孟超敏，耿翡翡，卿桂霞，周佳敏，張富厚，劉逢舉

（1. 河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471000；2. 河南科技大學(xué) 洛陽市作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471000；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽 455000）

無機(jī)磷酸鹽(inorganic phosphates, Pi)的消耗是影響全球植物生長(zhǎng)的嚴(yán)重問題[1]。所有生物體的生命都依賴于脂質(zhì)雙層細(xì)胞膜的存在，該膜將細(xì)胞內(nèi)部與環(huán)境分開，單乳糖基和二乳糖基二?；视?分別為MGDG和DGDG)構(gòu)成植物葉綠體中膜脂質(zhì)的大部分[2]。膜脂質(zhì)重塑是植物用來在Pi耗盡條件下生存的防御機(jī)制[3]。在Pi饑餓期間，磷脂被降解為Pi提供其他必需的生物過程，而質(zhì)體中的半乳糖脂合成通過單半乳糖基二?；视秃厦?(MGD3)的轉(zhuǎn)錄激活上調(diào)[4]。在擬南芥Arabidopsis thaliana中，已經(jīng)鑒定出3種功能性MGD合成酶(MGD1，MGD2和MGD3)，并根據(jù)其氨基酸身份將其分為A型(MGD1)和B型(MGD2和MGD3)酶[5?6]。A型和B型酶在特異性、亞細(xì)胞定位和基因表達(dá)譜方面存在一些差異，A型酶定位于質(zhì)體的內(nèi)膜，而B型酶定位于質(zhì)體外膜。在這三者中，MGD1是葉綠體中最豐富的亞型。MGD1的表達(dá)在光合組織中廣泛存在，而MGD2和MGD3的表達(dá)在根等非光合組織中特異性檢測(cè)到，在綠色組織中很少檢測(cè)到[7]。2種類型的MGD酶對(duì)于植物在低磷酸鹽條件下的生存至關(guān)重要，但尚未報(bào)道對(duì)MGD基因分歧的詳細(xì)分析。這些基因?qū)τ谥参镞m應(yīng)磷素缺乏癥可能是必不可少的。

棉花Gossypium是一種油籽和纖維作物，在全球70多個(gè)國(guó)家種植，在全球經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要作用[8?10]。然而，棉花的生長(zhǎng)和生產(chǎn)力受到非生物和生物脅迫[11]。磷是核酸的主要組成部分，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和代謝過程中極為重要，是細(xì)胞分裂和根系生長(zhǎng)不可缺少的，低磷脅迫不利于作物生長(zhǎng)發(fā)育[12?16]。因此，研究低磷脅迫的分子適應(yīng)機(jī)制和加強(qiáng)抗逆性對(duì)棉花生產(chǎn)至關(guān)重要。張學(xué)昕等[17]通過田間試驗(yàn)對(duì)不同施磷處理下的棉花各時(shí)期取樣進(jìn)行養(yǎng)分和產(chǎn)量分析表明：當(dāng)其他條件一定時(shí)，隨著施磷量的遞增，棉株的單株鈴數(shù)以及單鈴質(zhì)量也會(huì)隨之增加，從而實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)的目標(biāo)。王剛等[18]研究發(fā)現(xiàn)：棉株地上和地下兩部分的干物質(zhì)都隨有效磷含量的增加而增加，根冠比則隨其增加而降低。通過有效磷含量影響糖類物質(zhì)的合成轉(zhuǎn)化以及棉株葉綠素含量，進(jìn)而作用于整個(gè)棉株的生長(zhǎng)。劉耘華等[19]研究表明：施用有機(jī)肥能夠增加土壤有效磷含量，除了有機(jī)肥中有一部分磷素之外，還可以促進(jìn)有效磷的轉(zhuǎn)化。磷素與有機(jī)肥混合施用對(duì)土壤磷庫(kù)、棉花產(chǎn)量和磷素吸收量都會(huì)產(chǎn)生積極影響。

本研究以前期研究篩選出的磷高效棉花品種陸地棉‘新陸早19’Gossypium hirsutum‘Xinluzao 19’為材料，克隆了GhMGD3基因，采用生物信息學(xué)工具分析其編碼蛋白理化性質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)特性分析，旨在為深入解析棉花GhMGD3基因的生物學(xué)功能提供科學(xué)參考，并為培育磷高效利用的棉花新品種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

陸地棉‘新陸早19’種植在河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院大田，不施加磷肥。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，采集根、莖、葉、花，用于分析GhMGD3基因在植株4個(gè)組織中的表達(dá)狀況。

將‘新陸早19’種子播種于含干凈濕潤(rùn)細(xì)沙的塑料盆內(nèi)，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，光照14 h/黑暗10 h，培養(yǎng)至棉苗三葉期，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的幼苗移至水培盆中，用1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)1周后分為2 個(gè)處理水平，即適磷處理 (SP，1.00 mmol·L?1)和低磷處理 (LP，0.01 mmol·L?1)，磷源采用 KH2PO4，為保證K+的濃度一致，以1.0 mmol·L?1為標(biāo)準(zhǔn)，低磷營(yíng)養(yǎng)液中以KCl補(bǔ)齊K+，其他營(yíng)養(yǎng)成分含有2 mmol·L?1Ca(NO3)2·4H2O、2.5 mmol·L?1KNO3、0.5 mmol·L?1NH4NO3、1.4 mmol·L?1MgSO4·7H2O、1.0×10?3mmol·L?1ZnSO4·7H2O、1.0×10?3mmol·L?1MnSO4·H2O、0.1×10?3mmol·L?1CuSO4·5H2O、0.01 mmol·L?1H3BO3、0.05×10?4mmol·L?1(NH4)6MO7O24·4H2O、0.1 mmol·L?1EDTA-FeNa[20]。分別處理 0、4、12、24、72 h后，選取3株生長(zhǎng)一致的棉花植株，并混合取其根部組織，然后迅速置于液氮中，?80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ咳照{(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)液pH 6.5，3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)前期陸地棉根部低磷脅迫基因表達(dá)譜芯片差異表達(dá)基因序列進(jìn)行分析，在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)網(wǎng)站的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索差異表達(dá)基因序列，得到該基因的相似序列，將所得相似性序列(覆蓋率＞50%，相似度＞90%)使用DNASTAR的Seqman進(jìn)行拼接得到重疊群，將所得序列繼續(xù)檢索與拼接直至沒有新的相似序列出現(xiàn)，所得即為結(jié)果序列conting，利用ORFfinder在線平臺(tái)查找開放閱讀框，進(jìn)行目標(biāo)基因GhMGD3的克隆與分析。根據(jù)ORFfinder在線平臺(tái)查找的開放閱讀框，使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程有限公司合成，見表1。

表1 引物信息Table 1 Primers used in the study

1.3 基因組DNA的克隆

1.3.1 基因組DNA的提取 取液氮速凍整株植株后在研缽中迅速研磨成粉末轉(zhuǎn)移至離心管，利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取基因組DNA，向其中添加200 μL的TE緩沖液溶解后置于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因克隆與測(cè)序 以基因組DNA為模板設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)，冰上操作：2×M5 藍(lán)色染料高保真Taq酶 10.0 μL，上游引物 (10 μmol·L?1)0.5 μL，下游引物 (10 μmol·L?1) 0.5 μL，模板 DNA 0.5 μL，無核酸酶 ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃3 min；94 ℃ 25 s，53 ℃ 25 s，72 ℃ 40 s，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃ 低溫保存。120 V，25 min，質(zhì)量濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的DNA片段進(jìn)行膠回收純化后連接pTOPO-T載體，具體體系為 (10 μL)：M5 HiPer pTOPO-TA Vector 1.0 μL，10×增強(qiáng)劑 1.0 μL，純化后的 PCR 產(chǎn)物 3.9 μL，滅菌水4.1 μL。取5.0 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50.0 μL大腸埃希菌Escherichia coliDH5ɑ 感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)4 h。以所得菌液作模板進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)，體系如下(20 μL)：2×M5 藍(lán)色染料高保真Taq酶10.0 μL，通用引物M13F 0.5 μL，通用引物M13R 0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，無核酸酶ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序與以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系相同。檢測(cè)符合后送至生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4 cDNA的克隆

1.4.1 總RNA的提取及cDNA的合成 取液氮速凍整株‘新陸早19’植株后在研缽中迅速充分研磨成粉末，后續(xù)步驟依照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書提取RNA，150 V，15 min，質(zhì)量濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。參考HiScript? cDNA一鏈合成試劑盒說明書完成cDNA一鏈的合成，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 基因克隆與測(cè)序 以‘新陸早19’的cDNA為模板設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)，冰上操作：2×M5藍(lán)色染料高保真Taq酶 10.0 μL，上游引物 (10 μmol·L?1) 0.5 μL，下游引物 (10 μmol·L?1)0.5 μL，cDNA 1.0 μL，無核酸酶 ddH2O 8.0 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；94 ℃ 25 s，56 ℃ 25 s，72 ℃ 35 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃低溫保存。120 V，25 min，質(zhì)量濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的DNA片段進(jìn)行膠回收純化后連接pTOPO-T載體，體系(5 μL)如下：M5 HiPer pTOPO-TA Vector 0.5 μL，10×增強(qiáng)劑 0.5 μL，純化后的 PCR 產(chǎn)物 1.5 μL，滅菌水 2.5 μL。取 5 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μL大腸埃希菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后隨機(jī)挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)，電泳檢測(cè)符合后送至生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

使用在線平臺(tái)及軟件對(duì)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)分析基因的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等。

1.6 半定量RT-PCR

利用半定量RT-PCR技術(shù)，分析GhMGD3基因在根、莖、葉、花中的表達(dá)狀況。以各組織的cDNA為模板，GhACTIN作內(nèi)參基因，所用引物見表1。設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)，冰上操作：2×M5 藍(lán)色染料高保真Taq酶 10.0 μL，GhMGD3-F(10 μmol·L?1) 0.5 μL，GhMGD3-R(10 μmol·L?1) 0.5 μL，cDNA 1.0 μL，無核酸酶 ddH2O 8.0 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；94 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃低溫保存。120 V，25 min，質(zhì)量濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)技術(shù)檢測(cè)GhMGD3基因在不同組織中及低磷脅迫處理下的表達(dá)模式。以GhACTIN作為內(nèi)參基因，所用引物見表1。采用SYBR? Green ProTaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒進(jìn)行熒光定量，使用的熒光定量PCR儀器型號(hào)是CFX96，數(shù)據(jù)分析采用 2???Ct法，用Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷脅迫差異表達(dá)序列延伸

利用前期低磷脅迫差異表達(dá)序列為探針，共檢索發(fā)現(xiàn)并下載了8條相似序列，利用DNASTAR將所得序列全部進(jìn)行拼接，得到了一個(gè)新的conting重疊群，序列長(zhǎng)度為1 276 bp。

2.2 GhMGD3基因的克隆

根據(jù)GhMGD3基因的編碼序列(coding sequence，CDS)設(shè)計(jì)特異性引物，以植株的DNA和cDNA為模板，克隆得到GhMGD3基因的CDS(圖1)，其條帶符合目的條帶大小。通過無縫克隆連接到pTOPO-T載體上，挑選陽性克隆測(cè)序。獲得DNA序列1 040 bp左右(泳道1)與conting序列的一致性較高，為93.14%。獲得cDNA序列780 bp左右(泳道2)與conting序列比對(duì)一致性為99.43%。開放閱讀框?yàn)殚L(zhǎng)度為681 bp，共編碼226個(gè)氨基酸。該基因GhMGD3是MGD家族成員。

圖1 GhMGD3基因編碼序列的克隆Figure 1 Cloning of GhMGD3 CDS

2.3 GhMGD3基因結(jié)構(gòu)分析

將DNA測(cè)序結(jié)果序列與cDNA測(cè)序結(jié)果的最大開放閱讀框序列導(dǎo)入Gene Structure Display Server 2.0對(duì)該基因組序列與編碼序列進(jìn)行分析，表明該基因編碼序列包含5′與3′端非編碼序列，含有3個(gè)內(nèi)含子，4個(gè)外顯子(圖2)。

圖2 GhMGD3基因結(jié)構(gòu)分析Figure 2 GhMGD3 gene structure analysis

2.4 生物信息學(xué)分析

2.4.1GhMGD3基因編碼蛋白的理化參數(shù)及疏水性 將基因編碼蛋白導(dǎo)入ExPASy-ProtParam tool在線軟件，分析可知GhMGD3共編碼了226個(gè)氨基酸，編碼蛋白的分子式是C1201H1832N328O333S13，脂肪族氨基酸指數(shù)是76.28，分子量是26 610.54 Da，等電點(diǎn)為8.74，屬于堿性蛋白。其中纈氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占比最大，為8.4%，共19個(gè)。在該蛋白中帶正電荷的氨基酸有30個(gè)，另外有26個(gè)帶負(fù)電荷。氨基酸組分會(huì)直接影響蛋白的親疏水性，總親水性平均系數(shù)為?0.471，不穩(wěn)定系數(shù)是37.83，是親水性穩(wěn)定蛋白。ProtScale analysis在線軟件顯示此蛋白中精氨酸親水性最強(qiáng)，親水指數(shù)為?4.500，異亮氨酸疏水性最強(qiáng)，親水指數(shù)為+4.500。

2.4.2GhMGD3基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位 在NPS@：SOPMA secondary structure prediction網(wǎng)站預(yù)測(cè)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中占比最大的無規(guī)則卷曲占39.38%，包含89個(gè)氨基酸，其次是α-螺旋，占比為34.96%，包含79個(gè)氨基酸；此外此蛋白還含有延伸鏈(extended strand)和β-轉(zhuǎn)角(beta turn)，其中延伸鏈占比相比較多，占比21.24%，有48個(gè)氨基酸，β-轉(zhuǎn)角僅有10個(gè)氨基酸，占比4.42%，是最少的。表明此蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋和無規(guī)則卷曲占據(jù)主體地位所組成。由于無規(guī)則卷曲占比較多，預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。運(yùn)用TMHMM-2.0分析該基因所編碼蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白，226個(gè)氨基酸并未形成跨膜螺旋區(qū)。通過SignalP-5.0進(jìn)行信號(hào)肽分析可知：此基因編碼蛋白有信號(hào)肽的概率是0.001 6，其他的可能性則高達(dá)0.998 4。226位氨基酸中并未出現(xiàn)典型的信號(hào)肽趨勢(shì)，即該蛋白不存在信號(hào)肽。在線網(wǎng)站內(nèi)輸入基因編碼序列進(jìn)行基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)定位在葉綠體，該蛋白可能在葉綠體發(fā)揮作用。

2.4.3GhMGD3 基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過SWISS-MODEL Interactive Workspace進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖3所示：QMEAN值為0.60，GMQE值為0.12，預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)與單半乳糖基二?；视秃厦赶嗨?，與擬南芥半乳糖脂合酶MGD1的結(jié)構(gòu)類似。蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致，均以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主體。

圖3 GhMGD3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果Figure 3 Predicted three-dimension structure of GhMGD3 protein

將獲得的基因編碼序列提交到STRING 11.0在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)該基因可能的互作網(wǎng)絡(luò)，分析結(jié)果顯示：此基因編碼蛋白能夠預(yù)測(cè)到蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，因此預(yù)測(cè)該基因可能是通過多個(gè)蛋白互作進(jìn)行調(diào)控。糖基化對(duì)蛋白穩(wěn)定及功用均會(huì)產(chǎn)生極其重要的影響。將獲得的基因編碼序列提交到NetNGlyc 1.0在線軟件可知：該蛋白不存在N-糖基化位點(diǎn)。磷酸化位點(diǎn)與蛋白的功能、結(jié)構(gòu)都有很大的關(guān)系，通過NetPhos 3.1在線網(wǎng)站分析：此蛋白中占比最大的是絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，而酪氨酸占比較少。它除了可以調(diào)控蛋白的活性以外，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中也占據(jù)了重要的位置。

2.4.4 GhMGD3 蛋白氨基酸序列同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹 使用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(CDD-search)查找此氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示：該基因所編碼蛋白匹配所屬的超家族是PLN02605，是一類包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域的模型。經(jīng)與其他物種MGD家族同源蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)(圖4)，該基因存在1個(gè)MGD家族特有的保守結(jié)構(gòu)域(圖4紅框所示)，說明該基因?qū)儆陉懙孛轒GD家族成員。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)利用BLASTp檢索氨基酸序列的同源序列，下載了11條不同物種的蛋白序列：雷公藤Tripterygium wilfordii、擬南芥、可可樹Theobroma cacao、芒果Mangifera indica、千金榆Carpinus fangiana、木槿Hibiscus syriacus、榴蓮Durio zibethinues、核桃Juglans regia、橡膠樹Hevea brasiliensis、開心果Pistacia vera、楊梅Morella rubra。通過軟件MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)，棉花蛋白序列與木槿親緣關(guān)系最近，其次是榴蓮、可可樹，與其余物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 GhMGD3與其他物種MGD家族同源蛋白的多序列比對(duì)分析結(jié)果Figure 4 Multi-alignment of GhMGD3 amino acid sequence with other MGD family in different plants

圖5 GhMGD3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure 5 GhMGD3 Phylogenetic tree analysis

2.5 半定量RT-PCR分析與低磷脅迫處理下的基因相對(duì)表達(dá)量分析

以棉花的GhACTIN為內(nèi)參基因，通過半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)GhMGD3基因在‘新陸早19’的4個(gè)組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。從圖6可知：該基因高表達(dá)于根，微量表達(dá)于葉和花，中量表達(dá)于莖。利用qPCR檢測(cè)GhMGD3基因在陸地棉‘新陸早19’植株的根、莖、葉、花等4個(gè)組織中的表達(dá)結(jié)果(圖7A)同半定量RT-PCR一致。由圖7B可以看出：在低磷脅迫下4 ～24 h，表達(dá)量逐漸下調(diào)，但是與適磷處理相比，其表達(dá)量都相對(duì)較高，且在低磷處理72 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，其中12和72 h時(shí)低磷處理比適磷處理顯著表達(dá)(P＜0.05)，說明該基因在受到低磷脅迫的刺激后，能夠?qū)Φ土酌{迫作出應(yīng)答反應(yīng)。

圖6 半定量RT-PCR分析GhMGD3在棉花不同組織中的表達(dá)Figure 6 Expression of GhMGD3 in different tissues of cotton by semiquantitative RT-PCR

圖7 GhMGD3基因在不同組織(A)及低磷脅迫處理下(B)的表達(dá)模式Figure 7 Expression analysis of GhMGD3 in different tissues (A) and low phosphorus stress (B)

3 討論與結(jié)論

大部分脂質(zhì)由非磷且不帶電荷的半乳糖甘油脂類單半乳糖基二?；视?MGDG)和二半乳糖基二?；视?DGDG)組成，它們占總脂質(zhì)的80%。單半乳糖基二?；视褪琴|(zhì)體的生物活動(dòng)以及光合活性所需的主要和必需的植物脂質(zhì)，這需要富含半乳糖脂的環(huán)境。MGDG也是二半乳糖基二?；视?DGDG)的關(guān)鍵前體，它在磷酸鹽脅迫下轉(zhuǎn)移到質(zhì)體膜外。因此，MGDG的合成對(duì)植物至關(guān)重要。大部分MGDG是由位于質(zhì)體膜上的MGDG合酶合成的[21]。盡管植物組織中磷含量之間的平衡可能對(duì)植物生長(zhǎng)很重要，但細(xì)節(jié)仍然未知。

擬南芥mgd3和mgd2mgd3突變體在磷脅迫下植物會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的生長(zhǎng)遲緩和DGDG含量降低，清楚地表明MGD3介導(dǎo)的MGDG合成在磷稀缺時(shí)對(duì)生存具有重要作用[22]。史中惠等[23]將OsMGD基因轉(zhuǎn)入煙草Nicotiana tobacum植株得到了超表達(dá)OsMGD基因煙草植株，通過低磷脅迫下各生理生化指標(biāo)變化情況的分析表明：該基因可以提高磷脂與半乳糖脂的含量，進(jìn)一步增強(qiáng)植株耐低磷的特性。MGDG僅存在于質(zhì)體中，但DGDG可以存在于非質(zhì)體膜中，在特定條件下，例如磷脅迫下，它可以替代磷脂[24]。半乳糖脂被認(rèn)為在種子萌發(fā)過程中原層體向類囊體膜的光依賴性轉(zhuǎn)化以及響應(yīng)光變化的高度堆疊的顆粒膜和光合機(jī)制的動(dòng)態(tài)組織中發(fā)揮重要作用[25]。MGDG和DGDG還可以穩(wěn)定葉綠體中的光系統(tǒng)蛋白復(fù)合物[26?27]。在磷脅迫的條件下，植物激活體內(nèi)相關(guān)的機(jī)制，以應(yīng)對(duì)細(xì)胞對(duì)環(huán)境條件變化的需求。

本研究所得基因序列與擬南芥中的MGD家族中的單半乳糖基二?；视秃厦竿葱暂^高，從陸地棉‘新陸早19’中克隆得到了1個(gè)MGD3類似基因，并將其命名為GhMGD3，該基因?qū)儆贛GD超家族成員。該基因存在3個(gè)內(nèi)含子，GhMGD3蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為26 610.54 Da，等電點(diǎn)為8.74，是堿性蛋白，具備穩(wěn)定性與親水性。此蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋和無規(guī)則卷曲占據(jù)主體地位所組成，通過同源建?？芍摶蛉?jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)與擬南芥半乳糖脂合酶MGD1結(jié)構(gòu)相似。該基因編碼蛋白不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。該蛋白不存在潛在的N-糖基化位點(diǎn)，但含有多個(gè)酸化位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該基因編碼蛋白在葉綠體中，預(yù)測(cè)其能夠通過蛋白質(zhì)的相互作用參與調(diào)控?；虮磉_(dá)分析結(jié)果表明：該基因在棉花根中的表達(dá)量是最大的，中量表達(dá)于莖，微量表達(dá)于葉和花，在低磷脅迫72 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高值。GhMGD3基因可能在根系發(fā)揮作用，在棉花的磷高效利用信號(hào)調(diào)控過程中具有重要的作用。