陳琳 陳新璐 劉璐 趙燕喬 左偉 尹崇高 李洪利

肺癌是目前全世界最多見的癌癥死亡原因之一，其發(fā)病率每年呈上升趨勢(shì)，是對(duì)全世界公眾健康安全的嚴(yán)重挑戰(zhàn)[1]。肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是目前最為多見的肺癌病理類型[2]，其易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率較差。隨著診斷、外科、放射、分子治療等方面的不斷進(jìn)步，LUAD患者的臨床治療效果已經(jīng)得到顯著改善，但LUAD患者的早期診斷率不高，且在治療過程中常易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率仍處于較低水平[3,4]。因此，探究肺腺癌在人體如何發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、尋求新的能夠抑制肺腺癌增殖和侵襲的分子靶點(diǎn)格外重要。

微小RNA（microRNAs, miRNAs）是一類非編碼蛋白質(zhì)的，總體長(zhǎng)約為23個(gè)核苷酸的小核糖核酸分子，其通過與互補(bǔ)的靶mRNA結(jié)合，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和個(gè)體發(fā)育中起著核心作用，能夠調(diào)控mRNA的翻譯抑制或降解[5,6]。前期研究[7,8]顯示，miR‐30b‐3p在許多不同類型的癌癥中均起到了關(guān)鍵作用。然而，miR‐30b‐3p與肺腺癌增殖和侵襲之間的關(guān)系仍未見詳細(xì)報(bào)道。

本研究旨在探討miR‐30b‐3p在肺腺癌增殖和侵襲中的作用和分子機(jī)制，以期為臨床抑制肺腺癌的增殖和侵襲提供新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與材料 人正常肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS‐2B與肺腺癌細(xì)胞A549、H1299均從ATCC獲取，BEAS‐2B細(xì)胞使用含有100 μL/mL FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞使用含有100 μL/mL FBS的RPMI‐1640培養(yǎng)基，放于37oC、含5%CO2的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中。Transwell小室購(gòu)自Corning公司。Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。COX6B1（1:1,000）、β‐actin（1:1,000）抗體均購(gòu)自Abcam公司。

1.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè) 使用NCBI生物數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找在肺腺癌和正常肺組織中具有表達(dá)差異的miRNA。使用StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）分析miRNA在肺腺癌中的表達(dá)及其對(duì)肺腺癌患者預(yù)后生存的影響。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)方式均按照ATCC提供的培養(yǎng)條件進(jìn)行。將A549細(xì)胞分組：①Con組：轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR‐30b‐3p質(zhì)粒的對(duì)照質(zhì)粒；②Over‐miR‐30b‐3p組：轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR‐30b‐3p的質(zhì)粒；③NC組：轉(zhuǎn)染過表達(dá)COX6B1質(zhì)粒的對(duì)照質(zhì)粒；④Over‐COX6B1組：轉(zhuǎn)染過表達(dá)COX6B1的質(zhì)粒；⑤Over‐COX6B1+con組：同時(shí)轉(zhuǎn)入過表達(dá)COX6B1的質(zhì)粒和過表達(dá)miR‐30b‐3p質(zhì)粒的對(duì)照質(zhì)粒；⑥Over‐COX6B1+over‐miR‐30b‐3p組：同時(shí)轉(zhuǎn)入過表達(dá)COX6B1的質(zhì)粒和過表達(dá)miR‐30b‐3p的質(zhì)粒。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real‐time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT‐PCR） 細(xì)胞中的總R N A 提取及其逆轉(zhuǎn)錄具體過程可參照本課題組既往發(fā)表文獻(xiàn)[9]。使用U6作為內(nèi)參，使用2‐ΔΔCt分析的方法對(duì)miR‐30b‐3p的表達(dá)進(jìn)行分析。miR‐30b‐3p的上游引物為5’‐AGGTGTTCAGCTGAGTGTAGG‐3’，下游引物為5’‐CAGTGCAGGGTCCGAGGT‐3’，莖環(huán)結(jié)構(gòu)為5’‐GTCGTATCC AGTGC AGGGTCCG AGG TATTCGCACTGGATACGACCATCCT‐3’。qRT‐PCR設(shè)置條件為95oC、15 s，64oC、10 s，72oC、30 s，共反應(yīng)42個(gè)循環(huán)。

1.5 5‐乙炔基‐2’脫氧尿嘧啶核苷（5‐ethynyl‐2'‐deoxyuridine, EdU）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 在各分組細(xì)胞中加入稀釋好的1×EdU工作液，37oC培養(yǎng)箱孵育2 h后，用4%的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min，0.2%的Triton X‐100通透細(xì)胞膜30 min，用配置好的Click反應(yīng)液避光孵育30 min，使用Hochest染核。于正置熒光顯微鏡下隨機(jī)選取不同區(qū)域拍照并對(duì)其計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 提前12 h將基質(zhì)膠從‐20oC取出于4oC冰箱過夜，稀釋后取100 μL基質(zhì)膠均勻涂抹于上室表面，37oC放置1 h，使其聚合成凝膠。小室下部滴加500 μL含100 μL/mL FBS的RPMI‐1640培養(yǎng)基，小室中滴加含有4×104個(gè)細(xì)胞的無血清RPMI‐1640細(xì)胞懸液200 μL，37oC培養(yǎng)箱孵育24 h后，用細(xì)棉簽輕輕擦去小室內(nèi)部未穿膜的細(xì)胞，甲醇溶液固定細(xì)胞15 min，姬姆薩染液染色45 min。于顯微鏡下隨機(jī)選取不同區(qū)域拍照并對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)靶蛋白 利用miRWalk（http://mirwalk.umm.uni‐heidelberg.de/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）、miRTarbase（https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/）網(wǎng)站，對(duì)miR‐30b‐3p進(jìn)行靶蛋白預(yù)測(cè)，利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）、StarBase（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）、Kmplot（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background）網(wǎng)站對(duì)靶蛋白進(jìn)行分析。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建COX6B1的野生型質(zhì)粒pGL3‐COX6B1‐3’‐UTR‐WT和突變型質(zhì)粒pGL3‐COX6B1‐3’‐UTR‐MUT，將293T細(xì)胞接種于24孔板中，將miR‐30b‐3p的對(duì)照質(zhì)粒及過表達(dá)質(zhì)粒和COX6B1的野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，48 h后加入PLB裂解液裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)（Promega, Madison, USA）測(cè)定不同樣品熒光素酶活性。

1.9 Western blot實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用RIPA細(xì)胞裂解緩沖液分別提取總蛋白，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)不同組細(xì)胞的蛋白濃度進(jìn)行分析，加入5×上樣緩沖液，沸水煮15 min。上樣后，用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜置于5%脫脂奶粉中于室溫封閉1 h，后放入一抗中于4oC孵育8 h，然后在室溫下滴加二抗孵育1 h，曝光。使用Image J對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較使用F檢驗(yàn)。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在肺腺癌組織和細(xì)胞中低水平表達(dá)的miR‐30b‐3p與肺腺癌患者不良預(yù)后有關(guān) 通過對(duì)GSE19945數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，篩選出log2FC<‐1、P<0.05的miRNA，選擇其中差異表達(dá)顯著的miR‐30b進(jìn)行進(jìn)一步分析研究（圖1A）。StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，與20例正常肺組織相比，512例肺腺癌組織中miR‐30b‐3p的表達(dá)水平明顯下降（圖1B，P<0.05）。通過StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)查詢miR‐30b‐3p與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR‐30b‐3p高表達(dá)組相比，miR‐30b‐3p低表達(dá)組的生存率明顯降低（圖1C，P=0.005,8）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，miR‐30b‐3p在肺腺癌中或許起到了抑癌基因的作用，低表達(dá)的miR‐30b‐3p與肺腺癌患者不良預(yù)后有關(guān)。我們?yōu)榱俗C實(shí)這個(gè)結(jié)果，采用qRT‐PCR檢測(cè)了miR‐30b‐3p在肺支氣管上皮細(xì)胞和肺腺癌細(xì)胞的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)表明，與正常肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS‐2B相比，miR‐30b‐3p在肺腺癌細(xì)胞A549和H1299中的表達(dá)量顯著下調(diào)（圖1D，P<0.05）。因?yàn)閙iR‐30b‐3p在肺腺癌細(xì)胞A549中表達(dá)差異更為顯著，所以選擇肺腺癌細(xì)胞A549進(jìn)行接下來的研究。

2.2 miR‐30b‐3p抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力 qRT‐PCR實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒over‐miR‐30b‐3p后A549細(xì)胞中miR‐30b‐3p的表達(dá)量明顯上升（圖2A，P<0.05），表明過表達(dá)成功。通過EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響，與轉(zhuǎn)染對(duì)照組質(zhì)粒的A549細(xì)胞（Con/A549組）相比，轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒的A549細(xì)胞（Over‐miR‐30b‐3p/A549組）的EdU陽性率顯著下降（圖2B，P<0.05），這證實(shí)了過表達(dá)miR‐30b‐3p后，肺腺癌細(xì)胞的增殖能力出現(xiàn)顯著下調(diào)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，與Con/A549組相比，Over‐miR‐30b‐3p/A549組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯下降（圖2C，P<0.05），提示過表達(dá)miR‐30b‐3p可以抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲能力。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR‐30b‐3p可以抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力。

2.3 miR‐30b‐3p能夠與COX6B1靶向結(jié)合 利用靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站miRWalk、TargetScan、miRTarbase預(yù)測(cè)可與miR‐30b‐3p結(jié)合的靶蛋白，取交集得26個(gè)靶蛋白（圖3A）。利用StarBase網(wǎng)站和UALCAN網(wǎng)站對(duì)26個(gè)靶蛋白進(jìn)行分析，其中COX6B1在肺腺癌組織中高表達(dá)（圖3B，P<0.05），并且其表達(dá)和miR‐30b‐3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖3C，r=‐0.200，P<0.05）。利用Kmplot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢COX6B1與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示高表達(dá)水平的COX6B1與患者的不良預(yù)后有關(guān)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3D，P<0.05）。因此我們選取COX6B1進(jìn)行下一步研究。利用Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證COX6B1在肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS‐2B與肺腺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，與BEAS‐2B細(xì)胞相比，COX6B1在A549細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào)（圖3E，P<0.05）。設(shè)計(jì)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)擬證實(shí)miR‐30b‐3p與COX6B1之間是否能夠直接結(jié)合，結(jié)果顯示，COX6B1 mRNA的3’‐UTR區(qū)是miR‐30b‐3p的直接結(jié)合位點(diǎn)（圖3F，P<0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Con/A549組和Over‐miR‐30b‐3p/A549組中COX6B1的表達(dá)情況，可見與Con/A549組相比，Over‐miR‐30b‐3p/A549組中COX6B1的表達(dá)量大幅下降（圖3G，P<0.05），這表明在肺腺癌細(xì)胞A549中，miR‐30b‐3p可以負(fù)向調(diào)控COX6B1的表達(dá)。以上結(jié)果表明，COX6B1 mRNA的3’‐UTR區(qū)是miR‐30b‐3p的直接結(jié)合位點(diǎn)，且miR‐30b‐3p能夠負(fù)向調(diào)控COX6B1的表達(dá)。

圖 1 miR-30b-3p在肺腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)程度。A：火山圖顯示miR-30b在數(shù)據(jù)集GSE19945中的表達(dá)差異；B：miR-30b-3p在正常肺組織和肺腺癌組織中的表達(dá)情況；C：miR-30b-3p的生存曲線分析；D：qRT-PCR驗(yàn)證miR-30b-3p在BEAS-2B、A549和H1299細(xì)胞系中的表達(dá)情況（*P<0.05）。Fig 1 Expression of miR-30b-3p in lung adenocarcinoma tissues and cells and its association with patient prognosis. A: The volcano map of GSE19945; B: The expression of miR-30b-3p in normal lung tissues and lung adenocarcinoma tissues; C: The survival analysis of miR-30b-3p in lung adenocarcinoma patients; D: qRT-PCR analysis the expression of miR-30b-3p in BEAS-2B, A549 and H1299 cells (*P<0.05). qRT-PCR: real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction.

2.4 miR‐30b‐3p通過調(diào)控COX6B1抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖能力 為了證明miR‐30b‐3p和COX6B1存在調(diào)控關(guān)系，我們構(gòu)建了COX6B1的過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與NC/A549組相比，Over‐COX6B1/A549組中COX6B1的表達(dá)明顯升高（圖4A，P<0.05），表明過表達(dá)COX6B1成功。EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC/A549組相比，Over‐COX6B1/A549組的細(xì)胞增殖率顯著上升，而與Over‐COX6B1+con/A549組相比，Over‐COX6B1+over‐miR‐30b‐3p/A549組的細(xì)胞增殖率明顯下降（圖4B，P<0.05）。這表明上調(diào)COX6B1可以促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖能力，而過表達(dá)miR‐30b‐3p可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)COX6B1對(duì)細(xì)胞增殖能力的促進(jìn)作用。以上結(jié)果證實(shí)，miR‐30b‐3p可以通過負(fù)向調(diào)控COX6B1抑制肺腺癌細(xì)胞A549的增殖能力。

圖 2 miR-30b-3p抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。A：qRT-PCR驗(yàn)證過表達(dá)質(zhì)粒miR-30b-3p的轉(zhuǎn)染效率（*P<0.05）；B：EdU實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上調(diào)miR-30b-3p對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖能力的影響（×20）（*P<0.05）；C：Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上調(diào)miR-30b-3p對(duì)肺腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響（×20）（*P<0.05）。Fig 2 miR-30b-3p inhibited the proliferation and invasion of lung adenocarcinoma cells. A: qRT-PCR analysis detected the transfection efficiency of miR-30b-3p overexpressed plasmid (*P<0.05); B: EdU experiment detects the effect of up-regulation of miR-30b-3p on the proliferation ability of lung adenocarcinoma cells (×20), scale bar=100 μm (*P<0.05); C: Transwell experiment detects the effect of up-regulation of miR-30b-3p on the invasion ability of lung adenocarcinoma cells (×20), scale bar=50μm (*P<0.05). EdU: 5-ethynyl-2'-deoxyuridine.

2.5 miR‐30b‐3p通過調(diào)控COX6B1抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲能力 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR‐30b‐3p靶向結(jié)合COX6B1對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力造成的影響。與NC/A549組相比，Over‐COX6B1/A549組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而與Over‐COX6B1+con/A549組相比，Over‐COX6B1+over‐miR‐30b‐3p/A549組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖5，P<0.05），表明上調(diào)COX6B1可以促進(jìn)A549細(xì)胞的侵襲能力，而同時(shí)過表達(dá)miR‐30b‐3p可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)COX6B1對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用。以上結(jié)果提示，miR‐30b‐3p可以通過負(fù)向調(diào)控COX6B1抑制肺腺癌細(xì)胞A549的侵襲能力。

3 討論

肺癌是目前全世界最為常見的癌癥種類之一，它是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其中近年來肺腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)上升[10]。由于肺腺癌的早期診斷和治療的手段并不多見，探究肺癌進(jìn)展的潛在分子機(jī)制及其分子治療靶點(diǎn)顯得尤為重要[11]。因此，尋找肺腺癌分子發(fā)病機(jī)制中的特征性靶點(diǎn)是提高其早期診斷率和提升患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵所在。

miRNA是一類非編碼RNA，因其長(zhǎng)度短小而得名，通常有18個(gè)‐22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。既往研究[12,13]表明，大多數(shù)（至少60%）的蛋白編碼基因可以被miRNA調(diào)控。單個(gè)的miRNA可以同時(shí)靶向幾十個(gè)，甚至上百個(gè)基因。由于miRNA在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中的關(guān)鍵作用，其表達(dá)失調(diào)或功能異常常見于各種類型的疾病，包括心血管異常、自身免疫紊亂、阿爾茨海默病和各種類型的惡性腫瘤[14‐17]。近年來，有報(bào)道稱部分miRNA在肺癌中表達(dá)降低，與此相互印證的是，部分miRNA的降低也與肺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。例如，miR‐218通過靶向IL‐6/STAT3在肺癌中發(fā)揮抑癌作用[18]，miR‐192抑制肺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]等。既往報(bào)道[20,21]中，miR‐30b‐3p可以抑制卵巢癌以及肝癌的細(xì)胞增殖或侵襲，但miR‐30b‐3p在肺腺癌中發(fā)揮了怎樣的作用卻仍未可知。在本研究中，通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，miR‐30b‐3p在肺腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，并且低表達(dá)水平的miR‐30b‐3p與肺腺癌患者的不良預(yù)后存在一定相關(guān)性，這些都提示miR‐30b‐3p的異常表達(dá)可能和肺腺癌存在一定關(guān)聯(lián)，因此確定了miR‐30b‐3p作為研究對(duì)象。本研究通過qRT‐PCR分析證明，與正常肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS‐2B相比，miR‐30b‐3p在肺腺癌細(xì)胞系H1299和A549中的表達(dá)均大幅降低。此外，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，miR‐30b‐3p能夠下調(diào)肺腺癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力，在肺腺癌中起到了抑癌基因的作用。

圖 3 miR-30b-3p靶向結(jié)合COX6B1。A：基因預(yù)測(cè)維恩圖；B：COX6B1在正常肺組織和肺腺癌組織中的不同表達(dá)；C：miR-30b-3p和COX6B1的相關(guān)性分析；D：COX6B1的生存曲線分析；E：Western blot驗(yàn)證COX6B1在BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞中的表達(dá)情況（*P<0.05）；F：雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-30b-3p對(duì)COX6B1的靶向結(jié)合能力（*P<0.05）；G：Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過表達(dá)miR-30b-3p后COX6B1的表達(dá)情況（*P<0.05）。Fig 3 miR-30b-3p targeted COX6B1. A: The venn plot of predicted genes; B: The expression of COX6B1 in normal lung tissues and lung adenocarcinoma tissues; C: Co-Expression analysis for miR-30b-3p with COX6B1; D: The survival analysis of COX6B1; E: Western blot analysis showed the expression of COX6B1 in BEAS-2B cells and A549 cells (*P<0.05); F: Luciferase activity was used to detect the targeted binding ability of miR-30b-3p to COX6B1 (*P<0.05); G: Western blot to detect the expression of COX6B1 after overexpression of miR-30b-3p (*P<0.05).

COX6B1基因位于19q13號(hào)染色體上，是細(xì)胞色素C氧化酶的亞基之一，在多種組織和細(xì)胞系中都有表達(dá)，對(duì)于細(xì)胞呼吸鏈起著不可或缺的作用，并且參與了細(xì)胞的氧化磷酸化等過程[22]。有研究[23,24]表明，COX6B1在腎透明細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中都發(fā)揮了作用，然而COX6B1與肺腺癌是否存在關(guān)系尚未見報(bào)道。本文通過在線網(wǎng)站查詢發(fā)現(xiàn)，COX6B1在肺腺癌組織中表達(dá)大幅升高，并且其與患者的不良預(yù)后相關(guān)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，COX6B1是miR‐30b‐3p的靶點(diǎn)，miR‐30b‐3p可與COX6B1 mRNA的3’‐UTR結(jié)合。Western blot實(shí)驗(yàn)證明，COX6B1在肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且過表達(dá)miR‐30b‐3p可以抑制COX6B1在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證明，miR‐30b‐3p的過表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)上調(diào)COX6B1對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的促進(jìn)作用。以上研究表明，miR‐30b‐3p可以通過負(fù)向調(diào)控COX6B1抑制肺腺癌細(xì)胞A549的侵襲和增殖能力。本文通過研究miR‐30b‐3p與COX6B1的相互作用，為完善miR‐30b‐3p與肺腺癌的關(guān)系提供了理論參考，為肺腺癌治療提供了新的方向。

圖 4 miR-30b-3p靶向調(diào)控COX6B1抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖能力。A：Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證COX6B1的過表達(dá)情況（*P<0.05）；B：EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-30b-3p與COX6B1共轉(zhuǎn)染對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖能力的影響（×20）（*P<0.05）。Fig 4 miR-30b-3p inhibited the proliferation of lung adenocarcinoma cells by targeting COX6B1. A: Western blot analysis showed the expression of COX6B1 in different groups of cells (*P<0.05); B: EdU experiment detects the effect of miR-30b-3p and COX6B1 co-transfection on the proliferation ability of lung adenocarcinoma cells (×20), scale bar=100 μm (*P<0.05).

圖 5 miR-30 b-3p靶向調(diào)控COX6B1抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲能力（×20）（*P<0.05）F i g 5 m i R-3 0 b-3 p inhibited the invasion of lung adenocarcinoma cells by targeting COX6B1 （×20）, scale bar=50 μm (*P<0.05)

綜上所述，miR‐30b‐3p在肺腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)水平的miR‐30b‐3p與肺腺癌患者不良預(yù)后有關(guān)；miR‐30b‐3p可以通過負(fù)向調(diào)節(jié)COX6B1，從而抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。此外，miR‐30b‐3p調(diào)控COX6B1的分子機(jī)制尚不得而知，而如何將其與臨床相結(jié)合仍尚需進(jìn)一步探討，這也將成為我們接下來探索與研究的重點(diǎn)。

Author contributions

Chen L conceived and designed the study. Chen L, Chen XL and Zuo W performed the experiments. Liu L and Zhao YQ analyzed the data. Yin CG contributed analysis tools. Li HL provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.