閆樂艷 邵春榮 李 悅 閆俊書 奚雨萌

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，農(nóng)村農(nóng)業(yè)部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014)

肉鵝是我國重要的經(jīng)濟(jì)水禽。據(jù)國家水禽產(chǎn)業(yè)體系2020年底統(tǒng)計(jì)，我國肉鵝年出欄量近6億只，占全世界養(yǎng)鵝總量的90%。長期以來，使用抗生素是促進(jìn)肉鵝生長、維持腸道健康及避免炎癥反應(yīng)的最有效手段之一[1]。但隨著飼料禁抗、養(yǎng)殖減抗等政策的逐步落實(shí)[2]，肉鵝養(yǎng)殖業(yè)因“替抗”儲備技術(shù)不足，導(dǎo)致疫病防控難度增加、生長性能下降等，嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展，亟待開發(fā)有效的“替抗”養(yǎng)殖新技術(shù)。

釀酒酵母培養(yǎng)物(yeast culture, YC)是利用特定發(fā)酵工藝，將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞經(jīng)過充分厭氧發(fā)酵得到的發(fā)酵產(chǎn)品，主要由酵母細(xì)胞代謝產(chǎn)物、發(fā)酵后的營養(yǎng)物質(zhì)及滅活酵母細(xì)胞所構(gòu)成[3]。YC的有效成分為酵母細(xì)胞壁多糖(α-D-甘露聚糖、幾丁質(zhì)、β-D-葡聚糖、甘露寡糖等)，消化酶(植酸酶等)，可消化小肽，B族維生素(維生素B1、維生素B2、維生素B5、維生素B6等)，有機(jī)酸，未知生長因子等[4]。農(nóng)業(yè)部2013年將YC、釀酒酵母提取物和釀酒酵母細(xì)胞壁從《飼料添加劑品種目錄》轉(zhuǎn)入《飼料原料目錄》，可見其在畜禽養(yǎng)殖過程中具有較高的安全性和有效性。研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母產(chǎn)品在抑制腸道病原菌增殖[5]、提高飼料原料消化利用率、減少腸道溫室氣體排放[6]等方面具有明顯效果。梁秀麗等[7]對比了基礎(chǔ)飼糧(對照)、抗生素飼糧、酵母培養(yǎng)物對肉雞生長及抗病性能的影響，發(fā)現(xiàn)酵母培養(yǎng)物組肉雞平均日增重、平均日采食量較對照組均有提高，料重比降低，且發(fā)病率和死淘率降低，應(yīng)用效果良好。熊子標(biāo)[8]發(fā)現(xiàn)，飼糧添加2%酵母培養(yǎng)物可提高四川白鵝生長性能、抗氧化能力、機(jī)體免疫力和對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，改善肉品質(zhì)嫩度、促進(jìn)消化器官生長和腸道發(fā)育。

研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路是后生元制劑調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要途徑之一[9]。酵母細(xì)胞壁多糖等多種后生元類物質(zhì)可被多個(gè)細(xì)胞表面受體家族，如Toll樣受體家族(Toll like reporters, TLRs)，直接或間接識別，并通過調(diào)節(jié)NF-κB抑制蛋白(NF-κB inhibitor of kappa B, IκB)磷酸化影響下游炎癥因子表達(dá)[10]。YC被認(rèn)為是當(dāng)前最安全有效的后生元制劑之一，但當(dāng)前針對YC的研究大都集中在養(yǎng)殖應(yīng)用效果評價(jià)，其腸道功能保護(hù)、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的機(jī)制鮮有報(bào)道。為此，本試驗(yàn)在建立原代鵝腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，分析探討YC對內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的鵝腸上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，為深入研究YC的腸上皮調(diào)節(jié)功能提供支持。

1 材料與方法

1.1 YC溶液配制

本試驗(yàn)所用YC為淺橙色粗粉(干物質(zhì)≥94.0%)，含24.0%粗蛋白質(zhì)、3.2%粗脂肪、11.0%粗纖維、6.4%粗灰分。該產(chǎn)品使用釀啤酒用谷物及甜菜粕作為發(fā)酵底物，滅活啤酒酵母含量約占40%。參照魏方[11]的方法配制YC溶液：稱取0.6 g YC粗粉放入30 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中，渦旋將其充分混合并在搖床上室溫溫浴1 h，使大部分粉末溶解,然后1 000×g離心10 min除去剩余固體，收集上清液，得到20 g/L YC溶液備用。

1.2 鵝腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系建立

1.2.1 鵝腸上皮細(xì)胞分離

取25～26胚齡鵝蛋(購自安徽天之驕鵝業(yè)有限公司)，75%酒精噴灑外殼，晾干后，取出完整小腸，置于37 ℃含1%青鏈霉素(V900929，Sigma，美國)的PBS中，隨后小心剝離腸系膜，沖洗腸腔內(nèi)容物，將小腸組織剪成<1 mm3碎塊，使用含1%青鏈霉素的PBS反復(fù)漂洗3～5次，至上清液澄清，170×g離心4 min，棄上清，制成組織沉淀。制備含300 U/mL膠原酶Ⅺ(C7657，Sigma，美國)和0.1 mg/mL中性蛋白酶Ⅰ(D4818，Sigma，美國)的37 ℃混合酶溶液，加入組織沉淀中，混勻，37 ℃消化30～40 min后，170×g離心10 min棄上清，即獲得鵝腸上皮細(xì)胞沉淀。

1.2.2 鵝腸上皮細(xì)胞純化

根據(jù)上皮細(xì)胞較成纖維細(xì)胞貼壁慢的特點(diǎn)，選用“相差貼壁法”使2類細(xì)胞分離以達(dá)到純化目的。首先，將分離得到的細(xì)胞沉淀，然后用含有1%青鏈霉素、5%胎牛血清(10099-141，Gibco，美國)、10 ng/mL表皮生長因子(EGF，E4127，Sigma，美國)的DMEM/F12培養(yǎng)基(L310KJ，上海源培生物科技股份有限公司)吹勻，隨后將懸液接種至第1個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min。隨后，輕輕吸取全部培養(yǎng)液(含未貼壁上皮細(xì)胞)，接種到第2個(gè)用鼠尾膠原蛋白(C8062，Solarbio，北京)包被過的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，即獲得純化的鵝腸上皮細(xì)胞。

1.2.3 鵝腸上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定

微絨毛是腸上皮細(xì)胞特有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，可被用于腸上皮細(xì)胞鑒定。本試驗(yàn)中，使用細(xì)胞刮刀將純化后貼壁生長的單層腸上皮細(xì)胞輕輕刮下，置于2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定，過夜。用0.1 mol/L的二甲砷酸鈉緩沖液清洗3次，后固定用1%鋨酸固定2 h，再用緩沖液漂洗20 min，后經(jīng)脫水、置換、浸透、包埋聚合，形成包埋塊。再對包埋塊進(jìn)行修塊、半薄切片定位，保證樣品表面積小于0.2 mm×0.2 mm。用超薄切片機(jī)將包埋塊切成50 nm的超薄切片，將超薄切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上。醋酸鈾染液室溫染色30 min，蒸餾水清洗，檸檬酸鉛室溫染色8 min，清洗，晾干，觀察、拍片、記錄。試驗(yàn)委托武漢谷歌生物科技有限公司進(jìn)行透射電鏡觀察。此外，試驗(yàn)通過對細(xì)胞核進(jìn)行蘇木素染色觀察腸上皮細(xì)胞形態(tài)。具體操作如下：將純化后的細(xì)胞接種在6孔板內(nèi)的細(xì)胞爬片(801008，Nest，無錫)上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，洗去培養(yǎng)基，95%乙醇固定20 min，PBS洗滌2次，蘇木素染液(G1080，Solarbio，北京)染核2～3 min，自來水洗滌，光學(xué)顯微鏡鏡下觀察，拍片，記錄。

1.3 建立LPS誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞炎性損傷模型

利用LPS處理鵝腸上皮細(xì)胞，建立腸上皮細(xì)胞炎性損傷模型。具體操作如下：首先，臺盼藍(lán)染色后，使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(IC1000，Countstar，上海)完成計(jì)數(shù)；接著，按照每孔0.5×104～1.0×104個(gè)細(xì)胞將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；最后，待細(xì)胞生長至80%時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入配制的含有終濃度分別為0(對照組)、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0 μg/mL的LPS培養(yǎng)液，每組6個(gè)平行。37 ℃培養(yǎng)24 h后，加入10 μL的CCK8試劑(K1018，APE×BIO，美國)，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2～4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，測定細(xì)胞活性。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測定白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、Toll樣受體2A(TLR2A)、Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、NF-κB基因相對表達(dá)量。具體操作如下：使用終濃度分別為0(對照)、0.5、1.0、5.0和10.0 μg/mL的LPS培養(yǎng)液處理細(xì)胞后，按照TRIZOL試劑盒(R401，Vazyme，南京)操作提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列見表1。RT-qPCR 20 μL體系如下：qPCR Master Mix(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板cDNA 2 μL；無菌雙蒸水7.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。試驗(yàn)以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.4 YC預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的鵝腸上皮細(xì)胞活性及炎性因子、NF-κB通路基因表達(dá)的影響

試驗(yàn)分組設(shè)置為：對照組、LPS組和LPS+低濃度YC(100 mg/L)組(LYC組)、LPS+中濃度YC(300 mg/L)組(MYC組)和LPS+高濃度YC(500 mg/L)組(HYC組)。其中，對照組用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞24 h；LPS組用含有1 μg/mL LPS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；LPS+低、中、高濃度YC組先分別用YC濃度為100、300和500 mg/L的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃孵育細(xì)胞3 h后，棄去培養(yǎng)基，再加入終濃度為1 μg/mL LPS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞處理后，按照1.3方法測定細(xì)胞活性。同時(shí)，提取各組腸上皮細(xì)胞的總RNA，按照1.3方法測定IL-1β、IL-8、TNF-α及NF-κB基因相對表達(dá)量。

1.5 YC預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的鵝腸上皮細(xì)胞氧化損傷的影響

按1.3所述方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將鵝腸上皮細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔板內(nèi)的細(xì)胞爬片(801008，Nest，無錫)上，藥物處理后，利用熒光探針2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)進(jìn)行活性氧(ROS)含量檢測(S0033，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，熒光顯微鏡觀察。同時(shí)，將鵝腸上皮細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，藥物處理后，用0.05%胰蛋白酶(2530062，Gibco，美國)消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸浮液，170×g離心10 min，棄上清后加入PBS配制細(xì)胞懸液，細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量。采用WST-1法測定SOD活性，TBA法測定MDA含量，鉬酸銨法測定CAT活性，微板法測定NO含量，具體測定方法參照南京建成生物工程研究所提供的說明書。

1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

使用GraphPad Prism 7.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖，基于單因素方差分析(one-way ANOVA)評估比較平均值，采用Tukey法進(jìn)行組間多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代鵝腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系建立

本試驗(yàn)成功建立鵝腸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，用混合酶消化法分離得到鵝腸上皮細(xì)胞(圖1-A)。用相差貼壁法分離純化腸上皮細(xì)胞(圖1-B)，細(xì)胞核染色后觀察結(jié)果(圖1-C、圖1-D)顯示，上皮細(xì)胞自隱窩細(xì)胞團(tuán)長出，細(xì)胞呈卵圓形或多角形，單層貼壁生長，邊緣清晰緊密相連。此外，試驗(yàn)選用投射電鏡觀察純化后細(xì)胞標(biāo)志性的微絨毛結(jié)構(gòu)(圖1-E)，說明獲得的細(xì)胞為腸上皮細(xì)胞，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 LPS誘導(dǎo)鵝腸上皮細(xì)胞炎性損傷模型建立

本試驗(yàn)通過分析細(xì)胞活性改變及炎癥反應(yīng)發(fā)生，建立LPS誘導(dǎo)的鵝腸上皮細(xì)胞炎性損傷模型。由圖2可知，不同濃度的LPS處理對鵝腸上皮細(xì)胞活性無顯著影響(P>0.05)。由圖3可知，在細(xì)胞促炎因子表達(dá)方面，與對照組相比，1.0 μg/mL LPS處理顯著上調(diào)腸上皮細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-8基因相對表達(dá)量(P<0.05)；在NF-κB炎癥信號通路相關(guān)基因表達(dá)方面，與對照組相比，1.0 μg/mL LPS處理顯著或極顯著上調(diào)腸上皮細(xì)胞TLR2A(P<0.01)、TLR4(P<0.01)、MyD88(P<0.05)和NF-κB(P<0.01)基因相對表達(dá)量。因此，后續(xù)試驗(yàn)選用終濃度為1.0 μg/mL LPS處理鵝腸上皮細(xì)胞，建立炎性損傷模型。

A：消化后的腸隱窩細(xì)胞團(tuán)；B：培養(yǎng)24 h的腸上皮細(xì)胞；C和D：蘇木素染核觀察腸上皮細(xì)胞形態(tài)；E：投射電鏡觀察腸上皮細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)。A: intestinal crypts cell mass after digestion; B: intestinal epithelial cells after cultured 24 h; C and D: the morphology of intestinal epithelial cells with nuclear staining with hematoxylin; E: the microvilli structure of intestinal epithelial cells observed by transmission electron microscope.

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05), and with different capital letters mean significant difference (P<0.01), while with no letter or the same letters mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.3 YC預(yù)處理對鵝腸上皮細(xì)胞活性的影響

試驗(yàn)使用濃度為0(對照)、100、200、300、400和500 mg/L的YC溶液處理鵝腸上皮細(xì)胞，評價(jià)YC對鵝腸上皮細(xì)胞活性的影響。由圖4可知，與對照組相比，當(dāng)YC濃度為300 mg/L時(shí)，細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)。后續(xù)試驗(yàn)選取100 mg/L作為YC的低濃度處理，300 mg/L作為YC的中濃度處理，500 mg/L作為YC的高濃度處理。

TLR2A: Toll樣受體2A Toll-like receptor 2A; TLR4: Toll樣受體4 Toll-like receptor 4; MyD88: 髓樣分化因子88 myeloid differentia 88; NF-κB: 核轉(zhuǎn)錄因子-κB nuclear factor-κB; IL-1β: 白細(xì)胞介素-1β interleukin-1β; TNF-α: 腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α; IL-8:白細(xì)胞介素-8 interleukin-8。圖6同 the same as Fig.6。

圖4 YC濃度對鵝腸上皮細(xì)胞細(xì)胞活性的影響

2.4 YC預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的鵝腸上皮細(xì)胞氧化損傷的影響

由圖5-A可知，在鵝腸上皮細(xì)胞中，與對照組相比，LPS增加細(xì)胞ROS產(chǎn)生；而YC可發(fā)揮減少腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的功能，與LPS組相比，不同濃度YC預(yù)處理不同程度地減少細(xì)胞ROS生成。通過測定氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)(圖5-B)，在鵝腸上皮細(xì)胞中，與對照組相比，LPS顯著降低細(xì)胞SOD和CAT活性(P<0.05)，顯著提高M(jìn)DA和NO含量(P<0.05)。與LPS組相比，LYC組對細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)無顯著影響(P>0.05)；MYC組顯著提高細(xì)胞SOD活性(P<0.05)，顯著降低MDA和NO含量(P<0.05)；HYC組顯著降低了細(xì)胞NO含量(P<0.05)。

2.5 YC預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的鵝腸上皮細(xì)胞炎性因子、NF-κB通路基因表達(dá)的影響

由圖6可知，在細(xì)胞促炎因子表達(dá)方面，與對照組相比，LPS組極顯著上調(diào)腸上皮細(xì)胞TNF-α和IL-1β基因相對表達(dá)量(P<0.01)，但MYC組TNF-α基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，HYC組IL-1β基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。在NF-κB信號通路基因表達(dá)方面，與對照組相比，LPS組顯著或極顯著上調(diào)腸上皮細(xì)胞TLR2A(P<0.01)、TLR4(P<0.05)、MyD88(P<0.01)和NF-κB(P<0.01)基因相對表達(dá)量；與對照組相比，LYC組對LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)無顯著影響(P>0.05)，MYC組細(xì)胞TLR2A(P<0.01)和TLR4(P<0.05)基因相對表達(dá)量顯著或極顯著下調(diào)，HYC組TLR2A(P<0.01)、TLR4(P<0.05)和NF-κB(P<0.01)基因相對表達(dá)量顯著或極顯著下調(diào)。

3 討 論

腸上皮細(xì)胞是機(jī)體更新速度最快的一類細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)和功能完整性對動(dòng)物健康具有重要作用。體外培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞可進(jìn)一步了解和模擬腸道生物學(xué)功能。目前，國內(nèi)外關(guān)于分離、培養(yǎng)鵝腸上皮細(xì)胞的研究很少。李融[12]利用組織塊種植法得到的鵝腸上皮細(xì)胞生長狀況良好，細(xì)胞活性較強(qiáng)，經(jīng)過純化，得到了純度較高的鵝腸上皮細(xì)胞。付晶等[13]通過酶消化法成功分離并培養(yǎng)原代鵝腸上皮細(xì)胞，可獲得大量的健全腸絨毛隱窩單位。

以上2種方法相比，組織塊培養(yǎng)法得到的上皮細(xì)胞純度更高，但酶消化法可以得到更多、更健全的隱窩單位?？紤]到腸道炎癥反應(yīng)、免疫激活、應(yīng)激等發(fā)生與隱窩功能密切相關(guān)，利用腸隱窩單位培養(yǎng)單層腸樣結(jié)構(gòu)具有腸上皮的關(guān)鍵特性，更有助于解析腸上皮整體功能的改變[14]。因此，本試驗(yàn)聯(lián)合使用濃度為300 U/mL的膠原酶(Ⅺ型)和0.1 mg/mL的中性蛋白酶(Ⅰ型)消化收獲大量健全腸隱窩單位，并培養(yǎng)成單層上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)用于后續(xù)試驗(yàn)。

A：腸上皮細(xì)胞ROS生成；B：抗氧化相關(guān)指標(biāo)。*: P<0.05。A: ROS synthesis of goose intestinal epithelial cells; B: antioxidant related indicators. *: P<0.05.

圖6 YC預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的鵝腸上皮細(xì)胞炎性因子及NF-κB信號通路基因表達(dá)的影響

本研究通過LPS建立體外鵝小腸炎性損傷模型。作為病原相關(guān)分子模式(PAMPs)的代表物質(zhì)，LPS可導(dǎo)致免疫激活和組織損傷，是建立腸上皮細(xì)胞炎性損傷模型的重要工具[15]。聚集的LPS于胞外形成LPS-LBP-sCD14三聯(lián)復(fù)合物，繼而作用于膜上TLRs并激活胞內(nèi)MyD88/NF-κB信號級聯(lián)反應(yīng)[16-17]。TLR2/4可招募活化胞漿內(nèi)的接頭蛋白MyD88，活化的MyD88通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)使IκB磷酸化而降解，抑制解除后的NF-κB轉(zhuǎn)位入核，啟動(dòng)靶基因(IL-1β、TNF-α等)轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致炎癥發(fā)生與擴(kuò)大[16-17]。在本試驗(yàn)中，LPS處理并沒有導(dǎo)致鵝原代腸上皮細(xì)胞凋亡，但1 μg/mL LPS處理可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，激活NF-κB信號通路，上調(diào)IL-1β、TNF-α等炎性因子基因表達(dá)，這與很多研究的結(jié)果[18]相一致。

YC的有效成分主要是釀酒酵母細(xì)胞的胞外代謝產(chǎn)物，飼喂YC對哺乳期犢牛[19]、斷奶仔豬[20]、蛋雞[21]等的生長性能、腸道健康和機(jī)體免疫均有促進(jìn)作用，特別是可以增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫力，降低非潔凈環(huán)境下的動(dòng)物死亡率[21]。研究表明，YC中的酵母多糖通過與TLRs、補(bǔ)體受體3等細(xì)胞受體結(jié)合，啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答，具有免疫調(diào)節(jié)功能[22]。比如，可溶性β-葡聚糖可通過補(bǔ)體受體3激活抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體系統(tǒng)降低炎性反應(yīng)，改善宿主的防御機(jī)制[23]。本試驗(yàn)中，使用YC預(yù)處理LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞后，基于NF-κB通路傳導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)受到抑制，炎性因子基因表達(dá)下調(diào)。值得注意的是，YC對腸道免疫的調(diào)控是復(fù)雜的，存在維持調(diào)節(jié)免疫平衡的功能。一方面，酵母培養(yǎng)物中的甘露聚糖和β-葡聚糖可激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫應(yīng)答，并以單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞為主要靶細(xì)胞[24]；另一方面，YC中豐富的生長因子、小肽、寡糖、維生素等物質(zhì)可為細(xì)胞正常生長提供營養(yǎng)、維持上皮完整性、緩解炎性損傷、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)等，達(dá)到保護(hù)腸上皮功能的作用[25]。由此發(fā)現(xiàn)，YC對腸上皮的保護(hù)是系統(tǒng)性的、多種途徑并存的，并且YC對不同類型細(xì)胞的作用機(jī)制存在差異。

YC還可發(fā)揮抗氧化功能，緩解應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷。據(jù)報(bào)道，酵母多糖可提高機(jī)體SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，提高清除或抑制氧自由基的能力，避免細(xì)胞氧化損傷[26]。ROS是體內(nèi)最關(guān)鍵的活性氧自由基之一；而NO對自由基損傷作用起放大效應(yīng)，也是引起氧化應(yīng)激損傷的主要自由基。SOD、GSH-Px、CAT等組成的抗氧化系統(tǒng)可通過消除腸道上皮細(xì)胞內(nèi)的ROS來降低炎癥因子和信號因子基因表達(dá)，對腸道上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用[27]。其中，SOD活性可間接反映機(jī)體清除自由基能力，可將超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，使細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷；MDA含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化物的生成速率和強(qiáng)度，也反映出機(jī)體組織氧化損傷的程度；CAT與SOD共同組成生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng)，在清除超氧自由基、過氧化氫和過氧化物及阻止或減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮重要作用[28]。已有研究證實(shí)，肉雞飼糧中添加酵母細(xì)胞壁可提高21和42日齡空腸SOD活性和42日齡空腸GSH-Px活性[29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS顯著提高了鵝腸上皮細(xì)胞ROS生成，SOD活性下降，MDA含量升高，細(xì)胞出現(xiàn)明顯氧化損傷；而使用YC預(yù)處理后，鵝腸上皮細(xì)胞ROS生成減少，SOD活性上調(diào)，MDA和NO含量降低，表明YC對LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞氧化損傷存在保護(hù)作用，可幫助細(xì)胞有效清除活性氧類物質(zhì)，這可能是因?yàn)閅C中還有的酵母多糖能直接作用于自由基(如羥基自由基)，通過促進(jìn)自由基進(jìn)一步氧化為過氧自由基，而分解成對機(jī)體無害的產(chǎn)物，達(dá)到抗氧化作用[30]。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，YC不僅可通過調(diào)節(jié)鵝腸上皮免疫平衡，維持LPS誘導(dǎo)下的細(xì)胞正常功能，還可提高清除或抑制氧自由基的能力，緩解腸上皮細(xì)胞的炎性損傷和氧化應(yīng)激。