王倩清，張毓婷，張俊紅，劉 慧，童再康

（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

不同樹種木材的天然耐腐性差異大，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年全球因木材腐朽造成的損失占采伐利用木材的10%以上，嚴(yán)重影響木材的加工利用[1]。木材腐朽主要由腐朽菌和變色菌等真菌侵蝕木材細(xì)胞所引起，而木材的天然耐腐性則依靠自身代謝物的生物殺菌、抑菌活性來實(shí)現(xiàn)[2]。閩楠Phoebe bournei為樟科Lauraceae楠屬Phoebe植物，是中國(guó)特有的珍稀用材與綠化樹種。楠木具有極強(qiáng)耐腐性，陰沉木歷經(jīng)千年不腐，被譽(yù)為“木中之玉”，市場(chǎng)俗稱“金絲楠烏木”[3]。閩楠和楨楠Phoebe zhennan作為“金絲楠木”最主要的產(chǎn)材樹種，樹干挺拔，木材顏色呈淡黃色，堅(jiān)硬細(xì)密，紋理美觀具有芳香香氣，屬上等家具良材[4]。因此，閩楠可作為研究木材天然耐腐性的良好材料，閩楠全基因組測(cè)序的完成為基因挖掘和功能研究提供了重要基礎(chǔ)。

已有研究發(fā)現(xiàn)：從木材分離的木脂素(lignan)類化合物具有抗菌活性，參與植物防御系統(tǒng)，增強(qiáng)木材耐久性和抗真菌能力。例如北美喬柏Thuja plicata心材中提取的木脂素通過清除自由基和螯合亞鐵來干擾真菌氧化還原循環(huán)提高木材耐腐性[5]，南洋杉Araucaria araucana中提取的松脂素(pinoresinol)和開環(huán)落葉松脂素(secoisolariciresinol)對(duì)木材腐朽菌具有較好抗性[6]。然而，關(guān)于木脂素生物合成調(diào)控途徑尚不明確，從而限制其深入研究與生產(chǎn)應(yīng)用。

松脂素還原酶Pinoresinol-lariciresinol reductase(PLR)是一種編碼松脂醇的落葉松脂素還原酶基因，屬木脂素生物合成的關(guān)鍵酶，一分子松脂素在PLR松脂素-落葉松脂素還原酶作用下經(jīng)兩步還原成落葉松脂素和異落葉松脂素，也是木脂素生物合成途徑中重要限速步驟之一。目前已從模式植物擬南芥Arabidopsis thaliana[7]和富含木脂素的植物(連翹Forsythia suspense[8?9]、菘藍(lán)Isatis indigotica[10]、亞麻屬Linum[11?13])中克隆得到PLR基因。迄今為止，所有以重組純化蛋白為特征的PLR均可以將松脂素還原為落葉松樹脂素以及將落葉松樹脂素還原為異落葉松樹脂素，但AtPrR1對(duì)落葉松樹脂素的活性比松脂素低約35倍，AtPrR2對(duì)作為底物的落葉松樹脂素完全沒有催化活性。因此，MIN等[14]將它們命名為松脂醇還原酶，而不是松脂醇-落葉松樹脂醇還原酶。PLR的表達(dá)受激素的調(diào)控，不同物種在不同激素處理下松脂醇-落葉松樹脂醇還原酶的表達(dá)模式有所不同。在脫落酸(ABA)處理下，LuPLR1的表達(dá)增強(qiáng)，LuPLR1的表達(dá)似乎是由在種子成熟和休眠中起關(guān)鍵作用的植物激素ABA觸發(fā)的[12?13]。所以赤霉酸(GA)對(duì)LuPLR1的表達(dá)具有相反的調(diào)節(jié)作用[13]。在茉莉酸甲酯(MeJA)的處理下，LuPLR2的表達(dá)量有明顯提高，因?yàn)閬喡樵贛eJA處理和傷害后，LuPLR2基因表達(dá)和葉酸蛋白產(chǎn)量增加，這與這些木脂素參與植物防御反應(yīng)一致。本研究選擇耐腐性強(qiáng)的閩楠解析木脂素合成重要限速酶PLR基因，利用閩楠基因組數(shù)據(jù)，對(duì)PLR基因家族成員進(jìn)行鑒定和基因結(jié)構(gòu)、保守基序及染色體定位分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹預(yù)測(cè)閩楠PLR(PbPLR)催化酶的立體選擇性，為進(jìn)一步研究PbPLR基因在閩楠木脂素合成過程中的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 閩楠PLR基因家族成員鑒定

采用BLAST和hmmsearch鑒定閩楠PLR家族成員。首先在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載擬南芥PLR家族蛋白序列，通過BLASTP同源比對(duì)檢索，用HMMER 3.1軟件[15]搜索閩楠PLR基因家族的候選序列。搜索獲得的基因成員在人工篩選后提交至SMART數(shù)據(jù)庫(kù)[16]確認(rèn)保守結(jié)構(gòu)域，確定PLR基因成員，并依據(jù)染色體位置進(jìn)行命名。

1.2 PbPLR基因染色體定位與基因復(fù)制分析

采用MapChart軟件繪制PbPLR基因在閩楠基因組上的位置信息，并利用MCScanX軟件分析PbPLR基因的共線性區(qū)域和復(fù)制情況。

1.3 PbPLR基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析

根據(jù)PbPLR基因編碼區(qū)序列和基因組序列，采用在線GSDS (http：//gsds.gao-lab.org)分析PbPLR基因結(jié)構(gòu)。并通過在線工具M(jìn)EME Suite (http：//meme-suite.org/)分析PbPLR氨基酸序列中保守基序，設(shè)置保守基序個(gè)數(shù)為20。最后利用SnapGene軟件進(jìn)行PbPLR蛋白序列比對(duì)。

1.4 PbPLR家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及聚類分析

利用植物蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)下載的擬南芥、亞麻、臺(tái)灣杉Taiwania cryptomerioides等物種PLR蛋白序列，與PbPLR家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用MEGA X軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，采用鄰接法(neighbor-joining method，NJ)，重復(fù)1 000次(Bootstrap為1 000)，利用在線工具ITOL (https：//itol.embl.de/)美化MEGA X軟件輸出的進(jìn)化樹。

1.5 PbPLR基因的啟動(dòng)子分析

根據(jù)閩楠基因組數(shù)據(jù)，利用TBtools軟件提取PbPLR基因序列轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp序列，使用在線軟件PlantCARE (http：//intra.psb.ugent.be：8080/PlantCARE/)預(yù)測(cè)PbPLR基因啟動(dòng)子序列中的順式調(diào)控元件。

1.6 PbPLR基因?qū)に靥幚淼捻憫?yīng)

選取1.5年生長(zhǎng)勢(shì)一致的閩楠半同胞家系苗進(jìn)行激素處理，分別采集葉、莖和根進(jìn)行PbPLRs基因表達(dá)分析?；谇捌陬A(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究分別使用1 mmol·L?1ABA、1 mmol·L?1水楊酸(SA)和2 mmol·L?1MeJA處理閩楠實(shí)生苗，對(duì)土壤上部植株均勻噴灑激素，使土壤表面被激素浸濕，同時(shí)，以噴灑水為對(duì)照(ck)。激素噴施時(shí)間為2021年10月1日9：30、10月2日11：00、10月3日11：30、10月3 日 22：00、10 月 4 日 9：00、10 月 4 日 9：30。在處理后 1、3、12、24、48 和 72 h 取樣并液氮速凍。采用CTAB法提取RNA，使用Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用在線網(wǎng)站(http：//primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)PbPLRs特異性引物(表1)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。定量PCR 反應(yīng)體系(10 μL)為：SYBR Green 5.0 μL，上下游引物(10 μmol·L?1)各0.2 μL，模板0.8 μL，雙蒸水3.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s (此步完成時(shí)采集熒光信號(hào))，共40個(gè)循環(huán)。利用CFX96? Real-Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))。內(nèi)參基因?yàn)镻bEF1α，按照2???Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用SPSS軟件對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)引物信息Table 1 RT-qPCR primer information

2 結(jié)果與分析

2.1 閩楠PLR家族成員鑒定

基于擬南芥AtPrRs蛋白序列，應(yīng)用BLAST和HMMER 3.1軟件在閩楠基因組中搜索PLR家族成員。利用BLAST在閩楠基因組中鑒定出12個(gè)候選PLR基因，通過HMMER 3.1鑒定出10個(gè)成員，去除重復(fù)和結(jié)構(gòu)域鑒定后，共鑒定出8個(gè)PLR基因家族成員(表2)，按照其在染色體上位置命名為PbPLR1～PbPLR8。

表2 閩楠PLR基因家族的基本信息Table 2 Basic information of PLR gene family in P. bournei

2.2 PbPLR基因染色體定位與基因復(fù)制分析

PbPLRs基因不均勻地分布在閩楠第1、2、5和10號(hào)染色體，其中10號(hào)染色體上數(shù)目最多，含3個(gè)PbPLRs成員，2號(hào)染色體僅1個(gè)成員。閩楠基因復(fù)制事件檢測(cè)結(jié)果表明：PbPLR1和PbPLR3經(jīng)歷了片段復(fù)制，而PbPLR1和PbPLR2以及PbPLR6、PbPLR7和PbPLR8經(jīng)歷了串聯(lián)復(fù)制。

2.3 PbPLR基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序的分析

利用GSDS軟件繪制PbPLRs基因結(jié)構(gòu)圖(圖1A)可見：8個(gè)PbPLRs均含有至少2個(gè)外顯子，其中PbPLR2、PbPLR3、PbPLR4和PbPLR7各含4個(gè)外顯子，每個(gè)成員均有內(nèi)含子。

圖1 PbPLR基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析Figure 1 Analysis of PbPLR gene structure and protein conserved motifs

對(duì)PbPLR蛋白序列進(jìn)行保守基序(Motif)分析，共檢測(cè)到14個(gè)保守基序(圖1B)。多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)：PbPLRs都具有保守的NADPH結(jié)合位點(diǎn)和賴氨酸(Lys)活性位點(diǎn)(圖1C)，PbPLR1含有特異Motif 11、Motif 13和Motif 14；PbPLR 6和PbPLR 8含有特有的Motif 10。

2.4 PbPLR家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

為研究PbPLRs家族的進(jìn)化關(guān)系并預(yù)測(cè)其催化酶功能，選取裸子植物臺(tái)灣杉、北美喬柏，以及被子植物擬南芥、連翹和亞麻等物種的PLR蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：裸子植物的臺(tái)灣杉TcPLRs和北美喬柏TpPLRs屬同一分支，即裸子植物和被子植物PLRs不論其底物立體選擇性如何，均可分為2分支群[17?20]。然而，被子植物PLRs根據(jù)其底物立體選擇性而分屬不同支群，根據(jù)位于同一分支的LcPLR1、LaPLR1和LuPLR2的底物偏好，推測(cè)PbPLR1、PbPLR6、PbPLR7和PbPLR8偏好(+)-松脂醇[(+)-pinoresinol]和(+)-落葉松脂醇[(+)-lariciresinol]；而PbPLR2、PbPLR3和PbPLR4同屬于一個(gè)小分支，與偏好(?)-松脂醇和(?)-落葉松脂醇的LuPLR1和偏好(+)-松脂醇和(?)-落葉松脂醇的LpPLR1親緣關(guān)系較近，推測(cè)PbPLR2、PbPLR3和PbPLR4可將 (?)-松脂醇還原為(?)-落葉松脂醇。PbPLR5與其他PLR成員親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，不能預(yù)測(cè)其選擇性。

圖2 閩楠和多個(gè)物種的PLR家族系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 PLR family phylogenetic tree of P. bournei and several species

2.5 PbPLR基因順式作用元件分析

啟動(dòng)子區(qū)域的順式調(diào)控元件可能影響基因表達(dá)模式。分別提取PbPLR基因上游2 000 bp序列進(jìn)行順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域具多種類型響應(yīng)元件(圖3A)，主要包括激素響應(yīng)元件如脫落酸(ABA)響應(yīng)元件、赤霉素(GA)響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯(MeJA)響應(yīng)元件和水楊酸(SA)響應(yīng)元件，與環(huán)境脅迫響應(yīng)元件等，對(duì)PbPLR基因啟動(dòng)子區(qū)的激素響應(yīng)元件統(tǒng)計(jì)分析表明：PbPLRs含有5種激素響應(yīng)元件：脫落酸、水楊酸、赤霉素、茉莉酸甲酯和生長(zhǎng)素(Auxin)，每個(gè)PbPLRs至少含有2個(gè)激素響應(yīng)元件，其中PbPLR2激素響應(yīng)元件最多(6個(gè))，PbPLR4僅2個(gè)(圖3B)。在全部PbPLR啟動(dòng)子區(qū)域的響應(yīng)元件中，激素響應(yīng)元件最多的是脫落酸(9個(gè))，其次為赤霉素(7個(gè))，生長(zhǎng)素最少僅2個(gè)(圖3C)。

圖3 PbPLR家族基因的順式作用元件分析Figure 3 Analysis of putative cis-elements in the promoter regions of PbPLRs

2.6 不同激素處理下的PbPLR表達(dá)分析

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)反應(yīng)檢測(cè)了ABA、SA和MeJA處理后根、莖和葉中的PbPLRs基因的表達(dá)水平(圖4～6)。結(jié)果表明：8個(gè)PbPLRs基因?qū)BA、SA和MeJA均有響應(yīng)，處理1 ～48 h，基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，48 h時(shí)達(dá)最高值，之后上調(diào)幅度降低。其中，ABA處理48 h后根部PbPLR2表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)最大，為ck的400倍，莖部表達(dá)水平上調(diào)為ck的300倍，但葉片中表達(dá)上調(diào)不明顯。相較于在根部和葉部，ABA處理后的PbPLR6在莖部表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)最大，48 h時(shí)的表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)為ck的35倍；ABA處理48 h后的PbPLR4在葉中上調(diào)倍數(shù)最大，為ck的30倍(圖4)。

圖4 PbPLRs基因在ABA處理下的表達(dá)模式Figure 4 Expression patterns of PbPLRs under ABA treatment

圖5 PbPLRs基因在SA處理下的表達(dá)模式Figure 5 Expression patterns of PbPLRs under SA treatment

圖6 PbPLRs基因在MeJA處理下的表達(dá)模式Figure 6 Expression patterns of PbPLRs under MeJA treatment

SA處理后，根中PbPLR2表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)最大，為ck的400倍，PbPLR6在根、莖、葉中均上調(diào)表達(dá)，而PbPLR1、PbPLR4和PbPLR8上調(diào)倍數(shù)較低(圖5)。

MeJA處理48 h后，根中PbPLR2表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)為ck的500倍，且莖中也達(dá)400倍；PbPLR3在根中表達(dá)上調(diào)為ck的140倍(圖6)。PbPLR5對(duì)MeJA處理響應(yīng)不明顯，莖和根中表達(dá)量上調(diào)幅度均較低，但ABA(圖4)和SA(圖5)處理后PbPLR5的表達(dá)量上調(diào)顯著(P＜0.05)，該結(jié)果與PbPLR5啟動(dòng)子區(qū)域含有的激素響應(yīng)元件一致。

3 討論

木脂素類化合物具有較為廣泛的應(yīng)用前景，PLR作為植物木脂素生物合成的重要限速酶基因之一，引起了廣泛的關(guān)注。例如，在亞麻中鑒定到2個(gè)PLR基因(LuPLR1和LuPLR2)[12]，模式植物擬南芥中共有2個(gè)PrR基因(AtPrR1和AtPrR2)[7]，臺(tái)灣杉中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)PLR基因(TcPLR1、TcPLR2和TcPLR3)等[21]。本研究從閩楠基因組中共鑒定到8個(gè)PbPLRs基因，不均等分布于閩楠的4條染色體上，且均含有PLR家族保守的NADPH結(jié)合位點(diǎn)和賴氨酸活化位點(diǎn)。PLR屬于short-chain dehydrogenase/reductase(SDR)超級(jí)家族，該家族廣泛參與植物初級(jí)代謝和次級(jí)代謝過程，且在高等植物中具有明顯功能分化[22]。閩楠中數(shù)量較多的PLR成員可能參與不同代謝通路，并發(fā)生功能分化。

利用不同物種PLR蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)裸子植物PLR蛋白單獨(dú)聚為一類，而被子植物PLR系統(tǒng)聚類與催化酶的立體選擇性相關(guān)，該結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致。NAKATSUBO等[7]發(fā)現(xiàn)被子植物PLR(FiPLR1、LaPLR1、LuPLR1、LpPLR1、AtPrR1和AtPrR2)和裸子植物PLR(TpPLR1和TpPLR2)分別聚類。PLR催化酶的底物立體選擇性直接決定了下游木脂素的結(jié)構(gòu)骨架，是形成木脂素類化合物結(jié)構(gòu)多樣性的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。PLR立體選擇性最早是在金鐘連翹Forsythia intermedia中發(fā)現(xiàn)，功能研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)FiPLR都偏好選擇催化(+)-松脂醇和(+)-落葉松脂醇為(?)-異落葉松脂醇[9]。隨后，在其他物種中鑒定的PLRs同樣具有明顯立體選擇性[23]。擬南芥AtPrR1可催化2種松脂醇異構(gòu)體，而AtPrR2僅能催化(?)-松脂醇形成(?)-落葉松脂醇[7]。根據(jù)已有催化酶的功能研究，推測(cè)閩楠PbPLR1、PbPLR6、PbPLR7和PbPLR8偏好選擇(+)-松脂醇和(+)-落葉松脂醇，而PbPLR2、PbPLR3、PbPLR4和PbPLR5聚類的PLR蛋白的立體選擇性不同，無法通過系統(tǒng)進(jìn)化樹推測(cè)其底物偏好性。FUJITA等[24]研究發(fā)現(xiàn)：北美喬柏的TpPLRs聚類為一個(gè)分支卻具有相反的立體選擇性。PLR家族成員的蛋白序列差異與底物立體選擇性并不完全等同，對(duì)底物的選擇偏好性可能隨物種共同經(jīng)歷多次進(jìn)化；或形成于物種進(jìn)化的早期，隨后的堿基突變并不影響其催化功能[25]。

通過啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)：PbPLR基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有多種響應(yīng)元件，推測(cè)PbPLR表達(dá)模式可能受生物及非生物因素調(diào)控。例如光響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)、耐旱和防御等響應(yīng)元件，推測(cè)PbPLR表達(dá)可能受光信號(hào)及非生物脅迫等因素影響，并通過次生代謝物的催化合成而參與植物防御系統(tǒng)。此外，PbPLRs基因啟動(dòng)子區(qū)域具有多種激素響應(yīng)調(diào)控元件，其中ABA、MeJA和SA等3種響應(yīng)元件數(shù)目最多。不同物種PLR基因表達(dá)受不同激素調(diào)控。例如，ABA處理下亞麻L(zhǎng)uPLR1和菘藍(lán)LiPLR1表達(dá)顯著上調(diào)[10,12?13]；MeJA誘導(dǎo)LuPLR2、IiPLR1和鬼臼草Podophyllum hexandrumPhPLR表達(dá)量上調(diào)[10,25]；而GA對(duì)LuPLR1表達(dá)起抑制作用[21]。對(duì)PbPLR表達(dá)分析表明：PbPLR對(duì)ABA、MeJA和SA均有響應(yīng)，這與啟動(dòng)子元件分析相吻合。MeJA處理下PbPLR2響應(yīng)最顯著，在處理48 h根部表達(dá)量最高；ABA處理下PbPLR4響應(yīng)最為顯著，在處理48 h時(shí)葉片表達(dá)量最高；SA處理下PbPLR6響應(yīng)最為顯著，在處理48 h時(shí)莖表達(dá)量最高。本研究表明：PbPLR調(diào)控模式較為復(fù)雜，可能受不同植物激素誘導(dǎo)，同時(shí)PbPLRs組織特異性表達(dá)可能與其結(jié)構(gòu)功能分化相關(guān)但與系統(tǒng)進(jìn)化分支無關(guān)。推測(cè)閩楠木脂素合成具有較為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，需進(jìn)一步研究其生物合成調(diào)控機(jī)制。