黃清晨，賴建新，黃李超，盧孟柱

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

土地鹽堿化增大了土壤滲透壓，導(dǎo)致植物吸水困難，對(duì)植物造成了生理干旱[1]。過(guò)多鈉離子(Na+)、氯離子(Cl?)的積累，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞，對(duì)植物造成滲透脅迫[2?3]。鹽脅迫還導(dǎo)致植物內(nèi)源活性氧(ROS)增加，引起細(xì)胞膜損傷甚至細(xì)胞死亡，抑制植株生長(zhǎng)發(fā)育[4]。ROS作為響應(yīng)鹽脅迫的關(guān)鍵因子，在低水平下，誘導(dǎo)增強(qiáng)抗氧化酶活性，抵御鹽脅迫；在高水平下，過(guò)量積累造成氧化脅迫，導(dǎo)致生物大分子產(chǎn)生不可逆的損傷，改變細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，抑制植株生長(zhǎng)發(fā)育[5]。為緩解ROS積累引起的氧化脅迫，植物通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)相關(guān)酶活性來(lái)降低體內(nèi)的ROS，從而提高抗逆性[6]。植物的抗氧化酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、過(guò)氧化物酶(PRX)等[7]。

在小麥Triticum aestivum中過(guò)表達(dá)TaPRX-2A，植株抗氧化能力增強(qiáng)，ROS下降，耐鹽性增加[8]。擬南芥Arabidopsis thaliana AtPRX19參與脅迫(鹽害、干旱、病蟲(chóng)害等)后的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使得ROS增加，對(duì)植物造成氧化脅迫。鹽脅迫下，擬南芥AtPRX19表達(dá)量上調(diào)，ROS減少，抵御脅迫能力增強(qiáng)[9]。在胡蘿卜Daucus carota中異源表達(dá)OsPRX114同樣降低過(guò)氧化氫(H2O2)水平，提高植株的耐鹽性[10]。玉米Zea mays的PRX家族成員ZmPRX26、ZmPRX42、ZmPRX71、ZmPRX75和ZmPRX78參與了對(duì)包括鹽脅迫在內(nèi)多種非生物脅迫的響應(yīng)[11]。部分PRX家族成員通過(guò)協(xié)調(diào)水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等激素水平發(fā)揮作用[12]。

研究林木對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，揭示耐鹽性相關(guān)機(jī)理，對(duì)培育耐鹽性更強(qiáng)林木品種具有重要意義。為研究楊樹(shù)PopulusPRX家族對(duì)林木耐鹽性的影響，本研究以銀腺楊‘84K’Populus alba × P. glandulosa‘84K’ (84K楊)為材料，通過(guò)構(gòu)建PagPRX19的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，改變楊樹(shù)H2O2水平，并分析了楊樹(shù)耐鹽相關(guān)生理指標(biāo)，以期揭示PagPRX19參與調(diào)控楊樹(shù)鹽脅迫響應(yīng)的機(jī)制，為楊樹(shù)的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料為84K楊，過(guò)表達(dá)PagPRX19株系為本研究獲得。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 Phytozome v13數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取毛果楊Populus trichocarpa和擬南芥的PRX家族的蛋白序列、蛋白編碼區(qū)(CDS)序列、啟動(dòng)子序列。利用P1ant CARE (http：//bioinformatics.psb.u-gent.be/webtooLs/pLantcare/html/)在線軟件對(duì)PRX家族啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)。使用MEGA v7軟件，構(gòu)建擬南芥和楊樹(shù)的PRX家族的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析楊樹(shù)和擬南芥PRX基因家族成員在進(jìn)化關(guān)系上的同源性。利用MEGE v5.4.1 (https：//meme-suite.org/meme/tooLs/meme)在線軟件分析PRX家族基因保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 基因表達(dá)模式分析 選用生長(zhǎng)一致的84K楊樹(shù)苗，分別從莖尖(SAM)、莖段3 ～10節(jié)間(IN3～I(xiàn)N10)、形成層(Ca)、幼葉(YL)、成熟葉(ML)、根(R)、木質(zhì)部(Xy)取樣，所有材料取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測(cè)該基因在不同組織內(nèi)的表達(dá)模式。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因苗獲得 在84K楊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)Blast獲取毛果楊PRX19同源基因PagPRX19，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得目的基因(F端引物：ATGTATACAACAATCATGCCT，R端引物：TTATGTATG CATACTGCAAAC)，使用Gateway技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體35S：PagPRX19，利用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化84K楊獲得過(guò)表達(dá)PagPRX19轉(zhuǎn)基因苗[13]。

1.2.4 鹽脅迫處理 ①組培鹽脅迫處理。以組培培養(yǎng)45 d的過(guò)表達(dá)株系為材料，以非轉(zhuǎn)基因植株為對(duì)照。鹽脅迫組接頂芽于100 mmol·L?1氯化鈉(NaCl)生根培養(yǎng)基，對(duì)照組接頂芽于0 mmol·L?1NaCl生根培養(yǎng)基。每組處理12瓶，每瓶接2株頂芽。培養(yǎng)溫度為23 ～25 ℃，光周期為8 h/16 h(黑暗/光照)。處理25 d，觀察植株在長(zhǎng)期鹽脅迫下耐鹽能力。②土培鹽脅迫處理。以土培生長(zhǎng)2個(gè)月的過(guò)表達(dá)株系為實(shí)驗(yàn)材料，以非轉(zhuǎn)基因植株為對(duì)照，每組處理5株。鹽脅迫組隔2 d澆灌1次100 mmol·L?1的NaCl溶液，對(duì)照組隔2 d澆灌1次0 mmol·L?1的NaCl溶液。培養(yǎng)溫度為23 ～25 ℃，光周期為8 h/16 h(黑暗/光照)。處理7 d，取樣測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)，處理12 d后拍照[14]。

1.2.5 生理指標(biāo)測(cè)定 ①脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定。采用脯氨酸測(cè)試盒(南京建成，A107-1-1)測(cè)定脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。②相對(duì)含水量測(cè)定。取新鮮葉片記錄鮮質(zhì)量(WF)，超純水(ddH2O)浸泡24 h記錄質(zhì)量(WT)，65 ℃烘箱干燥3 d，記錄干質(zhì)量(WD)。葉片相對(duì)含水量=(WF?WD)/(WT?WD)×100%[15]。③丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度測(cè)定。稱取植物葉片0.2 g，加入4 mL質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸(TCA)溶液和石英砂研磨至勻漿，4 000 r·min?1離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL硫代巴比妥酸(TAB)溶液，對(duì)照為2 mL ddH2O。搖勻后沸水浴15 min，?20 ℃迅速冷卻后4 000 r·min?1離心2 min，取上清液，在532和600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。MDA 濃度CMDA(μmol·L?1)=[D(532)?D(600)]/155×1 000，MDA 質(zhì)量摩爾濃度(nmol·g?1)=(CMDA×V提取液體積)/F樣品質(zhì)量[16]。④電解質(zhì)滲透率測(cè)定。采用五點(diǎn)取樣法取樣，加入6 mL ddH2O，28 ℃搖床震蕩1 h。取出測(cè)第1次電導(dǎo)值(G1)。沸水浴30 min，冷卻至室溫，搖勻測(cè)量第2次電導(dǎo)值(G2)。電解質(zhì)滲透率=第1次電導(dǎo)值/第2次電導(dǎo)值×100%[17]。⑤ROS水平定性測(cè)量。DAB染色劑試劑盒(索萊寶，DA1010)染色檢測(cè)H2O2；氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)粉末(索萊寶，N8140)染色檢測(cè)超氧陰離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)PRX基因家族的生物信息學(xué)分析

使用擬南芥和毛果楊PRX家族的同源蛋白序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)并進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析(圖2)發(fā)現(xiàn)：該家族基因高度保守。對(duì)PRX基因家族啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件分析(圖3)發(fā)現(xiàn)：該基因家族成員含有響應(yīng)生長(zhǎng)素(IAA)、脫落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等激素的功能元件以及響應(yīng)低溫、干旱、鹽害等非生物脅迫的功能元件。因此，PRX家族為植物生長(zhǎng)發(fā)育和參與抵御環(huán)境脅迫中的重要家族。毛果楊Potri.004G052100 (84K楊同源基因命名為PagPRX19)與擬南芥AtPRX19 (At2G34 060)的同源關(guān)系較近。研究表明：AtPRX19參與調(diào)控?cái)M南芥的抗逆性[9,16]，推測(cè)與其同源的楊樹(shù)基因PRX19也具有此功能。此外，PRX19啟動(dòng)子區(qū)域含有與鹽脅迫密切相關(guān)的IAA、ABA和MeJA等激素相關(guān)順式作用元件，參與植物耐鹽調(diào)控。選取PagPRX19基因分析其在84K楊中的表達(dá)模式(圖4)，結(jié)果顯示：PagPRX19基因在各個(gè)組織均有表達(dá)，在木質(zhì)部表達(dá)量最高。

圖1 PRX基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 1 Phylogenetic analysis of the PRX gene family

圖2 楊樹(shù)PRX家族蛋白結(jié)構(gòu)分析Figure 2 Protein motifs of the PRX family in poplar

圖3 楊樹(shù)PRX基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分析Figure 3 Cis-elements in promoters of PRX the gene family in poplar

圖4 PagPRX19基因組織特異性表達(dá)Figure 4 Tissue-specific expression of PagPRX19

2.2 轉(zhuǎn)基因苗的獲取及表型分析

對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的6株植株進(jìn)行陽(yáng)性苗鑒定，通過(guò)RT-qPCR分析不同陽(yáng)性株系PagPRX19的表達(dá)量，選取了相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照46和12倍的2個(gè)株系OE#1、OE#2進(jìn)行表型分析(圖5)。分別選取6株生長(zhǎng)2個(gè)月的土培苗統(tǒng)計(jì)株高和地徑發(fā)現(xiàn)：株系OE#1的株高(44.15 cm)與對(duì)照(47.36 cm)相比極顯著下降(P＜0.01)，而株系OE#2的株高(46.58 cm)與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。株系OE#1的地徑(3.42 cm)和OE#2的地徑(3.49 cm)與對(duì)照(3.22 cm)相比極顯著增加(P＜0.01)。取植株第3片葉進(jìn)行DAB和NBT化學(xué)染色(圖6)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照相比，PagPRX19過(guò)表達(dá)植株葉片的ROS水平顯著減少。對(duì)植株第7節(jié)間莖段組織切片進(jìn)行DAB和NBT化學(xué)染色(圖7)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)植株莖段的ROS水平降低，說(shuō)明過(guò)表達(dá)PagPRX19導(dǎo)致植株ROS降低。

圖5 陽(yáng)性植株鑒定表型分析Figure 5 Identification and phenotypic analysis of transgenic overexpressed plants

圖6 轉(zhuǎn)基因植株第3片葉ROS水平檢測(cè)Figure 6 Changes of ROS level in the third leaf of transgenic plants

圖7 轉(zhuǎn)基因植株第7節(jié)間莖段ROS水平變化Figure 7 Changes of ROS level in the stem of the seventh internode of transgenic plants

2.3 鹽脅迫下植株相關(guān)生理指標(biāo)的變化

在100 mmol·L?1NaCl生根培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下(圖8)，對(duì)照植株組培苗葉片大面積脫落，植株呈黃褐色，干枯嚴(yán)重甚至死亡。而過(guò)表達(dá)葉片失綠和皺縮情況與對(duì)照相比較輕，且無(wú)葉片脫落，說(shuō)明過(guò)表達(dá)植株較對(duì)照具有更高的耐鹽性。在100 mmol·L?1NaCl溶液灌溉處理下，對(duì)照植株葉片大面積脫落，皺縮明顯，嚴(yán)重失綠。過(guò)表達(dá)株系OE#2葉片輕度失綠，葉緣處皺縮不明顯。株系OE#1僅葉緣處輕微皺縮，與正常生長(zhǎng)的處理差異不明顯，與對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)株系有更高的耐鹽性，其中表達(dá)量較高的株系OE#1較OE#2耐鹽性更強(qiáng)。

圖8 鹽脅迫下對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株的表型特征Figure 8 Phenotypic characteristics of non- and transgenic poplars under salt stress

從圖9可見(jiàn)：正常生長(zhǎng)時(shí)，對(duì)照與過(guò)表達(dá)植株脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、相對(duì)含水量、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、電解質(zhì)滲透率無(wú)顯著差異。鹽脅迫下，相較于對(duì)照植株的脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(158.26 μg·g?1)，過(guò)表達(dá)植株脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著增加 (OE#1 為 244.94 μg·g?1，OE#2 為 217.02 μg·g?1)(P＜0.01)。與對(duì)照葉片相對(duì)含水量(70.05%)相比，過(guò)表達(dá)植株葉片相對(duì)含水量極顯著高于對(duì)照(OE#1為82.68%，OE#2為80.25%)(P＜ 0.01)。與對(duì)照丙二醛質(zhì)量摩爾濃度 (75.76 nmol·g?1)相比，過(guò)表達(dá)植株丙二醛質(zhì)量摩爾濃度(OE#1 為 39.44 nmol·g?1，OE#2 為 50.76 nmol·g?1)較低且差異極顯著(P＜0.01)。與對(duì)照電解質(zhì)滲透率(32.75%)相比，過(guò)表達(dá)植株電解質(zhì)滲透率(OE#1為24.24%，OE#2為27.09%)較低，且株系OE#1與對(duì)照差異極顯著(P＜0.01)。

圖9 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的生理指標(biāo)Figure 9 Physiological index of transgenic plants under salt stress

2.4 ROS水平定性測(cè)定

對(duì)鹽脅迫處理后的土培苗葉片進(jìn)行NBT和DAB染色(圖10)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)植株葉片的ROS信號(hào)少。對(duì)鹽脅迫處理后的組培苗根部進(jìn)行DAB和NBT染色(圖11)后發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照相比，PagPRX19過(guò)表達(dá)植株根部的ROS信號(hào)少。說(shuō)明在鹽脅迫下，由于過(guò)表達(dá)PagPRX19導(dǎo)致植株ROS水平下降。

圖10 鹽脅迫下土培植株葉片ROS檢測(cè)Figure 10 Detection of ROS in leaves of soil culture plants under salt stress

圖11 鹽脅迫下組培植株根部ROS檢測(cè)Figure 11 Detection of ROS in roots of culture plants under salt stress

3 討論

過(guò)氧化酶PRX可催化H2O2，降低ROS水平，減輕脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害[3]。因此，通過(guò)抗氧化酶清除鹽脅迫產(chǎn)生的ROS，以抵御脅迫帶來(lái)的細(xì)胞損傷，提高林木的抗性，可作為抗逆分子育種手段。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)過(guò)氧化酶基因，改變84K楊內(nèi)源ROS水平，從而探究ROS水平對(duì)楊樹(shù)耐鹽性的影響。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：PagPRX19存在多個(gè)與IAA、ABA、或MeJA相關(guān)的順式作用元件，這些激素與鹽脅迫密切相關(guān)，參與植物耐鹽調(diào)控?；虮磉_(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)：PagPRX19在植株各個(gè)組織都有表達(dá)。因此選取該基因作為研究對(duì)象，創(chuàng)制過(guò)表達(dá)植株。與對(duì)照植株相比，過(guò)表達(dá)植株葉片和莖段ROS水平降低。過(guò)基因植株H2O2降低，也隨之降低?？赡苁沁^(guò)表達(dá)加速了H2O2的清除，植物自身調(diào)控SOD酶加速分解產(chǎn)生H2O2，從而導(dǎo)致了減少[9]。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鹽脅迫處理，在100 mmol·L?1NaCl處理下，對(duì)照植株出現(xiàn)了脅迫癥狀，但過(guò)表達(dá)植株癥狀輕或沒(méi)有出現(xiàn)癥狀。過(guò)表達(dá)植株可能通過(guò)降低鹽脅迫下植株氧化脅迫程度，增強(qiáng)耐鹽性。ROS水平檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了這一推論，鹽脅迫下，過(guò)表達(dá)植株與對(duì)照相比，ROS水平仍保持較低水平。表明過(guò)表達(dá)PagPRX19可降低鹽脅迫下ROS的傷害，從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的抗性。

研究表明：鹽脅迫下脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加[17]，葡萄Vitis vinifera砧木在一定程度內(nèi)的耐鹽性越強(qiáng)，脯氨酸等有機(jī)滲透物質(zhì)就越多[18]。本研究表明：鹽脅迫下，過(guò)表達(dá)PagPRX19植株脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于對(duì)照植株，使得植株的耐鹽能力增強(qiáng)。此外，鹽脅迫造成植物葉片含水量下降，植物生理活動(dòng)會(huì)受到影響[19]。丙二醛和電解質(zhì)滲透率反映了細(xì)胞膜損壞程度[20]。鹽脅迫下，植株細(xì)胞膜被破壞，細(xì)胞膜內(nèi)物質(zhì)外滲，電解質(zhì)滲透率升高，丙二醛增加[21?22]，而耐鹽品種一般表現(xiàn)為葉片相對(duì)含水量高、電解質(zhì)滲透率和丙二醛低的特點(diǎn)[19,23]。本研究中，鹽脅迫下PagPRX19過(guò)表達(dá)植株葉片相對(duì)含水量比對(duì)照高，丙二醛、電解質(zhì)滲透率降低，表明轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞膜完整性較好，耐鹽性增強(qiáng)。

4 結(jié)論

過(guò)表達(dá)過(guò)氧化物酶基因PagPRX19可降低84K楊植株內(nèi)源ROS水平，且在鹽脅迫下過(guò)表達(dá)植株ROS仍保持低水平，細(xì)胞膜的破壞程度降低、葉片的持水能力增強(qiáng)。表明在楊樹(shù)中過(guò)表達(dá)PagPRX19，能促進(jìn)鹽脅迫下植株內(nèi)源ROS的清除，從而減緩鹽脅迫造成的氧化脅迫，提高植株的耐鹽性。