張曉敏 徐夢圓 李西川 蘇延軍

肺癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，根據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，2020年全球肺癌發(fā)病率為14%，死亡率為18%[1]。肺癌按照組織病理學類型可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細胞肺癌（non‐small cell lung cancer, NSCLC），其中SCLC約占肺癌總發(fā)病率的15%[2,3]。目前，組織活檢是臨床上腫瘤患者確診的主要手段之一；但因其具有創(chuàng)傷性，可能導致患者出現(xiàn)氣胸、出血等并發(fā)癥而限制了其應(yīng)用[4]。此外，約25%的肺癌活檢因獲得的組織樣本過少而影響患者確診與病情評估，因此探索一種新的檢測技術(shù)對于臨床檢測是很有必要的。液體活檢是指從以血液為主的體液中獲得可用于檢測分析生物標記物來獲得組織相關(guān)信息的一種實驗技術(shù)[5]。液體活檢在腫瘤診斷等方面具有巨大的潛力，檢測對象主要包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）、循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumors cells, CTCs）及外泌體等。本文將對液體活檢在SCLC的早期篩查診斷、病情監(jiān)測及預后評判等方面的應(yīng)用進展進行綜述。

1 SCLC的概述

SCLC是一種惡性程度極高的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，臨床上將其分為局限期（limited disease‐SCLC, LD‐SCLC）和廣泛期（extensive disease‐SCLC, ED‐SCLC）[6]。SCLC患者的平均2年總生存率低于10%，其中LD‐SCLC患者的中位生存期（median survival time, MST）為15個月‐20個月，ED‐SCLC患者的MST為8個月‐13個月，且超過2/3的SCLC患者確診時已屬于ED‐SCLC[7‐9]。SCLC對于以鉑類藥物為基礎(chǔ)的初次化療較敏感，但病情易復發(fā)且復發(fā)后易對原化療藥產(chǎn)生獲得性耐藥[10]，預后極差。

SCLC細胞的形態(tài)學特征為卵圓形或梭形細胞、胞質(zhì)少、細胞邊界不清以及核仁不明顯但核質(zhì)明顯等。腫瘤呈高增殖、高凋亡、高壞死，組織中Ki‐67的陽性染色率為50%‐100%[10]。目前對于SCLC患者極少進行手術(shù)，治療手段主要是以化療、放療和免疫治療相結(jié)合為主[11]。臨床確診的檢測手段以經(jīng)皮肺穿刺或氣管鏡取樣后的病理檢測為主，實際應(yīng)用中具有較多限制；而液體活檢在SCLC的臨床診斷中逐漸獲得了人們的重視。

2 液體活檢的主要檢測對象

2.1 ctDNA 無細胞DNA（cell‐free DNA, cfDNA）是指細胞經(jīng)過衰老、凋亡、壞死和胞外分泌等方式釋放到血液和其他液體中的細胞外DNA分子；來源于腫瘤細胞的cfDNA被稱為ctDNA。ctDNA大小為90個‐150個堿基，主要存在于血液循環(huán)系統(tǒng)中[12,13]，主要來源包括死亡的腫瘤細胞、CTCs、外泌體等。ctDNA可能攜帶有特異性改變的DNA片段，這些改變包括體細胞點突變、雜合性丟失、基因融合、基因拷貝數(shù)變異和DNA甲基化等[11]。

ctDNA在總cfDNA中的含量極低，對于檢測點突變、拷貝數(shù)畸變（copy‐number aberration, CNA）、小片段插入或缺失是一種挑戰(zhàn)[14]，因此對其檢測技術(shù)有較高的要求。目前ctDNA的分析方法主要有以突變阻滯擴增系統(tǒng)

PCR（amplification refractory mutation system PCR, ARMS‐PCR）技術(shù)為代表的定量PCR、以微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）為代表的數(shù)字PCR、基于下一代測序（next‐generation sequencing, NGS）的高通量技術(shù)[11,14,15]。BEAMing（bead, emulsion, amplification, magnetic）技術(shù)和ddPCR技術(shù)可以檢測特定的已知突變，與腫瘤組織獲得的結(jié)果高度一致；通過NGS對CNA或點突變進行全基因組分析可以獲得更完整的全基因組表征以及患者的特異性基因分型，以此評估腫瘤的異質(zhì)性及跟蹤治療過程中的基因改變。

2.2 CTCs CTCs是始于原發(fā)或轉(zhuǎn)移部位，進入循環(huán)系統(tǒng)后隨之擴散到遠處的腫瘤細胞。CTCs的半衰期較短，存在上皮細胞和間充質(zhì)細胞標記物的雜交表型能夠逃脫免疫細胞的“追蹤”，有利于存活，能夠隨著血液循環(huán)系統(tǒng)到達遠處[11]。CTCs在有核細胞中占有量極少，血液中只含有0.000,000,1%的CTCs，在外周血所有有核細胞（1個/mL‐10個/mL）中只占0.001%左右[16]。

臨床上對CTCs的檢測主要包括分離、富集、再分析等過程，由于CTCs在血液中含量過低，無法通過常規(guī)外周血涂片的方法進行識別檢測，因此富集在CTCs分析過程中十分重要。CTCs富集的物理方法包括：按尺寸過濾、使用介電性質(zhì)或通過Ficoll密度梯度離心、通過免疫標志物陽性進行富集、使用抗體標記的微柱進行富集等，近幾年來，使用白細胞共同抗原（leukocyte common antigen, LCA）CD45抗體耗盡白細胞進行富集是一種新興的技術(shù)，此技術(shù)更加有利于從全血中分離、分析CTCs[17]。目前，CELLSEARCH?是唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準并認可的檢測CTCs的標準技術(shù)，該技術(shù)使用免疫磁性捕獲細胞表面表達的上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM），該系統(tǒng)中定義CTCs為有核的DAPI陽性、細胞角蛋白（cytokeratin, CK）陽性、CD45陰性細胞[16]。此外，檢測CTCs的方法還有流式細胞檢測術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、CTC芯片技術(shù)及膜濾過分離腫瘤技術(shù)（isolation by size of epithelial tumor cell, ISET）等[15]。

2.3 外泌體 外泌體是具有脂質(zhì)雙層膜的小細胞外囊泡，直徑30 nm‐100 nm，存在于包括血液、腦脊液、尿液在內(nèi)的生物流體中[18]，外泌體中存在蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和多種RNA（microRNA、mRNA、lnRNA、circRNA）分子，能夠通過自分泌、旁分泌或內(nèi)分泌途徑在細胞與微環(huán)境之間傳遞信息[19]，參與血管生成、細胞增殖和遷移、炎癥反應(yīng)、免疫抑制、腫瘤免疫逃逸等過程[15]，并促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

外泌體的提取方法主要有超濾離心法、磁珠免疫法、密度梯度離心法、PEG‐base沉淀法、色譜法等，其鑒定方法包括流式細胞術(shù)、實時熒光定量PCR、免疫膠體金標記技術(shù)和測序等[15]。

3 液體活檢在SCLC的早期篩查診斷、病情監(jiān)控及預后評估中的應(yīng)用

3.1 液體活檢在SCLC早期篩查診斷中的應(yīng)用 SCLC易發(fā)生早期擴散，因此SCLC的早期篩查對于其治療尤為重要。Fernandez‐Cuesta等[20]研究了使用cfDNA樣本檢測SCLC患者TP53突變的可能性，研究結(jié)果顯示，在49%具有不同腫瘤分期的SCLC患者的ctDNA中存在TP53突變；更重要的是按病程階段對51例SCLC病例進行分組后，在35.7%的早期SCLC患者ctDNA中檢測到了TP53突變。Nong等[21]分析了22例SCLC患者在治療前和治療中不同時間點的cfDNA樣本，結(jié)果顯示，基線檢測時91%和67%的患者中分別存在TP53、RB1突變；對8例患者的血液及組織樣本進行分析后，顯示兩者突變的一致性為94%，表明cfDNA測序是檢測SCLC患者體細胞突變的敏感工具。以上研究提示對SCLC患者體內(nèi)的ctDNA中TP53進行檢測可作為早期篩查的手段之一。

Naito等[22]在對35例SCLC患者進行檢測時發(fā)現(xiàn)，32%的SCLC患者在治療前每7.5 mL血液中存在CTCs的數(shù)量>2個，此陽性率明顯高于其他腫瘤。許多研究表明LD‐SCLC與ED‐SCLC患者之間CTCs數(shù)量存在差異。Hiltermann等[23]的研究結(jié)果顯示LD‐SCLC患者中檢測到的CTCs水平要低于ED‐SCLC患者；Aggarwal等[24]同樣證明了ED‐SCLC患者的CTCs水平要高于LD‐SCLC患者。此外，Carter等[25]分析了SCLC患者血液CTCs中的CNA，并據(jù)此將SCLC患者分為化療敏感型和化療難治型。以上研究證明了對SCLC患者體內(nèi)的CTCs進行檢測可作為早期篩查和治療方案選擇的依據(jù)之一。

外泌體在癌癥患者中的水平通常高于健康者[26]，疾病會促進外泌體的循環(huán)，其膜組成分及對分子載體的表征是生物標志物的重要來源[18]。Sandfeld‐Paulsen等[27]在應(yīng)用細胞外囊泡陣列對外泌體進行表征后，發(fā)現(xiàn)SCLC血漿中CD151標志物的數(shù)量顯著上調(diào)。Pedersen等[28]利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對24例健康者和24例SCLC患者外泌體與囊泡中獲得的蛋白質(zhì)進行定量與統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在健康者與SCLC患者中存在幾種差異表達的蛋白，這一差異表明外泌體中可能包含具有SCLC潛在診斷標志物的特定蛋白質(zhì)。由此可見，對于外泌體的分析有助于SCLC患者的早期篩查和診斷。

3.2 液體活檢在監(jiān)控SCLC病情變化中的應(yīng)用 在SCLC的臨床治療中，患者的基因組處于動態(tài)變化之中，不同患者對于使用藥物及放化療的反應(yīng)也不相同[29]。目前臨床上一般通過血清標志物、影像學和支氣管鏡檢查等技術(shù)對患者的疾病進展情況進行監(jiān)測[30]；但存在準確率低、檢測范圍小且費用昂貴等問題。另外，臨床上支氣管鏡取樣本后進行的傳統(tǒng)組織活檢獲得的是腫瘤的局部照片，單個活檢樣本無法捕捉到腫瘤完整的基因組圖譜。因此，這兩類檢測技術(shù)對于監(jiān)控病情的變化均具有一定的局限性；而液體活檢可以在患者治療過程中獲取患者體內(nèi)腫瘤在分子水平上發(fā)生的動態(tài)變化。

Du等[31]對24例SCLC患者的cf DNA及對應(yīng)基因組DNA進行靶向測序，觀察到SCLC患者中存在著廣泛的體細胞拷貝數(shù)改變和突變，基因突變指數(shù)與無進展生存期（progression‐free survival, PFS）、總生存期（overall survival, OS）顯著相關(guān)，該研究證明了基于cfDNA的液體活檢對于SCLC患者的臨床反應(yīng)監(jiān)測具有潛在作用。隨后的一項研究[32]表明，基于cfDNA的全基因組拷貝數(shù)是監(jiān)測患者病情變化的有效方法，并且靶向cfDNA測序可識別50%以上SCLC患者的潛在治療靶點。

Poroyko等[33]對SCLC和NSCLC患者血清外泌體中的miRNA進行測序，確定了17種miRNA在SCLC患者與NSCLC患者中差異表達；與NSCLC患者相比，接受化療后的SCLC患者外泌體中的miRNA變化更加明顯，證明外泌體miRNA可作為標志物顯示SCLC患者對治療的反應(yīng)。

有多項研究[22‐24]認為CTCs的計數(shù)變化與化療反應(yīng)基本無相關(guān)性，但在Ju等[34]的研究中，對14例SCLC患者化療前后分別進行CTCs計數(shù)，確定CTCs計數(shù)的變化與治療反應(yīng)相關(guān)。CTCs計數(shù)變化是否能夠準確反映SCLC患者治療過程中病情的進展尚不確定，仍需要進一步研究。

3.3 液體活檢在預測SCLC患者預后中的應(yīng)用 SCLC患者治療后復發(fā)率高是臨床上難以攻克的問題，而有效預測患者的預后效果能夠更好地保證患者的后續(xù)治療。Thomas等[35]描述了1例BCRA1突變的SCLC患者，在II期實驗中對該患者使用Olaparib和Durvalumab聯(lián)合治療，聯(lián)合用藥后患者病情得到很大緩解，患者ctDNA中的BCRA1基因突變頻率也明顯下降，此研究暗示可利用檢測SCLC患者ctDNA中某一基因的突變頻率來預測預后效果。Zhang等[36]對14例SCLC患者血漿ctDNA中變異等位基因頻率（variant allele frequency, VAF）的變化水平和趨勢進行評估，結(jié)果顯示，血漿ctDNA中VAF的變化趨勢可作為生物標志物評估化療對SCLC患者和晚期SCLC患者的療效，且ctDNA分析揭示的患者疾病進展情況比影像學報告更早。

多名研究者[23,37]證明ED‐SCLC的CTCs計數(shù)高于LD‐SCLC患者的CTCs計數(shù)，SCLC患者化療后的CTCs計數(shù)是預測OS的最強預測因素，CTCs較高的患者生存期大多數(shù)低于初始CTCs數(shù)量低的患者。Naito等[22]對51例SCLC患者的不同病程階段（包括基線、化療后、復發(fā)階段）抽取血液樣本，使用CellSearch System對采集的血液樣本進行分層分析，最終結(jié)果顯示，SCLC患者中CTCs的維持在較高的水平，CTCs水平越高，患者生存率越差。總體而言，以上研究表明液體活檢將在SCLC患者的預后管理中成為關(guān)鍵因素。

3.4 液體活檢在SCLC其他方面的作用 隨著研究的進一步深入，液體活檢在其他方面的應(yīng)用也逐漸得到重視。CTCs的單細胞測序可以提供SCLC突變圖譜的相關(guān)信息。Ni等[38]研究證明CNA對CTCs的單細胞測序具有鑒別SCLC與肺腺癌的潛力。Li等[39]通過利用血小板靶向慢病毒轉(zhuǎn)基因法使血小板能夠特異性表達腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體（tumor necrosis factor‐related apoptosis‐inducing ligand, TせIL），與CTCs進行靶向結(jié)合，能夠減緩CTCs的轉(zhuǎn)移。另有研究者[40]通過基因組學和轉(zhuǎn)錄組學表征CTCs的分子圖譜，研究腫瘤的異質(zhì)性，構(gòu)建CTCs的異種移植模型，為探索腫瘤對化療藥物耐藥性的機制提供補充信息，有望用于為SCLC患者提供個性化治療。

外泌體是人體轉(zhuǎn)運RNA的內(nèi)源性系統(tǒng)，已被證實具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功能，可以作為腫瘤和感染的無細胞疫苗，也具有成為治療性RNA遞送系統(tǒng)的潛在可能[41]。Mao等[42]首次證明了外泌體miR‐141/KIF12途徑在SCLC血管生成中的作用，為SCLC患者的治療提供了新的潛在靶點。Dou等[43]的研究證明抗程序性死亡配體‐1（programmed death ligand‐1, PD‐L1）阻斷抗體顯著逆轉(zhuǎn)了外泌體介導的CD8+T細胞活化的抑制，該結(jié)果表明，含有PD‐L1的外泌體可以增強T細胞介導的針對SCLC的免疫治療。

4 小結(jié)與展望

液體活檢在實時性、準確性、無創(chuàng)性等方面具有極大的優(yōu)勢。液體活檢的無創(chuàng)性有望縮短SCLC患者的治療恢復期，通過ctDNA、CTCs以及外泌體等檢測手段獲取組織活檢無法獲得的動態(tài)信息，能夠?qū)崟r監(jiān)測患者治療后的病情變化以及預測患者的預后狀態(tài)，同時也可能在SCLC靶點追蹤、疫苗研制等方面發(fā)揮重要作用。

另外，需要指出的是，目前液體活檢在SCLC的臨床應(yīng)用中仍然具有一定的局限性。一方面，雖然ctDNA的靈敏性高、可靠性強，但是CTCs、外泌體在患者體內(nèi)含量較少，這對檢測中的富集技術(shù)和靈敏度提出了很高的要求；另一方面，為了達到靈敏度、準確度方面的要求，檢測成本會隨之升高，可能影響其在臨床的廣泛應(yīng)用。除此之外，CTCs在化療敏感性以及治療反應(yīng)方面仍需要進一步研究證實。臨床上仍不能將液體活檢獲得的結(jié)果作為唯一的參照，而是應(yīng)當將液體活檢數(shù)據(jù)與組織活檢、影像學檢測及其他檢測技術(shù)結(jié)合起來用于SCLC患者的臨床治療。