謝文遠，魯益飛，陳征海，金孝鋒

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 浙江省森林芳香植物康養(yǎng)功能研究重點實驗室，浙江 杭州 311300；2. 浙江省森林資源監(jiān)測中心，浙江 杭州 310020；3. 浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

廣義烏蘞莓屬Cayratias.l. 隸屬于葡萄科Vitaceae，全世界約60余種，分布于亞洲、非洲和大洋洲。該屬為草質(zhì)藤本，有時木質(zhì)化；葉為鳥足狀5小葉，或3小葉；復(fù)二歧聚傘花序或傘房狀多歧聚傘花序，腋生或假腋生；花4數(shù)；花瓣展開，各自分離脫落；花盤發(fā)達；柱頭不裂；果為漿果[1]。中國記載有17種，南北各地均有分布，以西南地區(qū)種類最為豐富[2]。

王文采[3]在對中國葡萄科系統(tǒng)整理時，記載了浙江產(chǎn)2種：烏蘞莓Cayratia japonica(Thunb.)Gagnep. 和大葉烏蘞莓C. oligocarpaGagnep. [包括變種櫻葉烏蘞莓C. oligocarpavar.glabra(Gagnep.)Rehder]?！墩憬参镏尽返?卷[4]作了同樣的記述。丁炳揚等[5]報道了車索藤C. japonicavar.pubifoliaMerr. et Chun在浙江(慶元)的新分布。李朝鑾[6]研究了C. oligocarpa的模式標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)其莖、葉柄、葉背面及花序梗上均被褐色節(jié)狀長柔毛，與中國以往被鑒定為C. oligocarpa的大多數(shù)標(biāo)本差異很大，遂將這類密被灰白色短柔毛的命名為白毛烏蘞莓C. albifoliaC. L. Li，并引用了浙江龍泉的標(biāo)本?！吨袊参镏尽返?8卷第2分冊[1]，除記載浙江產(chǎn)C. japonica、C. albifolia2種外，還有變種尖葉烏蘞莓C. japonicavar.pseudotrifolia(W. T. Wang) C. L. Li。鄭朝宗[7]在《浙江種子植物檢索鑒定手冊》中記載了C. japonica及其變種C. japonicavar.pseudotrifolia、C. albifolia及其變種C. albifoliavar.glabra(Gagnep.)C. L. Li、C. oligocarpa等3種。CHEN等[2]在Flora of ChinaVol. 12中，記載了浙江產(chǎn)C. japonica、C.albifolia、C. japonicavar.pseudotrifolia，將C. albifoliavar.glabra作為C. albifolia的異名。陳賢興等[8]報道了角花烏蘞莓Causonis corniculataGagnep.在浙江蒼南的分布新記錄。

近來，對葡萄科及廣義烏蘞莓屬的系統(tǒng)學(xué)研究表明：被廣泛接受并使用的CayratiaJuss. (中文以往稱烏蘞莓屬)和崖爬藤屬TetrastigmaPlanch.、葡萄甕屬Cyphostemma(Planch.) Alston構(gòu)成單系，但Cayratia本身并非單系[9]。Cayratia植物可以清楚地分為4支，除了擬烏蘞莓屬PseudocayratiaJ. Wen, L.M. Lu et Z. D. Chen接近崖爬藤屬外，還有3支分別是：烏蘞莓屬CausonisRaf. (約30種，分布于亞洲和大洋洲)、苦蘞莓屬AfrocayratiaJ. Wen, L. M. Lu, Rabarijaona et Z. D. Chen (7種，大部分產(chǎn)于非洲)和大麻藤屬Cayratia(約25種，分布于亞洲和大洋洲)[10?12]。因此，傳統(tǒng)使用的Cayratia現(xiàn)在被認為是廣義的，其狹義的所包含的種類浙江不產(chǎn)。WEN等[11]在發(fā)表新屬擬烏蘞莓屬Pseudocayratia時，認為浙江南部葉背具灰白色短柔毛的類型(作者引用的標(biāo)本為“章紹堯2 961”號)是新種美麗擬烏蘞莓P. specioseJ. Wen et L. M. Lu，但根據(jù)其描述，浙江原記載的C. albifoliavar.glabra實為白毛擬烏蘞莓P. pengianaHsu et J. Wen。在對浙江野生植物資源調(diào)查、采集和《浙江植物志(新編)》(第6卷)的編研過程中，作者對浙江的廣義烏蘞莓屬進行了文獻查閱、標(biāo)本采集、整理鑒定，同時結(jié)合莖葉毛被特征、種子形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(atpB-rbcL，trnC-petN，trnH-psbA和trnL-F)分析，除先期描述發(fā)表了3個新種外[13]，現(xiàn)將主要研究結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

用于莖、葉毛被特征觀察的9種9個樣品和種子形態(tài)觀察的6種6個樣品取自野外采集的標(biāo)本。樣品的憑證標(biāo)本信息見表1。DNA材料均取自野外采集經(jīng)硅膠干燥的葉片，憑證標(biāo)本保存于杭州師范大學(xué)植物標(biāo)本館(HTC)和浙江自然博物院植物標(biāo)本館(ZM)；部分用于系統(tǒng)發(fā)育分析的序列下載自GenBank(表2)，系統(tǒng)發(fā)育分析共涉及61種(包括種下等級) 73樣品(其中外類群4種4樣品)。

表1 材料來源Table 1 Source of materials

表2 用于系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的材料及各個基因的GenBank序列號Table 2 Species and their Genbank accession numbers of DNA sequences used in the phylegenetic study

表2(續(xù))Table 2 Continued

1.2 方法

1.2.1 莖、葉毛被觀察 莖、葉毛被特征用掃描電鏡觀察。9種共9個樣品材料取自采集的臘葉標(biāo)本，在標(biāo)本上取下健康成熟的莖段約5 mm長，葉片材料剪取葉片中部，大小約0.5 cm×0.5 cm。將所取的莖、葉材料直接粘貼于樣品臺上，置于噴金儀內(nèi)抽真空后濺射式噴金2 min，再置于KYKY-EM 3200掃描電鏡下觀察并攝像。

1.2.2 種子形態(tài)分析 觀察種子形態(tài)的共有6種，6個樣品。在對種子樣品觀察時，先剝?nèi)ス麑嵧夤?、果肉，取出種子，在清水中揉搓，去除膜質(zhì)層后晾干。每個種隨機取出10粒種子，測量大小(種子長度和寬度)，并在解剖鏡下觀察和描述種子的背面、腹面洼穴形態(tài)和橫切胚乳形狀，逐一記錄后拍照。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析 DNA提取和PCR擴增：取約0.1 g經(jīng)硅膠干燥的葉片，利用TIANGEN的植物基因組試劑盒(Plant Genomic DNA Kit)提取樣品總DNA，后保存于?20 ℃的冰箱中備用。選取4個葉綠體基因atpB-rbcL、trnC-petN、trnH-psbA和trnL-F進行系統(tǒng)發(fā)育分析，所用引物參考SOEJIMA等[14]、CHEN等[15]和 REN等[16]。PCR反應(yīng)體系為 25.0 μL，其中包括 12.5 μL 2×Reaction Mix，上下游引物各1.0 μL，1.0 μL 基因組 DNA，0.3 μL Golden DNA Polymerase (TIANGEN，中國)(2.5×16.67 mkat·L?1)和9.2 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)程序為：DNA模板94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s和72 ℃延伸1 min (37個循環(huán))，最后72 ℃總延伸5 min。凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，選取條帶明顯、單一的樣品送北京擎科生物公司雙向測序。

數(shù)據(jù)分析：用Lasergene中的SeqMan對測序產(chǎn)物進行拼合，后在MAFFT中比對序列并在BioEdit中進行手動調(diào)整和剪切，利用jModeltest分別計算4個葉綠體基因片段的最佳核苷酸模型(atpB-rbcL和trnL-F為GTR+I，trnC-petN和trnH-psbA為GTR+G)，利用SequenceMatrix將4個片段進行拼接。系統(tǒng)發(fā)育分析構(gòu)建了貝葉斯樹和最大似然(maximum likelihood, ML)樹，利用Mrbayes v3.2.6構(gòu)建貝葉斯樹，用MCMC (Markov chain Monte Carlo)算法搜索10 000 000代，每1 000代取1次樣，舍棄起始的2 500棵不穩(wěn)定樹(burn in為0.25)，并計算后驗概率(PP)。用門戶網(wǎng)站CIPRES工具箱中的RAxMLHPC BlackBox構(gòu)建ML樹，其中設(shè)置bootstraps為1 000，核苷酸替代模型為GTR+G+I。構(gòu)建完成的系統(tǒng)發(fā)育樹在FigTree中查看和編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖和葉的毛被

所觀察的浙江廣義烏蘞莓屬9種植物(烏蘞莓屬6種和擬烏蘞莓屬3種)莖和葉的毛被形態(tài)特征見圖1。莖上的毛被除了角花烏蘞莓無毛，文采烏蘞莓被多節(jié)長柔毛外，其他7種均疏被短柔毛。葉片背面的毛被，烏蘞莓、薄葉烏蘞莓、尖葉烏蘞莓、山地烏蘞莓、華東擬烏蘞莓等5種沿中脈和側(cè)脈疏被短柔毛，角花烏蘞莓為無毛，文采烏蘞莓則被多節(jié)長柔毛；美麗擬烏蘞莓葉片背面僅中脈和側(cè)脈密被伏生柔毛，而白毛擬烏蘞莓葉片背面密被開展柔毛?？梢?，莖和葉片背面的毛被在種間存在一定的差異。

圖1 浙江廣義烏蘞莓屬植物莖、葉的毛被形態(tài)Figure 1 Indumentum of stem and leaf of Cayratia s.l. in Zhejiang

2.2 種子形態(tài)

浙江烏蘞莓屬4種和擬烏蘞莓屬2種植物的種子形態(tài)和橫切胚乳形態(tài)特征如圖2及表3。所有種子背腹面外形均為寬倒卵形，大小有差異，最小的是文采烏蘞莓(3.88 ～4.20 mm×3.18 ～3.91 mm)，最大的是華東擬烏蘞莓(6.23 ～7.48 mm×5.30 ～5.94 mm)，屬內(nèi)(烏蘞莓屬4種間、擬烏蘞莓屬2種間)無顯著差異，但這2屬之間種子大小存在顯著差異(P＜0.05)。烏蘞莓屬4種的種子背面具明顯橫棱紋，但數(shù)目有差異，擬烏蘞莓屬2種的種子背面無橫棱紋；所有種的種子腹面具突出的中棱脊，兩側(cè)具洼穴。洼穴形狀和凹陷程度在屬間有差異。種子橫切面烏蘞莓屬4種植物為M型，而擬烏蘞莓屬2種為T型。

圖2 浙江廣義烏蘞莓屬植物的種子形態(tài)Figure 2 Seed morphology of Cayratia s.l. in Zhejaing

表3 浙江烏蘞莓屬和擬烏蘞莓屬6種植物種子形態(tài)Table 3 Seed morphology of six species of Causonis and Pseudocayratia from Zhejiang

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

聯(lián)合4個葉綠體基因片段總長度為3 478 bp，atpB-rbcL、trnC-petN、trnH-psbA和trnL-F分別為914、993、497和1 074 bp。構(gòu)建的貝葉斯樹和植物系統(tǒng)發(fā)育樹樹形一致，崖爬藤屬Tetrastigma、擬烏蘞莓屬Pseudocayratia、烏蘞莓屬Causonis、大麻藤屬Cayratia和苦蘞藤屬Afrocayratia均為單系類群并且有很高的支持率(后驗概率為1.00，自展值為100%)(圖3)。其中：浙江產(chǎn)崖爬藤屬、擬烏蘞莓屬和烏蘞莓屬3屬，在擬烏蘞莓屬支中。浙江所產(chǎn)3種為美麗擬烏蘞莓、白毛擬烏蘞莓和華東擬烏蘞莓，美麗擬烏蘞莓2個個體和白毛擬烏蘞莓2個個體組成1支(后驗概率為0.97，自展值為74%)，但在支內(nèi)兩者無法區(qū)分；在烏蘞莓屬中，浙江有6種：薄葉烏蘞莓、烏蘞莓、尖葉烏蘞莓、文采烏蘞莓、山地烏蘞莓和角花烏蘞莓，薄葉烏蘞莓的3個個體、烏蘞莓8個個體和尖葉烏蘞莓2個個體組成1支(后驗概率為1.00，自展值為97%)，但在支內(nèi)三者混雜，無法區(qū)分。

圖3 基于4個葉綠體基因片段的廣義烏蘞莓屬植物系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Maximum likelihood tree for Cayratia s.l. based on the combined chloroplast data sets

3 討論與結(jié)論

3.1 形態(tài)特征的系統(tǒng)分類學(xué)意義

莖和葉的毛被是以往廣義烏蘞莓屬分類的重要依據(jù)之一[1?2]。對浙江烏蘞莓屬和擬烏蘞莓屬9植物的莖、葉毛被掃描電鏡觀察結(jié)果顯示：其毛被較為穩(wěn)定，其葉片背面沿脈的毛被在種間具有差異，分別疏被短柔毛(烏蘞莓、山地烏蘞莓、薄葉烏蘞莓、尖葉烏蘞莓和華東擬烏蘞莓)、多節(jié)長柔毛(文采烏蘞莓)、無毛(角花烏蘞莓)、密被柔毛(白毛擬烏蘞莓和美麗擬烏蘞莓)，可見毛被特點在近似種之間具有可區(qū)別的差異，如角花烏蘞莓和文采烏蘞莓、美麗擬烏蘞莓和華東擬烏蘞莓之間，但烏蘞莓屬和擬烏蘞莓屬之間尚無法判斷是否存在差異。

種子形態(tài)是廣義烏蘞莓屬分亞屬(或組)的重要依據(jù)[1?2]，是分屬的重要依據(jù)[10–13]。所觀察的浙江6種植物而言，烏蘞莓屬和擬烏蘞莓屬之間在種子大小、背面是否具橫棱紋、腹面洼穴形態(tài)和種子橫切面形態(tài)存在本質(zhì)區(qū)別，可以作為這2個屬的區(qū)別特征。

除了毛被類型、種子形態(tài)外，小葉片數(shù)目、葉緣鋸齒數(shù)目與形態(tài)，葉柄、小葉柄長短，卷須分枝數(shù)目，花瓣先端形態(tài)等常作為分種(或變種)的依據(jù)[1?4,7]。值得注意的是，烏蘞莓屬植物花序均為上舉，但果序有上舉與下垂2類，果序總梗、果梗的顏色有紅色與綠色2類，果實成熟前的顏色變化有由紅色轉(zhuǎn)黑色、由綠色轉(zhuǎn)黑色、由綠色轉(zhuǎn)白色、淡藍紫色轉(zhuǎn)黑色等類型；花盤的顏色在初花時至花后期也會發(fā)生變化；種子新鮮時和壓干制作標(biāo)本以后的形狀變化。以上形態(tài)性狀在標(biāo)本室難以觀察，故而也是臘葉標(biāo)本容易被誤定的主要原因。

3.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究對屬種的界定

本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析和以往研究結(jié)果一致，均證實了崖爬藤屬、擬烏蘞莓屬、烏蘞莓屬、大麻藤屬和苦蘞藤屬為單系類群，承認了這些屬的獨立地位[10?12]。以往認為：浙江產(chǎn)的廣義烏蘞莓屬植物現(xiàn)分為2屬：擬烏蘞莓屬和烏蘞莓屬，前者現(xiàn)知3種，分別為美麗擬烏蘞莓、白毛擬烏蘞莓和華東擬烏蘞莓，其中美麗擬烏蘞莓和白毛擬烏蘞莓在系統(tǒng)發(fā)育樹上親緣關(guān)系最近且無法區(qū)分，但在形態(tài)上后者葉柄、小葉柄、小葉片背面(至少中、側(cè)脈上)均密被灰白色開展柔毛，有一定的區(qū)別，莖葉毛被作為種下等級處理較為合適。烏蘞莓屬有6種，其中尖葉烏蘞莓和薄葉烏蘞莓在系統(tǒng)發(fā)育樹上與烏蘞莓無法區(qū)分開，但在形態(tài)上，尖葉烏蘞莓小葉3 (稀4或5)，中央小葉片具4 ～7對側(cè)脈，邊緣每側(cè)有2 ～9 (12)淺鈍齒，卷須不分枝(稀2分枝)，花盤黃色，花后轉(zhuǎn)白色；而薄葉烏蘞莓花盤黃色，花后轉(zhuǎn)白色，果實幼時中上部常縊縮，呈乳頭狀、倒梨形或葫蘆形，與烏蘞莓有明顯區(qū)別。

3.3 分類處理

綜合考慮形態(tài)特征、種子形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等多方面的證據(jù)，將薄葉烏蘞莓和白毛擬烏蘞莓分別作為烏蘞莓和美麗烏蘞莓的亞種處理，尖葉烏蘞莓歸屬發(fā)生改變，故作出如下組合。

3.3.1 薄葉烏蘞莓Causonis japonica(Thunb.) Raf. subsp.tenuifolia(Wight et Arn.) X. F. Jin et Z. H. Chen,comb. et stat. nov. ?Vitis tenuifoliaWight et Arn.,Prodr Fl Ind Orient,1834, 1：129. ?Cayratia tenuifolia(Wight et Arn.) Gagnep.,Notul Syst(Paris), 1911, 1：348.

《中國植物志》第48卷第2分冊[1]未對薄葉烏蘞莓作處理，而CHEN等[2]在Flora of China中將其處理為烏蘞莓的異名。從形態(tài)上看，薄葉烏蘞莓的花盤黃色，花后轉(zhuǎn)白色，果實幼時中上部常縊縮，呈乳頭狀、倒梨形或葫蘆形；烏蘞莓的花盤橙黃色，花后通常變?yōu)榉奂t色，漿果近球形。薄葉烏蘞莓主要分布在浙江濱海地區(qū)，烏蘞莓主要為山地分布。從系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹上看，薄葉烏蘞莓的3個個體嵌套于烏蘞莓的個體之中。本研究認為將薄葉烏蘞莓作為烏蘞莓的亞種處理較合適。

3.3.2 尖葉烏蘞莓Causonis japonica(Thunb.) Raf. subsp.pseudotrifolia(W. T. Wang) Z. H. Chen, Y. F. Lu et X. F. Jin, comb. et stat. nov. ——Cayratia pseudotrifoliaW. T. Wang,Acta Phytotax Sin, 1979, 17(3)：79. ——Cayratia japonica(Thunb.) Gagnep. var.pseudotrifolia(W. T. Wang) C. L. Li,Chin J Appl Environ Biol, 1996,2(1)：51.

王文采[3]在發(fā)表新種尖葉烏蘞莓時，明確指出其為葉片3小葉，有時可為4或5小葉。李朝鑾[6]將其作為烏蘞莓的變種處理，CHEN等[2]也采納這個觀點。從浙江的材料來看，小葉3，稀4或5，中央小葉片具4 ～7對側(cè)脈，邊緣每側(cè)具2 ～9 (12)個淺鋸齒，卷須不分枝，稀具2分枝，花盤黃色，花后變?yōu)榘咨?；烏蘞莓的鳥足狀復(fù)葉具5小葉，中央小葉片具5 ～9對側(cè)脈，邊緣每側(cè)具6 ～12 (15)個鋸齒，卷須具2或3分枝，花盤橙黃色，花后通常變?yōu)榉奂t色。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示尖葉烏蘞莓的2個個體也嵌套于烏蘞莓種，故作為亞種處理，并作了轉(zhuǎn)隸組合。

3.3.3 白毛擬烏蘞莓Pseudocayratia speciosaJ. Wen et L. M. Lu subsp.pengiana(T. W. Hsu et J. Wen) Z.H. Chen, Y. F. Lu et X. F. Jin, comb. et stat. nov. ——P. pengianaT. W. Hsu et J. Wen,J Syst Evol, 2018, 56：378.

WEN等[11]在建立新屬擬烏蘞莓屬時，共收錄了2個新種和3個新組合種，認為新種P. pengiana與另一新種P. speciosa的區(qū)別在于葉片背面均被短柔毛，沿脈尤密。這與本研究所觀察的完全一致(包括掃描電鏡結(jié)果)。但當(dāng)時系統(tǒng)發(fā)育分析時，P. pengiana僅1個個體，與本次研究結(jié)果不同。本研究增加了浙江的P. pengiana和P. speciosa各1個個體后發(fā)現(xiàn)，兩者在系統(tǒng)樹上無法區(qū)分。因此，將P. pengiana作為P. speciosa的亞種更為合理。

4 致謝

杭州植物園教授級高級工程師裘寶林先生指導(dǎo)并審閱全文，浙江清涼峰國家級自然保護區(qū)高級工程師張宏偉先生、代英超女士協(xié)助采集標(biāo)本。在此一并致謝！