李芳燕，夏曉雪，吳夢潔，洪家都，程龍軍

（浙江農林大學 林業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 311300）

低溫是限制植物生長和發(fā)育的主要逆境因子。較低的溫度會損傷植物細胞的膜結構，抑制酶活性，誘導活性氧產生，破壞代謝平衡等，引起植物生長受阻、早衰甚至死亡[1]。世界上只有三分之一的陸地面積溫度在冰點以上，卻有42%的陸地會經歷?20 ℃以下的低溫，因此低溫也是限制植物地理分布的重要因素[2]。為了應對低溫脅迫，植物在長期進化過程中逐漸形成了低溫適應機制，用來提高植物耐受低溫逆境的能力，降低低溫脅迫傷害。在代謝層面上，植物可以通過提高可溶性糖、游離脯氨酸等小分子滲透調節(jié)物，以及抗氧化酶過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等的活性來增加對低溫的耐受力[3]。分子層面上，低溫下植物細胞膜的流動性降低，膜蛋白的構象發(fā)生改變，進而使膜剛性增加，細胞膜的這些物理變化為膜上低溫受體對低溫的感受提供了基礎。植物細胞的受體感受低溫信號后，通過提高細胞質中的鈣離子(Ca2+)水平，并與Ca2+結合蛋白結合，作為二級信號激活抗寒相關轉錄因子，調控耐寒相關基因，實現低溫脅迫響應[4]。目前，低溫響應的分子調控途徑中，ICE1-CBF-COR途經被認為是植物響應耐寒脅迫的主要途徑[5]。低溫通過Ca2+信號引發(fā)蛋白激酶磷酸化脫落酸(ABA)信號調控途徑中的蛋白激酶OST1 (open stomata1，氣孔開放1)/SnRK2.1 (SNF1-related protein kinase 2.1，SNF1相關蛋白激酶2.1)，磷酸化的OST1與bHLH類轉錄因子ICE1結合并將其磷酸化，穩(wěn)定ICE1的活性，使其穩(wěn)定結合在CBF (C-repeat binding factor，C-重復結合因子)基因上，激活它們的表達。CBF轉錄因子會進一步啟動冷響應相關基因CORs (cold responsive，低溫響應)，如編碼滲透調節(jié)物質合成酶以及低溫保護蛋白COR、LT1 (low temperature 1，低溫1)和CIN (cold-induced，冷誘導)基因等，提高植物的低溫適應性[6?7]。除此之外，植物激素[8]和ROS (reactive oxygen species，活性氧)[9]也參與了植物低溫響應的調控。

植物細胞中，低溫的響應和調控主要發(fā)生在細胞質和細胞核中，但葉綠體在低溫響應中也發(fā)揮了重要作用。葉綠體不僅是低溫響應二級信號分子ROS產生的主要場所[10]，還參與水楊酸(SA)[11]、茉莉酸(JA)[12]、ABA[13]以及脯氨酸[14]等的生物合成。這些物質在植物低溫響應中都產生了積極效應。因此，參與葉綠體生物活性的相關基因在低溫逆境響應中也發(fā)揮了重要的功能。近年來，研究者發(fā)現葉綠體產生的ROS等信號分子可以通過逆行性信號傳遞途徑進入細胞核來調控核基因的表達，以實現植物對環(huán)境的適應[15]。但葉綠體參與低溫脅迫響應的具體分子機制大多不清楚。隨著人們對植物逆境生物學研究重視程度的提高，越來越多參與植物非生物逆境響應的基因被挖掘出來，這些基因中有些響應特異逆境，也有些能夠響應多種逆境，表明植物響應逆境的分子機制非常復雜的。盡管已經確定了相當數量逆境響應基因的功能，但仍有很多功能未知的基因響應非生物逆境脅迫[16]。

桉Eucalyptus樹是世界上生長最快的木本植物之一，作為重要的用材樹種廣受歡迎，但大部分桉樹對低溫的耐受程度比較差。以桉樹為材料研究它們的耐低溫分子機制，深入挖掘低溫脅迫響應相關的基因資源，對桉樹的栽培和育種都有促進作用[17]。EgrCIN1 (cold induced 1)是一個隨低溫處理時間延長表達不斷增強的基因。亞細胞定位表明其表達的蛋白定位在巨桉Eucalyptus grandis葉綠體中。本研究通過對該基因及其編碼蛋白序列特征的分析和在擬南芥Arabidopsis thaliana中異源過表達后轉基因株系對低溫的響應等實驗，分析該基因響應低溫脅迫的功能。

1 材料與方法

1.1 植物材料

巨桉為保存于浙江農林大學苗圃的G5扦插無性系材料。擬南芥野生型為哥倫比亞生態(tài)型，生長于浙江農林大學智能實驗樓擬南芥生長室，生長條件為25 ℃ 16 h光照/22 ℃ 8 h黑暗，相對濕度為65%，光照強度為 100 μmol·m?2·s?1。

1.2 EgrCIN1基因、編碼蛋白序列及啟動子順式作用元件分析

根據EgrCIN1的編號 (Eucgr.B02882)在 phytozome (https：//phytozome-next.jgi.doe.gov)中獲取其基因、蛋白序列。使用ProtParam (http：//web.expasy.Org/protparam/)分析EgrCIN1蛋白的相對分子量、理論等電點；使用PSIPRED (http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/?disopred=1)在線預測其二級結構；使用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜結構預測；利用Plant-mPLoc (http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對EgrCIN1在細胞中的表達位置進行預測；同時截取EgrCIN1基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的序列作為其啟動子，使用在線分析網站Plant Care (http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析EgrCIN1基因啟動子上的順式作用元件。

1.3 定量分析實驗設置

1.3.1 4 ℃低溫不同處理時間下的表達分析 取6個月苗齡的巨桉G5無性系幼苗，于低溫生長箱(Snijder，荷蘭)中進行0.5、2.0、6.0、12.0、24.0、48.0 h的4 ℃低溫處理。8 h光照/16 h黑暗，相對濕度為 60%，光照強度為 150 μmol·m?2·s?1。同時分別以正常溫度 (白天 26 ℃，晚上 22 ℃，濕度、光照與處理相同)條件下生長的G5無性系幼苗為對照(ck)。3株幼苗為1個處理組，設置3次重復。處理結束后，取葉片置于液氮速凍。

1.3.2 組織特異性分析 分別取6個月苗齡的巨桉G5無性系幼苗根、莖、嫩葉(頂端新生葉片)以及成熟葉片各100 mg，置于液氮速凍，待測。

1.3.3 干旱、高鹽、ABA、茉莉酸甲酯(MeJA)處理下的表達分析 選取長勢一致、6個月苗齡的巨桉G5無性系幼苗，分別進行干旱、高鹽、ABA、MeJA等4種脅迫處理。干旱、高鹽處理：干旱組不澆水即可；高鹽處理組每次澆灌300 mmol·L?1氯化鈉(NaCl)溶液200 mL，間隔12 h續(xù)澆1次；對照組澆灌等量清水，連續(xù)處理1周。ABA、MeJA處理：分別配制濃度為100 μmol·L?1的ABA和MeJA溶液，均勻噴灑在幼苗葉片上，對照組噴施等量清水，12 h處理1次，共處理24 h。每個處理3個植株，重復3次。處理結束后選擇相同葉位的成熟葉片取樣。

1.3.4 RNA提取 使用TIANGEN總RNA提取試劑盒(DP432)，利用PrimerScript TM RT reagent Kit(TaKaRa，日本)試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。設計引物(表1)，以EgrACTIN為內參，用TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa，日本)進行EgrCIN1基因表達的實時熒光定量PCR(RT-qPCR)實驗，分析EgrCIN1在巨桉不同組織中及不同逆境處理后的表達情況。

表1 引物列表Table 1 Primers

1.4 EgrCIN1蛋白亞細胞定位

以改造過的pCAMbia1300-GFP載體為骨架，在phytozome上獲得EgrCIN1的轉錄本序列，去掉終止密碼子后使用Primer Premier 5設計上下游引物并在引物2端分別添加KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點及保護堿基(表1)，基因克隆后進行EgrCIN1：GFP融合載體構建。重組的陽性克隆提取質粒后，利用電轉法轉入農桿菌Agrobacterium tumetacieGV3101中。瞬時轉化煙草Nicotiana tabacum葉片，共培養(yǎng)2 d后用激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，LSM510，德國)觀察并拍照。GFP熒光觀察激發(fā)光波長設置為488 nm，吸收光波長為500 ～525 nm；觀察葉綠素熒光時激發(fā)光波長設置為552 nm，吸收光波長則為620 ～650 nm。

1.5 EgrCIN1超表達載體構建及擬南芥異源轉化

以含35S啟動子的pCAMBIA1301為載體骨架，選取多克隆位點處的XbaⅠ和KpnⅠ作為酶切位點，設計EgrCIN1帶酶切位點的全長基因引物(表1)，PCR擴增，鑒定后進行35S：EgrCIN1載體構建。電擊轉化農桿菌GV3101，蘸花法侵染擬南芥。種子收獲后，在含25 μg·mL?1潮霉素B (Hygromycin B，羅氏，瑞士)的1/2 MS培養(yǎng)基進行陽性株系篩選，獲得的陽性株系培養(yǎng)一段時間后，提取葉片基因組DNA，利用EgrCIN1基因特異引物(表1)進行分子鑒定。陽性株系繼續(xù)繁殖、篩選，直至獲得T3代轉基因純合株系。

1.6 轉基因擬南芥株系中EgrCIN1的表達

經篩選獲得3個超表達EgrCIN1轉基因純合株系，純合株系植株種植10 d后，提取葉片RNA，反轉錄為cDNA，設計引物(表1)，以AtACTIN為內參，進行半定量PCR實驗。

1.7 EgrCIN1擬南芥過表達轉基因株系低溫和ABA處理

野生型和EgrCIN1過表達株系種子經體積分數為75%乙醇消毒后，播種在1/2 MS培養(yǎng)基上，4 ℃春化處理2 d。低溫處理：培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后的野生型和轉基因株系幼苗分別移栽至育苗盆中，每盆中野生型和1個轉基因株系各移栽4株。生長2周后，在低溫培養(yǎng)箱中?6 ℃處理12 h后移至正常生長條件下恢復1周，觀察表型并拍照。每個株系處理3盆，重復3次。實驗結束后統計野生型(COL)和各株系的存活率。ABA處理：野生型和3個過表達株系分別播于含0.5 μmol·L?1ABA的培養(yǎng)基上，生長10 d后，觀察表型并拍照。

1.8 數據處理

定量結果采用2－ΔΔCt[18]方法計算；作圖軟件為GraphPad Prism ver 6.01；使用SPSS 16.0進行顯著性檢驗，分析方法選擇單因素方差分析，默認置信區(qū)間95%。

2 結果與分析

2.1 EgrCIN1基因的篩選及在4 ℃低溫不同處理時間下的表達分析

課題組前期從巨桉4 ℃低溫處理2 h的轉錄組中篩選到1個表達受到低溫強烈誘導的基因，將其命名為EgrCIN1 (cold induced 1)。Phytozome數據庫中該基因的序列號為Eucgr.B02882。為進一步了解EgrCIN1對低溫的響應，利用RT-qPCR技術對4 ℃不同處理時間(0.5、2.0、6.0、12.0、24.0、48.0 h)的巨桉無性系幼苗進行EgrCIN1表達特性分析。結果表明(圖1)：除了處理0.5 h的植株中EgrCIN1基因的表達水平與未處理植株(對照)相比沒有顯著差異外，隨處理時間的延長，EgrCIN1的表達水平逐漸升高，處理48.0 h時，其表達水平已經達到了對照的48.6倍。48.0 h后，葉片萎蔫嚴重，明顯受到低溫生理傷害，故未進一步取樣分析?？梢姡珽grCIN1表達明顯受低溫誘導，且隨處理時間的延長表達有增強的趨勢。

圖1 4 ℃低溫處理不同時間下EgrCIN1的定量表達Figure 1 Relative expression of EgrCIN1 gene under 4 ℃ low temperature treatment for different time

2.2 EgrCIN1基因、蛋白序列分析

根據巨桉數據庫獲取信息和相關分析可知：該基因開放閱讀框全長579 bp，不含內含子。編碼含有192個氨基酸的蛋白，等電點為6.98，相對分子量為20.80 kDa。該基因編碼的蛋白既沒有旁系同源物，也沒有直系同源物，是巨桉中特有且唯一的蛋白。

利用PSIPRED對EgrCIN1編碼的蛋白的二級結構預測表明：該蛋白含有2個β轉角和7個ɑ螺旋，其余部分則為無規(guī)則卷曲(圖2A)。利用TMHMM對EgrCIN1蛋白序列跨膜結構的預測則表明：序列中所有氨基酸序列位點的跨膜概率均小于0.02，沒有明顯跨膜區(qū)域(圖2B)，說明其不是膜蛋白。亞細胞定位預測結果顯示：EgrCIN1編碼的蛋白可能在葉綠體、線粒體、細胞質及細胞核中都能表達。

圖2 EgrCIN1蛋白二級結構(A)和跨膜結構(B)預測Figure 2 Prediction of EgrCIN1 protein secondary structure (A) and transmembrane structure (B)

2.3 EgrCIN1基因啟動子順式作用元件分析

對EgrCIN1的啟動子上分布的順式作用元件進行了分析，發(fā)現在EgrCIN1啟動子上分布著多個與植物非生物逆境脅迫響應密切相關的順式作用元件(表2)，其中脫落酸應答元件(ABA response element,ABRE) 2個，乙烯響應元件(ethylene response element, ERE) 1個，低溫響應元件(low temperature response element, LTR) 1個，植物轉錄因子MYB識別序列(MYB recongnition site)、MYC結合序列均為干旱和ABA響應元件，分別有4和6個。表明該基因的表達可能受到逆境脅迫的調控。

表2 EgrCIN1基因啟動子上的順式作用元件Table 2 Cis-elemtents in the promoter of EgrCIN1

2.4 EgrCIN1組織特異性表達分析

通過RT-qPCR分析EgrCIN1在不同組織中的表達情況，結果表明：EgrCIN1在嫩葉、成熟葉和莖中都有表達，且在莖中的表達量最高，而在根中卻沒有表達(圖3)。

圖3 EgrCIN1在巨桉不同組織中的定量表達Figure 3 Quantitative expression of EgrCIN1 in different tissues of E.grandis

2.5 EgrCIN1蛋白亞細胞定位

由于EgrCIN1為巨桉特有的基因，尚無其功能信息的研究，本研究構建了EgrCIN1：GFP表達載體，針對其編碼蛋白在細胞中發(fā)揮功能的位置進行了亞細胞定位分析。結果表明：EgrCIN1蛋白與煙草葉片中的葉綠體具有共定位效應，表明EgrCIN1是在葉綠體中發(fā)揮作用的蛋白(圖4)。

圖4 EgrCIN1蛋白在煙草表皮細胞中的表達(標尺為50 μm)Figure 4 Expression of EgrCIN1 protein in tobacco epidermis cell(the bar is 50 μm)

2.6 擬南芥過表達轉基因株系中EgrCIN1的表達

通過遺傳轉化后，從中篩選獲得3個轉基因株系：EgrCIN1-OE3、EgrCIN1-OE7和 EgrCIN1-OE9。利用RT-qPCR技術對這3個株系中EgrCIN1的基因表達情況進行分析，結果表明：EgrCIN1在3個株系中都有明顯的表達(圖5)。

圖5 野生型和EgrCIN1過表達轉基因株系中EgrCIN1的半定量PCRFigure 5 Semi-quantitative PCR of EgrCIN1 in wild type and EgrCIN1 overexpression transgenic lines

2.7 低溫處理下EgrCIN1過表達轉基因株系的表型分析

對3個擬南芥過表達轉基因株系進行?6 ℃低溫處理12 h，隨后置于正常生長條件下生長1周。結果發(fā)現：?6 ℃低溫處理對轉基因株系和野生型都會造成低溫傷害，但轉基因株系的恢復情況明顯好于野生型(圖6A)。統計不同株系的存活率發(fā)現，野生型存活率為30.53%，而EgrCIN1-OE3、EgrCIN1-OE7和EgrCIN1-OE9等3個轉基因株系分別達到了77.77%、86.07%和88.83% (圖6B)，表明EgrCIN1的超表達在一定程度上可以提高植株的抗寒性。

圖6 野生型和EgrCIN1轉基因株系低溫處理后的表型(A)和存活率(B)Figure 6 Phenotype (A) and survival (B) of wild-type and EgrCIN1 transgenic lines after cold treatment

2.8 ABA處理下EgrCIN1過表達轉基因株系的表型分析

植物低溫響應分子調控途徑有ABA依賴型和ABA非依賴型。針對EgrCIN1參與的抗寒性途徑是否有ABA參與的這一問題，對轉基因株系進行了ABA處理。結果表明：在0.5 μmol·L?1ABA處理10 d后，3個轉基因株系受到的ABA抑制作用明顯強于野生型(圖7)，說明ABA也參與了EgrCIN1功能的發(fā)揮。

圖7 野生型和EgrCIN1過表達株系0.5 μmol·L?1 ABA處理10 d后的表型Figure 7 Phenotypes of wild-type and EgrCIN1 overexpression lines treated with 0.5 μmol·L?1 ABA after 10 days

2.9 干旱、高鹽、ABA和MeJA等其他非生物逆境處理下EgrCIN1的表達分析

由于不同非生物逆境因子之間往往存在相互作用，為了進一步了解其他非生物逆境因子對EgrCIN1的影響，分別分析了EgrCIN1在巨桉幼苗干旱、高鹽、ABA和MeJA處理下的表達情況。結果表明：干旱和高鹽處理都能誘導EgrCIN1的表達，干旱處理下EgrCIN1的表達量是對照的35.1倍；300 mmol·L?1NaCl處理下EgrCIN1表達量則上調了16.4倍(圖8A)。但EgrCIN1的擬南芥過表達轉基因株系在干旱和高鹽處理下與野生型相比沒有顯著的表型差異。此外，外源噴施ABA也能促進EgrCIN1的表達，而100 μmol·L?1MeJA處理下，和對照相比EgrCIN1的表達并未發(fā)生顯著變化(圖8B)。

圖8 巨桉幼苗高鹽、干旱(A)和ABA、MeJA(B)處理下EgrCIN1的定量表達Figure 8 Quantitative expression of EgrCIN1 in E. grandis seedlings under high salt, drought (A) and ABA, MeJA (B) treatments

3 討論

EgrCIN1是巨桉中一個受低溫誘導的未知功能的基因，本研究表明：它隨著低溫處理時間的延長，表達水平不斷提高，顯示其參與了巨桉的低溫脅迫響應。基因、蛋白質序列的結構特征分析，以及多序列比對和可能功能域的搜索結果都表明該基因是巨桉中一個特有的新基因。啟動子上順式作用元件的預測也表明其表達可能受低溫相關因素和信號的影響。組織特異性表達分析則表明該基因主要在巨桉莖和葉中表達，而根中沒有表達。顯示其可能主要在植株地上部分發(fā)揮作用。對于EgrCIN1功能的進一步研究有可能為揭示桉樹低溫適應性新機制提供基礎。

葉綠體在植物低溫響應過程中處于中心樞紐的位置，一方面植物抵抗低溫的能力取決于低溫下的葉片光合活性。另一方面，葉綠體中參與光合作用的光反應中心酶活性受到抑制，進而引發(fā)PSⅡ的光能溢出效應，導致ROS積累，產生控制核基因表達的逆行性信號，調控低溫響應基因表達，提高植株適應性[19]。在一定程度上，葉綠體的抗低溫程度與整體植株的抗寒性密切相關。因此，葉綠體冷誘導相關的基因受到了極大的關注和重視。很多冷誘導基因在葉綠體中表達，并參與植物的低溫逆境響應。針葉福祿考Phlox subulata中PsCor413im1蛋白在葉綠體膜上表達，超表達PsCor413im1的擬南芥株系在低溫和冷凍逆境下，存活率和種子發(fā)芽率都有較大程度的提高[20]。擬南芥中的NAC102在葉綠體中作為抑制因子參與葉綠體基因的表達，并介導ROS對低溫響應基因ZAT6、ZAT10和ZAT12等的調控[21?22]；冷調控蛋白COR15A和COR15B在低溫條件下也可以通過結構的改變穩(wěn)定葉綠體的膜結構，實現擬南芥對低溫的適應性[23]。這些結果表明：葉綠體中表達的低溫誘導基因有可能成為植物低溫馴化的重要靶標。盡管利用生物信息學軟件預測EgrCIN1編碼蛋白在葉綠體、線粒體、細胞質以及細胞核中都可能存在，但亞細胞定位結果表明其可能僅在葉綠體中表達。因此被低溫強烈誘導的EgrCIN1基因表達的蛋白也定位在葉綠體中，表明其在桉樹中同樣有可能是葉綠體中參與低溫耐受性提高的重要候選基因。擬南芥中過表達EgrCIN1株系低溫處理下的結果說明了該基因的確參與了植物的低溫脅迫響應，能夠提高植株對低溫的耐受程度。另外，該基因在不同葉綠體中表達的強度有所差異，同時并非所有葉綠體中都有該基因的表達。這可能與瞬時表達過程中該基因在不同葉綠體中表達的強度不同有關，也可能是該基因在葉綠體不同發(fā)育階段表達模式不同。

ABA在植物低溫響應中也發(fā)揮了重要作用[24?25]，包含葉綠體在內的質體是ABA生物合成開始的場所[13]。ABA在葉綠體中與逆境脅迫相關基因表達的蛋白互作調控植物對逆境的適應性。如小立碗蘚Physcomitrella patens中，ABA介導了葉綠體蛋白PpCOR413im對植物低溫逆境適應性的調控[26]。擬南芥中過表達匍匐剪股穎Agrostis stolonifera葉綠體定位蛋白AsHSP26.8a，可以通過調控ABA信號途徑提高轉基因植株對低溫的抗性水平[27]。EgrCIN1的過表達株系對外源ABA表現出敏感性提高的表型，同時轉基因植株對低溫的抗性也得到了增強，這與AsHSP26.8a作用相似。暗示ABA合成或者信號途徑可能也參與了EgrCIN1對低溫逆境響應的調控。同時，在巨桉中，ABA的處理也能在一定程度上誘導EgrCIN1的表達，表明ABA合成或者信號途徑可能也參與了EgrCIN1功能發(fā)揮的調控。因此，EgrCIN1一方面可能受到低溫等非生物逆境信號誘導而參與ABA生物合成或者信號轉導對逆境響應的調控；另一方面，ABA也極可能直接影響EgrCIN1的表達，參與其功能的調控。另外，干旱、高鹽也能強烈誘導EgrCIN1的表達，但實驗過程中EgrCIN1擬南芥過表達轉基因株系并未表現出明顯的耐旱、耐鹽表型，顯示EgrCIN1在擬南芥和巨桉的非生物逆境響應中發(fā)揮的功能可能不同，同時也表明EgrCIN1在植物非生物逆境響應中發(fā)揮的功能比較復雜，需要進一步研究以揭示其在巨桉低溫等非生物逆境響應中的功能。

本研究表明：EgrCIN1是巨桉中特有的一個基因，受低溫強烈誘導，在葉綠體中表達。其擬南芥過表達轉基因株系提高了對低溫的耐受性，同時對ABA的敏感程度也被增強。這表明EgrCIN1有可能是存在葉綠體中，通過與ABA互作，以ABA依賴形式的途徑參與了植物對低溫逆境的響應。但仍有很多問題需要進一步深入研究，如EgrCIN1是否與葉綠體的發(fā)育有關系，與ABA采用什么樣的互作方式共同參與植物對低溫逆境適應性的調控，在干旱、高鹽等其他非生物逆境響應中的作用等。