gòu)建乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型。將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為3個(gè)組，分別為對(duì)照組、大腸桿菌處理組(1×107CFU大腸桿菌處理細(xì)胞6 h)和EGCG+大腸桿菌處理組(先用60 μg/mL EGCG處理細(xì)胞24 h，再用1×107CFU大腸桿菌處理細(xì)胞6 h)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)

按照1.2.3步驟處理細(xì)胞，在6孔板中加入1 mL工作液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，隨后加入多聚甲醛室溫固定15 min；添加1 mL通透液通透15 min，每孔加入0.5 mL的Click反應(yīng)液，避光孵育30 min后洗滌細(xì)胞；每孔加入1 mL Hoechst 33342反應(yīng)液，避光孵育10 min；最后用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.5 MDA生成量檢測(cè)

按照1.2.3步驟處理細(xì)胞后，加0.5 mL提取液并混勻，取樣0.1 mL于離心管中，水浴40 min，冷卻并離心，96孔板中每孔加入250 μL反應(yīng)液，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在530 nm處的OD值。

1.2.6 活性氧(ROS)含量檢測(cè)

按照1.2.3步驟處理細(xì)胞后，按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋2′,7′-二氫二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min；洗滌細(xì)胞3次，用倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.7 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照1.2.3步驟處理細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA。采用2步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行檢測(cè)。引物序列如表1所示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.8 蛋白免疫印跡檢測(cè)

將細(xì)胞接種到6孔板并按照1.2.3步驟處理細(xì)胞，用裂解液提取細(xì)胞蛋白，并使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度；將各組的細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到相同水平后，使用預(yù)制膠進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；用牛血清白蛋白(BSA)封閉膜，隨后與一抗[TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、p65、磷酸化p65(p-p65)和GAPDH]孵育，在4 ℃下過夜，用TBST洗膜5～6次，每次5 min；然后用二抗搖動(dòng)孵育2 h，并再用TBST洗滌5～6次，每次5 min；最后用蛋白印跡成像系統(tǒng)檢測(cè)條紋。

1.2.9 免疫熒光檢測(cè)

將細(xì)胞接種到6孔板并按照1.2.3步驟處理細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，通透液處理10 min；加入封閉液并處理60 min，然后每孔加入一抗，4 ℃過夜孵育；用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗，避光孵育2 h，用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，每孔500 μL；室溫避光孵育并清洗，最后使用倒置熒光顯微鏡避光拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對(duì)pbMEC活力的影響

如圖1所示，用不同濃度EGCG處理pbMEC 12 h后，在80和100 μmol/mL EGCG處理下，pbMEC活力與對(duì)照組相比顯著下降(P<0.05)；而在20、40和60 μmol/mL EGCG處理下，pbMEC活力與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。因此，選用60 μmol/mL EGCG進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)記不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Data columns marked with different letters indicated significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 EGCG對(duì)大腸桿菌處理的pbMEC增殖的影響

采用EdU試劑盒并通過熒光顯微鏡觀察pbMEC增殖情況，如圖2所示，大腸桿菌處理組細(xì)胞增殖數(shù)量明顯少于對(duì)照組；EGCG+大腸桿菌處理組細(xì)胞增殖數(shù)量明顯多于大腸桿菌處理組。結(jié)果表明，EGCG對(duì)大腸桿菌抑制的細(xì)胞增殖有一定的保護(hù)作用。

2.3 EGCG對(duì)大腸桿菌處理的pbMEC MDA生成量的影響

EGCG對(duì)大腸桿菌處理的pbMEC MDA生成量的影響如圖3所示，與對(duì)照組相比，大腸桿菌處理組細(xì)胞MDA生成量顯著提高(P<0.05)；與大腸桿菌處理組相比，EGCG+大腸桿菌處理組細(xì)胞MDA生成量顯著降低(P<0.05)。

圖2 EGCG對(duì)大腸桿菌處理的pbMEC增殖的影響

2.4 EGCG對(duì)大腸桿菌處理的pbMEC ROS含量的影響

EGCG對(duì)大腸桿菌處理的pbMEC ROS含量的影響如圖4所示，與對(duì)照組相比，大腸桿菌處理組熒光強(qiáng)度(ROS含量)明顯增強(qiáng)；與大腸桿菌處理組相比，EGCG+大腸桿菌處理組熒光強(qiáng)度明顯降低。

2.5 EGCG對(duì)大腸桿菌處理的pbMEC炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

EGCG對(duì)大腸桿菌處理的pbMEC炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響如圖5所示，與對(duì)照組相比，大腸桿菌處理組細(xì)胞IL-1β、TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；與大腸桿菌處理處理組相比，EGCG+大腸桿菌處理組細(xì)胞IL-1β、TNF-α、iNOS和TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

2.6 EGCG對(duì)大腸桿菌處理的pbMEC NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

EGCG對(duì)大腸桿菌處理的pbMEC NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響如圖6所示，與對(duì)照組相比，大腸桿菌處理組細(xì)胞TLR4、p-p65和MyD88蛋白表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；與大腸桿菌處理處理組相比，EGCG+大腸桿菌處理組細(xì)胞TLR4、p-p65和MyD88蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

圖3 EGCG對(duì)大腸桿菌處理的

圖4 EGCG對(duì)大腸桿菌處理的

2.7 p-p65在pbMEC胞質(zhì)和胞核中的表達(dá)

通過免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)p-p65在pbMEC胞質(zhì)和胞核中的表達(dá)，如圖7所示，與對(duì)照組相比，大腸桿菌處理組細(xì)胞p-p65熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；與大腸桿菌處理處理組相比，EGCG+大腸桿菌處理組細(xì)胞p-p65熒光強(qiáng)度明顯降低。

圖5 EGCG對(duì)大腸桿菌處理的pbMEC炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

E. coli：大腸桿菌 Escherichia coli；EGCG：表沒食子兒茶素沒食子酸酯 epigallocatechin gallate；TLR4：Toll樣受體4 Toll-like receptor 4；MyD88：髓樣分化因子88 myeloid differentiation factor 88；p-p65：磷酸化p65 phospho-p65；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase。

圖7 p-p65在pbMEC胞質(zhì)和胞核中的表達(dá)

3 討 論

本研究通過EdU細(xì)胞增殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入適宜濃度的EGCG后，受到大腸桿菌侵襲的pbMEC的增殖比例明顯提高。相關(guān)研究表明，大腸桿菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，其細(xì)胞壁特有的脂多糖已被證明可誘導(dǎo)pbMEC的炎癥和氧化應(yīng)激[20]。隨著對(duì)植物提取物研究的深入，越來越多的活性物質(zhì)被用于探索抗氧化、抗炎和抗腫瘤等活性功能[21-22]，而EGCG作為茶多酚中最主要的活性物質(zhì)，已經(jīng)被證明具有抗炎和抗氧化功能。郭子玉等[23]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠通過與大腸桿菌結(jié)合，抑制大腸桿菌膜孔蛋白的功能，最終導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞死亡。據(jù)此推測(cè)，EGCG對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)型奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎性損傷具有一定的抑制作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入適宜濃度的EGCG可顯著降低大腸桿菌處理的pbMEC中TNF-α和IL-1βmRNA的表達(dá)。TNF-α是一種涉及到系統(tǒng)性炎癥的細(xì)胞因子，與大腸桿菌誘導(dǎo)型乳腺炎脂多糖休克有著密不可分的關(guān)系[24]。IL-1β是一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，參與多種自身免疫性炎癥反應(yīng)和多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡[25-26]。因此，加入適宜濃度的EGCG可以降低大腸桿菌誘導(dǎo)型奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎性損傷，緩解細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

從上述結(jié)果可以看出，EGCG對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的pbMEC炎癥有積極的作用，但研究表明，有效的抗炎癥治療策略不僅需要減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而且還需要減少炎癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[27]。在炎癥刺激后，細(xì)胞產(chǎn)生過多的ROS和活性氮(RNS)，它們共同作用導(dǎo)致細(xì)胞損傷[28]。在細(xì)胞中，iNOS催化產(chǎn)生一氧化氮(NO)[29-30]。IL-1β被報(bào)道對(duì)iNOS的激活至關(guān)重要，隨著iNOS表達(dá)水平的升高，細(xì)胞內(nèi)NO含量增加，產(chǎn)生毒性物質(zhì)，引起亞硝化應(yīng)激；同時(shí)，NO水平降低對(duì)細(xì)胞有利，可預(yù)防脂多糖產(chǎn)生的負(fù)面作用，減輕炎癥反應(yīng)[31-32]。ROS的主要來源是細(xì)胞的線粒體呼吸鏈，線粒體受外界刺激后，產(chǎn)生過量ROS并且會(huì)對(duì)線粒體造成損傷，可能引發(fā)線粒體自噬[33]。RNS和ROS分子都是活性氧化還原自由基，可以互作形成額外的分子，如過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)，對(duì)細(xì)胞造成損傷。iNOS表達(dá)水平升高，局部劇增的NO易于被ROS氧化為RNS。RNS也被證明通過蛋白質(zhì)S-亞硝基化來調(diào)節(jié)參與ROS穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵酶的活性[34-35]。MDA是脂質(zhì)過氧化物終產(chǎn)物之一，其含量高低可以作為考察細(xì)胞受到損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一[36]。而在本試驗(yàn)中，大腸桿菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)能顯著提高pbMEC中iNOSmRNA相對(duì)表達(dá)量、ROS含量和MDA生成量，而添加適宜濃度EGCG則可以緩解這種作用，這與上述研究結(jié)果基本一致。

此外，本試驗(yàn)中受到大腸桿菌侵襲的pbMEC中TLR4的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量顯著提高，而添加EGCG后，這一現(xiàn)象有所緩解。TLR4是一種跨膜蛋白，可以直接識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖，并且能夠激活與適應(yīng)性免疫有關(guān)的基因，其已被證明不僅是抵御病原體入侵的第一道防線，也是識(shí)別NF-κB信號(hào)通路上游配體的重要受體[37-38]。在細(xì)菌入侵期間，pbMEC通過增加TNF-α和IL-1β等促炎細(xì)胞因子分泌來觸發(fā)炎癥和免疫反應(yīng)，這些細(xì)胞因子的激活需要TLR4對(duì)刺激的識(shí)別[39]。研究表明，當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時(shí)，NF-κB信號(hào)通路被激活，被激活的NF-κB信號(hào)可以通過磷酸化激活細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，產(chǎn)生不同的生理反應(yīng)[40]。MyD88是TLR信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭分子，在傳遞上游信息具有重要的作用[41]；而p65則是NF-κB家族成員之一，由NF-κB經(jīng)典通路激活[42]。為了進(jìn)一步探明EGCG抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生是否與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，本試驗(yàn)還檢測(cè)了p-p65、MyD88和p65這3個(gè)蛋白表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受到大腸桿菌侵襲的pbMEC中p-p65和MyD88蛋白表達(dá)量較高，在添加適宜濃度的EGCG后，p-p65和MyD88蛋白表達(dá)量顯著降低。以上研究結(jié)果表明，適宜濃度的EGCG可以降低大腸桿菌誘導(dǎo)的TLR4活性升高，降低p65的磷酸化水平，并進(jìn)一步抑制IL-1β和TNF-α等炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮抗炎作用，保護(hù)機(jī)體免受炎癥損傷。

4 結(jié) 論

EGCG能夠抑制大腸桿菌誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥因子以及NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，對(duì)乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激具有一定的緩解作用。