郭雅琨，趙巖秋，杜 娟，盧孟柱

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2. 浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA topoisomerase，TOP)是一類能夠改變DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的酶，在細(xì)胞的一系列基礎(chǔ)生命活動(dòng)如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和染色體分離等過程中發(fā)揮著重要作用[1?2]。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在1971年被首次發(fā)現(xiàn)，命名為ω蛋白，即DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ，是大腸埃希菌Escherichia coli中能夠特異性地將負(fù)超螺旋DNA解旋的一種拓?fù)洚悩?gòu)酶[3?4]。根據(jù)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能和作用機(jī)制，可以將其分成Ⅰ型和Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，Ⅰ型TOP只切割DNA的1條鏈，不具有腺苷三磷酸(ATP)依賴性，Ⅱ型TOP能切割DNA的2條鏈并形成雙鏈斷裂，具有ATP依賴性[5]。真核生物中，Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶包括ⅡA型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和ⅡB型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶：ⅡA型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在高等真核生物(如哺乳動(dòng)物)中有2種異構(gòu)體，分別為TOP2α和TOP2β，在低等真核生物中通常只有1種；ⅡB型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在真核生物中主要是與酵母Spo11同源的ⅡB型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，以及植物中與古細(xì)菌ⅡB型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶同源的TOPⅥ[6]。

在動(dòng)物細(xì)胞中的研究表明：Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶主要在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行解旋，并且確保有絲分裂過程中姐妹染色單體的正確分離，對(duì)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和凝縮也有重要作用[7]。TOP2α對(duì)細(xì)胞周期起重要調(diào)節(jié)作用，保證分裂旺盛細(xì)胞的活性，不分裂細(xì)胞中則沒有TOP2α；TOP2β對(duì)小鼠Mus musculus胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)元的形成具有重要影響，缺失TOP2β的小鼠出生后無法存活[6,8]。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶還常被作為抗癌藥物的靶標(biāo)蛋白，通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性導(dǎo)致復(fù)制叉停滯，形成雙鏈斷裂并干擾細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的快速增殖[9?11]。植物中已對(duì)擬南芥Arabidopsis thaliana、小麥Triticum aestivum、花椰菜Brassica oleraceavar.botrytis等的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶進(jìn)行了分離和生化性質(zhì)等方面的研究[12?17]，但DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用機(jī)制研究大多集中在動(dòng)物和酵母系統(tǒng)里，關(guān)于植物DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶作用機(jī)制的研究較少。研究表明：在煙草Nicotiana tabaccum中過表達(dá)Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠改變煙草植株形態(tài)，提高煙草的鹽脅迫耐受性[18]。關(guān)于擬南芥中DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的研究表明：TOPⅡ和染色體運(yùn)動(dòng)有助于消除減數(shù)分裂過程中糾纏染色體之間的連鎖[19]。研究發(fā)現(xiàn)：topⅡ突變體擬南芥幼苗的根生長(zhǎng)受到明顯抑制，表明TOPⅡ在根生長(zhǎng)和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮作用，還可通過同源重組的方式進(jìn)行有絲分裂中的DNA修復(fù)和減數(shù)分裂中的DNA雙鏈斷裂(DSBs)修復(fù)[20]，并與TOPⅡ結(jié)合蛋白(TopBP1)在DNA修復(fù)、有絲分裂和減數(shù)分裂過程中共同發(fā)揮作用[21]。

楊樹Populus作為研究木本植株生長(zhǎng)發(fā)育的模式樹種，在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能和作用機(jī)制等方面仍有許多空白。本研究以銀腺楊‘84K’Populus alba×P. glandulosa‘84K’(84K楊)為研究對(duì)象，利用生物信息學(xué)及分子生物學(xué)方法，對(duì)楊樹DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶基因功能進(jìn)行初步探究，以期為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶基因在木本植物中的作用機(jī)制和木本植物分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以84K楊組培苗為研究材料，組培苗生長(zhǎng)溫度為(24±2) ℃，光照為16 h/8 h (光照/黑暗)。土培苗為將生長(zhǎng)約4周的組培苗從1/2 MS培養(yǎng)基移栽至營(yíng)養(yǎng)土中，在溫度(24±2) ℃，光照16 h/8 h (光照/黑暗)，相對(duì)濕度60% ～80%的土培室中培養(yǎng)。

1.2 RNA提取與cDNA合成

提前高溫處理研缽、藥匙等直接與樣品接觸的試驗(yàn)器具。用預(yù)冷的研缽將植物材料在液氮中快速研磨成細(xì)膩粉末，取約100 mg粉末至RNase-free離心管中，使用商業(yè)購(gòu)買的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN #DP441)提取84K楊不同組織的總RNA。提取得到的RNA用商業(yè)購(gòu)買的FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(TIANGEN #KR116)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 基因克隆與序列分析

84K楊基因組數(shù)據(jù)來源于國(guó)家基因庫(kù)序列歸檔系統(tǒng)(CNGB Nucleotide Sequence Archive，CNSA)，項(xiàng)目號(hào)為CNP0000339[22]。根據(jù)PagTOP2b基因蛋白質(zhì)編碼序列(CDS)，用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)序列克隆擴(kuò)增引物，以從84K楊中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PagTOP2b基因的克隆。

在84K楊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的GFF文件中提取PagTOP2b基因非翻譯區(qū)、外顯子和內(nèi)含子的長(zhǎng)度及染色體位置信息，使用TBtools軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖[23]。在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(conserved domain database，CDD)中搜索蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域[24]。在 SOPMA (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html)網(wǎng)站上進(jìn)行PagTOP2b蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)在線分析。并通過SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)在線預(yù)測(cè)PagTOP2b蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)合相關(guān)注釋信息繪圖分析[25]。

使用ExPASy (https：//web.expasy.org/protparam/)在線分析網(wǎng)站對(duì)PagTOP2b蛋白的序列長(zhǎng)度、蛋白分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、親水性平均系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)等蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析[26]。并在 Cell-Ploc 2.0網(wǎng)站中 (http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)選擇 Plant-mPLoc進(jìn)行 PagTOP2b蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)[27]。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)分析

在 Primer3 (https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)網(wǎng)站上以PagTOP2b基因CDS序列為模板設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性引物(表1)。以待分析樣品的cDNA為模板，根據(jù)商業(yè)購(gòu)買的熒光定量PCR試劑ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Vazyme #Q311-02/03)使用說明配置反應(yīng)體系，選擇ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參基因。在Applied Biosystems QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific)實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和4次技術(shù)重復(fù)，取平均值作為后續(xù)計(jì)算的閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)，采用 2???Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 基因克隆及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR)引物Table 1 Primers for gene clone and RT-qPCR

1.5 楊樹遺傳轉(zhuǎn)化

遺傳轉(zhuǎn)化所用PagTOP2b基因過表達(dá)載體pCAMBIA-S1300-flag-PagTOP2b為實(shí)驗(yàn)室保存。農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciensGV3101化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物(#AC1001)。將載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化84K楊。對(duì)鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株及84K楊對(duì)照植株的相同組織取材進(jìn)行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表達(dá)量變化。以84K楊植株表達(dá)量為對(duì)照計(jì)算轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)表達(dá)量。

1.6 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定及組織切片

選取相對(duì)表達(dá)量較高的株系，組培苗擴(kuò)繁至每個(gè)株系至少15棵重復(fù)。生長(zhǎng)約4周后選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，同具有相同遺傳背景的84K楊對(duì)照植株一起移栽至營(yíng)養(yǎng)土中。對(duì)移栽后的植株進(jìn)行表型觀察和記錄，測(cè)定株高和地徑。切取新鮮楊樹莖段，用速干強(qiáng)力膠固定在樣品架上，使用Leica VT1200S振動(dòng)式切片機(jī)，將莖段橫切成厚度為40 μm的薄片。切片平鋪在載玻片上，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲苯胺藍(lán)(TBO)染液，染色30 ～60 s后洗去染液，需根據(jù)染色程度調(diào)整染色時(shí)間。將染色后的切片放在載玻片上，用Leica DM6 B正置熒光顯微鏡觀察并拍照記錄，目鏡放大倍數(shù)為10倍，物鏡放大倍數(shù)為10倍。使用ImageJ軟件測(cè)量木質(zhì)部寬度。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并對(duì)株高、地徑和木質(zhì)部寬度進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PagTOP2b基因克隆與序列分析

以84K楊cDNA為模板，克隆得到PagTOP2b基因全長(zhǎng)序列，對(duì)其進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)、蛋白理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域及蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。如圖1A所示：PagTOP2b基因結(jié)構(gòu)包含19個(gè)外顯子，蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)長(zhǎng)度為4 449 bp。如圖1B所示：蛋白保守結(jié)構(gòu)域主要包括PLN03237，目前被認(rèn)為是跨越多個(gè)結(jié)構(gòu)域的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ模塊，此外特定匹配的保守結(jié)構(gòu)域還包括靠近N端的TOP2c，是真核生物中Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶具有的結(jié)構(gòu)域；位于中部靠近C端的TOP4c，是ⅡA亞型拓?fù)洚悩?gòu)酶具有的結(jié)構(gòu)域。如圖1C所示：蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占40.08%，延伸鏈占14.51%，β-折疊占5.20%，無規(guī)則卷曲占40.22%，即蛋白主要折疊方式為α-螺旋和無規(guī)則卷曲。如圖1D所示：蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)為同型二聚體，包含組氨酸激酶/腺苷三磷酸酶結(jié)構(gòu)域，2個(gè)ⅡA型拓?fù)洚悩?gòu)酶功能域，以及拓?fù)洚悩?gòu)酶-引發(fā)酶功能域(topoisomerase-primase domain，TOPRIM domain)，該結(jié)構(gòu)域是在Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶等酶類中發(fā)現(xiàn)的核苷酸轉(zhuǎn)移酶/水解酶功能域。

圖1 PagTOP2b基因及其編碼蛋白的特征分析Figure 1 Characteristics of PagTOP2b gene and its coding protein

蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果表明：PagTOP2b蛋白共有1 482個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為166.1 kDa。理論等電點(diǎn)為7.54，屬堿性蛋白。親水性平均系數(shù)為負(fù)數(shù)，表明蛋白均具有較強(qiáng)的親水性。脂肪族氨基酸指數(shù)(蛋白中脂肪族側(cè)鏈所占據(jù)的相對(duì)體積)為77.76，不穩(wěn)定指數(shù)為41.04，大于40，為不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：PagTOP2b蛋白具有葉綠體和細(xì)胞核定位信號(hào)。

2.2 PagTOP2b表達(dá)模式分析

為研究PagTOP2b基因在84K楊不同組織的表達(dá)情況，分別取84K楊頂芽，第3、5、7、9節(jié)間，幼葉，成熟葉和根進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。結(jié)果如圖2A所示：PagTOP2b在莖頂端分生組織(SAM)表達(dá)量最高，其次在第3節(jié)間(IN3)表達(dá)量較高，在幼葉(YL)中的表達(dá)量也高于在成熟葉(ML)，即該基因在84K楊的幼嫩組織中有較高的表達(dá)量。同時(shí)在楊樹資源數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站PopGenIE (https：//popgenie.org/gene?id=Potri.009G058900)中，查找毛果楊P.trichocarpa中Ⅱ類TOP基因PtTOP2b在楊樹不同組織中的表達(dá)情況，如圖2B所示：PtTOP2b在休眠的葉芽、發(fā)育過程中的葉芽以及休眠的花芽中有較高的表達(dá)量，與84K楊中定量分析結(jié)果相一致。

2.3 轉(zhuǎn)基因楊樹PagTOP2b表達(dá)水平

為進(jìn)一步研究PagTOP2b基因?qū)顦渖L(zhǎng)發(fā)育的影響，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法獲得PagTOP2b過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因84K楊植株。過表達(dá)載體圖譜見圖3A，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析，選擇表達(dá)量較高的株系用于后續(xù)試驗(yàn)。根據(jù)目的基因的相對(duì)表達(dá)量情況(圖3B)，選擇PagTOP2b過表達(dá)株系bOE-28和bOE-30進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。過表達(dá)株系bOE-28中目的基因相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照植株中目的基因表達(dá)量的8.46倍，bOE-30為13.29倍。

圖3 PagTOP2b過表達(dá)載體及轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)錄水平分析Figure 3 PagTOP2b overexpression vector and transcriptional level analysis of transgenic plants

2.4 過表達(dá)PagTOP2b基因?qū)顦渖L(zhǎng)發(fā)育的影響

將過表達(dá)植株和對(duì)照植株移栽至土壤培養(yǎng)3個(gè)月后觀察并記錄表型(圖4A)。取第7、9、11節(jié)間并對(duì)其橫切面進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照與過表達(dá)植株相比細(xì)胞形態(tài)無明顯差異(圖4B)。相比于對(duì)照，PagTOP2b過表達(dá)株系bOE-28和bOE-30植株高度顯著大于對(duì)照(P＜0.05)，相比對(duì)照分別增加了17.5%和11.5%(圖4C)；過表達(dá)株系bOE-28植株的地徑顯著大于對(duì)照(P＜0.05)，bOE-30植株的地徑極顯著大于對(duì)照(P＜0.01)，相比對(duì)照分別增加了10.7%和16.3%(圖4D)。通過統(tǒng)計(jì)其木質(zhì)部寬度發(fā)現(xiàn)：PagTOP2b過表達(dá)株系bOE-30自第7節(jié)間起木質(zhì)部寬度極顯著大于對(duì)照(P＜0.01)，過表達(dá)株系bOE-28第11節(jié)間木質(zhì)部寬度極顯著大于對(duì)照(P＜0.01)(圖4E)。

圖4 PagTOP2b過表達(dá)轉(zhuǎn)基因楊樹表型分析Figure 4 Phenotypic analysis of PagTOP2b overexpression transgenic poplar

3 討論

植物生長(zhǎng)發(fā)育的過程，就是植物細(xì)胞、組織和器官在數(shù)量上不可逆增加以及細(xì)胞分化的過程。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在染色體復(fù)制、細(xì)胞分裂及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。本研究對(duì)84K楊中的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶基因PagTOP2b進(jìn)行克隆及序列分析，對(duì)序列長(zhǎng)度、保守結(jié)構(gòu)域及蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)注釋信息的分析顯示：該基因包含腺苷三磷酸酶結(jié)構(gòu)域、TOPRIM結(jié)構(gòu)域以及ⅡA亞型拓?fù)洚悩?gòu)酶具有的結(jié)構(gòu)域，與先前研究中總結(jié)的動(dòng)植物ⅡA亞型拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)構(gòu)相符[5,28]，因此判斷該基因?qū)儆冖駻亞型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶。

對(duì)PagTOP2b基因在84K楊不同組織中的表達(dá)模式分析表明：該基因在頂端分生組織和第3節(jié)間中表達(dá)量較高。相比于84K楊，毛果楊具有更豐富的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，能夠?qū)蛟跅顦洳煌M織的表達(dá)情況進(jìn)行詳細(xì)分析，同時(shí)對(duì)84K楊中DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶基因的表達(dá)情況而言具有一定借鑒意義。因此，對(duì)毛果楊中直系同源基因PtTOP2b的表達(dá)模式進(jìn)行分析顯示：PtTOP2b在葉芽及花芽中具有較高的表達(dá)量，即在幼嫩組織具有較高的表達(dá)量。有研究表明：豌豆Pisum sativum、玉米Zea mays和擬南芥中發(fā)現(xiàn)Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在生長(zhǎng)活躍的植物組織中有較高的表達(dá)量[15]。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明PagTOP2b基因主要在細(xì)胞活躍分裂、分化的組織中表達(dá)，推測(cè)其在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用。同時(shí)，PagTOP2b在楊樹的第3節(jié)間高表達(dá)，表明其可能在楊樹的徑向生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。因此，需要進(jìn)一步研究確認(rèn)PagTOP2b對(duì)楊樹樹高生長(zhǎng)和徑向生長(zhǎng)的影響。

為了進(jìn)一步確定該基因的作用，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法，獲得了PagTOP2b基因過表達(dá)84K楊植株。與對(duì)照植株相比，轉(zhuǎn)基因植株高度顯著增加，即促進(jìn)了楊樹生物量的增加，說明該基因具有進(jìn)行定向分子育種的潛在應(yīng)用價(jià)值。除了促進(jìn)楊樹樹高生長(zhǎng)外，莖段的直徑及木質(zhì)部寬度的增加，說明該基因還影響了楊樹木質(zhì)部的發(fā)育，可能來源于對(duì)形成層活動(dòng)的調(diào)控，需要進(jìn)一步的研究予以證實(shí)。有研究表明：過表達(dá)Ⅱ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶NtTopoⅡα?xí)?duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育及植株形態(tài)產(chǎn)生影響，相比于野生型，過表達(dá)植株開花結(jié)籽提前2 ～3周，莖長(zhǎng)增加但直徑減小，節(jié)間長(zhǎng)度變長(zhǎng)，根系更加發(fā)達(dá)[18]。本研究與其在株高增加上的表型一致，但莖直徑變化不同，可能由于草本植物與木本植物的莖段次生生長(zhǎng)存在差異?？偠灾琍agTOP2b基因能夠同時(shí)促進(jìn)楊樹徑向和縱向的生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本研究通過克隆及序列分析確定PagTOP2b是84K楊中的一個(gè)ⅡA型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶基因，在幼嫩組織具有較高的表達(dá)量。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)過表達(dá)PagTOP2b基因，能夠顯著促進(jìn)植株增高，莖直徑增大，促進(jìn)楊樹徑向及縱向的生長(zhǎng)，增加植株生物量。