韋樹(shù)麗 胡茫莎 王蘋(píng)莉

新抗原是一類(lèi)由腫瘤細(xì)胞的突變基因編碼，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可被抗原提呈細(xì)胞（APC）識(shí)別、吞噬、加工并遞呈于細(xì)胞表面，激活T細(xì)胞，引起效應(yīng)T細(xì)胞的活化、增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用。新抗原主要存在于腫瘤細(xì)胞，正常組織中幾乎不表達(dá)，因此針對(duì)新抗原的治療不易發(fā)生脫靶現(xiàn)象，此外由于新抗原未經(jīng)過(guò)中樞免疫耐受過(guò)程，相較于腫瘤相關(guān)抗原具有更強(qiáng)的免疫原性，這些特點(diǎn)使得新抗原成為腫瘤免疫治療的優(yōu)秀靶點(diǎn)?；谛驴乖膫€(gè)體化治療正成為腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)領(lǐng)域，本文將對(duì)近些年基于新抗原的腫瘤個(gè)體化治療的最新研究和應(yīng)用進(jìn)展做一介紹。

1 新抗原特異性T細(xì)胞治療

1.1 特異性腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）過(guò)繼治療

早在1980年，TIL就被發(fā)現(xiàn)具有抑制黑色素瘤轉(zhuǎn)移的能力，這也成為后續(xù)Rosenberg團(tuán)隊(duì)創(chuàng)立TIL療法的理論基礎(chǔ)之一。TIL療法通過(guò)從切除的腫瘤標(biāo)本中分離出對(duì)腫瘤細(xì)胞有反應(yīng)的淋巴細(xì)胞，在體外數(shù)量級(jí)擴(kuò)增后回輸給患者，從而達(dá)到抗腫瘤作用。

為了分析回輸?shù)牧馨图?xì)胞靶向癌細(xì)胞的機(jī)制，Rosenberg團(tuán)隊(duì)利用外顯子測(cè)序技術(shù)分析曾經(jīng)接受TIL治療的黑色素瘤患者的腫瘤樣本，從中均篩選到了2～3個(gè)新抗原的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)載有新抗原的APC與TIL共孵育可引起特異性T細(xì)胞反應(yīng)，這表明新抗原的存在是TIL治療有效的機(jī)制之一[1]?；谶@一理論，Rosenberg團(tuán)隊(duì)分析了一位經(jīng)過(guò)多種化療方案均以失敗告終的晚期膽管癌患者的腫瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)存在一種新抗原的表達(dá)——ERBB2IP，將對(duì)新抗原有反應(yīng)的TILs體外富集使其濃度達(dá)到25%并回輸給該患者后，腫瘤病灶顯著縮小且療效維持1 年余[2]。

2016年該團(tuán)隊(duì)在另一名結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移患者的腫瘤標(biāo)本中分析到了KRAS突變，并獲得與該突變相關(guān)的新抗原，回輸針對(duì)該突變新抗原的TILs后，患者7處轉(zhuǎn)移灶中的6處發(fā)生消退，剩余一處病灶在經(jīng)過(guò)手術(shù)切除后也未再?gòu)?fù)發(fā)[3]。KRAS基因是常見(jiàn)的致癌基因，大約30%的腫瘤類(lèi)型包含該靶點(diǎn)的突變[4]，此案例的報(bào)道激起了研究者對(duì)于靶向由KRAS等熱點(diǎn)突變新抗原的研究熱潮。后續(xù)在上皮癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)另一熱點(diǎn)突變--TP53也可以產(chǎn)生新抗原，并發(fā)現(xiàn)在外周血中存在對(duì)TP53有反應(yīng)的特異性T細(xì)胞，且與腫瘤組織中存在的特異性T細(xì)胞的反應(yīng)相近[5-8]。這與之前可以在外周血中篩選到新抗原特異性T細(xì)胞的結(jié)論一致[9]。這一發(fā)現(xiàn)為難以取得組織標(biāo)本或標(biāo)本量少的患者提供了另一種獲取TILs的途徑。GEN-011就是一種利用患者外周血進(jìn)行新抗原特異性T細(xì)胞篩選和擴(kuò)增的針對(duì)實(shí)體腫瘤的T細(xì)胞過(guò)繼療法，目前正在進(jìn)行難治性實(shí)體瘤的1期臨床試驗(yàn)（NCT04596033）[10]。

靶向新抗原的TIL療法具有治愈癌癥的潛力，近些年在實(shí)體瘤治療中取得了良好療效。在一項(xiàng)2期臨床試驗(yàn)（NCT02360579）中，曾接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療而效果不佳的晚期黑色素瘤患者經(jīng)過(guò)TIL療法治療后，客觀緩解率達(dá)到了41%，疾病控制率更是達(dá)到了81%[11]。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)報(bào)告顯示TIL療法聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者，可以達(dá)到44%的客觀緩解率及89%的疾病控制率[12]。荷蘭癌癥研究所啟動(dòng)的針對(duì)TIL治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的可行性研究中，一位患者在多次接受針對(duì)其突變抗原肽的TIL治療后保持無(wú)病狀態(tài)9年余[13]。

雖然部分患者對(duì)TIL治療產(chǎn)生良好應(yīng)答，但是也存在對(duì)此療法無(wú)應(yīng)答的患者。最近Steven Rosenberg和Paul Robbins團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞測(cè)序等技術(shù)，比較了對(duì)TIL療法有完全反應(yīng)（CR）和無(wú)反應(yīng)（NR）患者的TILs的表型差異，發(fā)現(xiàn)了以CD39和CD69為分群依據(jù)的兩個(gè)功能不同的細(xì)胞亞群[14]。大多數(shù)腫瘤新抗原反應(yīng)性TILs處于CD39+分化狀態(tài)，而CD39和CD69雙陽(yáng)性的TILs（DP TILs）為終末分化狀態(tài)，增殖潛力差。CR患者不僅存在DP TILs，還存在CD39和CD69雙陰性的TILs（DN TILs），DN TILs細(xì)胞具有干細(xì)胞樣的特征，具備自我更新、擴(kuò)增的能力從而使TILs持續(xù)存在并引起腫瘤消退。同一時(shí)期，Baharom等[15]通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)，給予新抗原疫苗后，初始T細(xì)胞將增殖分化成干細(xì)胞樣T細(xì)胞，并可進(jìn)一步發(fā)育成效應(yīng)性T細(xì)胞，而且在腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞中TCF1+PD-1+“干細(xì)胞樣”細(xì)胞占了較高比例。以上的發(fā)現(xiàn)提示未來(lái)基于T細(xì)胞的免疫療法的有效開(kāi)發(fā)可以通過(guò)分離和擴(kuò)增具有干細(xì)胞特征的新抗原特異性T細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。

1.2 新抗原特異性工程化T細(xì)胞治療

工程化T細(xì)胞治療主要包括T細(xì)胞受體修飾的T細(xì)胞（TCR-T）治療和嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞（CAR-T）治療。傳統(tǒng)的TCR-T和CAR-T治療的靶點(diǎn)主要為腫瘤相關(guān)抗原，這些抗原并非腫瘤特異性，在正常細(xì)胞中也存在低水平表達(dá)，易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，引起正常組織損傷[16-17]。而新抗原是由腫瘤細(xì)胞發(fā)生基因突變而產(chǎn)生的異常蛋白，不存在于正常細(xì)胞表面，基于新抗原的療法可以避免脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。

2019年，Ziopharm Oncology與 MD Anderson癌癥中心宣布達(dá)成一項(xiàng)與Ziopharm的“睡美人”免疫療法計(jì)劃有關(guān)的新的研發(fā)協(xié)議，該協(xié)議旨在使用非病毒基因轉(zhuǎn)移來(lái)穩(wěn)定表達(dá)和臨床評(píng)估T細(xì)胞中的新生抗原特異性T細(xì)胞受體（TCRs）。美國(guó)國(guó)家癌癥中心最近開(kāi)展了鑒定及使用新生抗原特異性TCRs治療多種實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)（NCT03412877）。PACT制藥公司則通過(guò)預(yù)測(cè)新抗原，篩選反應(yīng)性T細(xì)胞并分析其受體信息及慢病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞來(lái)構(gòu)建neoTCR-P1細(xì)胞深層儲(chǔ)存庫(kù)，在臨床前研究中，這些經(jīng)過(guò)改造的T細(xì)胞被證明可殺死表達(dá)突變抗原的腫瘤[18]。

新生抗原特異性TCRs治療或?qū)⒊蔀閭€(gè)性化腫瘤特異性免疫治療的新方法，但由于每個(gè)患者的突變都具有獨(dú)特性，尋找個(gè)性化的T細(xì)胞，測(cè)序克隆相關(guān)的TCRs并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，這整個(gè)過(guò)程中的時(shí)間和及經(jīng)濟(jì)的消耗將是TCR-T推廣和量產(chǎn)所面臨的挑戰(zhàn)之一。

2 基于新抗原的雙特異性抗體療法

雙特異性抗體是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人工抗體，可以聯(lián)通靶細(xì)胞和功能分子/細(xì)胞，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[19]。近日，由約翰-霍普金斯大學(xué)學(xué)者領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)成功研發(fā)出靶向熱點(diǎn)突變——RAS和p53突變體的雙特異性抗體，該抗體的一臂靶向癌細(xì)胞表面的由突變的RAS或TP53基因所編碼的蛋白質(zhì)，另一臂與T細(xì)胞受體（通常為CD3）結(jié)合，橋接并激活免疫細(xì)胞以攻擊腫瘤細(xì)胞[20-21]。研究結(jié)果表明該雙特異性抗體能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。但是雙特異性抗體缺少Fc段，穩(wěn)定性不高，后續(xù)還需進(jìn)一步優(yōu)化改造[22]。

3 基于新抗原的個(gè)體化疫苗治療

2012年Sahin團(tuán)隊(duì)首次通過(guò)二代測(cè)序（NGS）技術(shù)在小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10中篩選到數(shù)個(gè)具有免疫原性的新抗原，將基于新抗原設(shè)計(jì)的多肽疫苗與佐劑一起對(duì)黑色素瘤小鼠進(jìn)行皮下注射后，小鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度比接受單純佐劑注射組及未接受任何治療組顯著減緩，且在數(shù)月后，仍有40%的小鼠存活。若先將新抗原疫苗免疫小鼠，再經(jīng)黑色素瘤造模后，小鼠腫瘤生長(zhǎng)的速度同樣減慢，表明新抗原疫苗具有治療和預(yù)防的雙重價(jià)值[23]。2014年，Gubin等[24]使用基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法來(lái)鑒定腫瘤特異性突變蛋白，以此設(shè)計(jì)的長(zhǎng)肽疫苗在治療患有進(jìn)行性生長(zhǎng)肉瘤的小鼠中發(fā)揮了強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)，顯示高應(yīng)答率。良好的臨床前研究結(jié)果掀起了基于新抗原的腫瘤個(gè)體化疫苗的臨床研究熱潮。

2015年，基于新抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）疫苗首次進(jìn)行人體試驗(yàn)，3位黑色素瘤患者在接受疫苗接種后，其抗腫瘤免疫的抗原廣度和克隆多樣性均有所擴(kuò)大[25]。而在2017年，德國(guó)Sahin團(tuán)隊(duì)和美國(guó)Wu團(tuán)隊(duì)主導(dǎo)的兩個(gè)Ⅰ期臨床試驗(yàn)更是證明基于新抗原的腫瘤個(gè)體化疫苗可以引起強(qiáng)大的抗瘤效應(yīng)和較低的副作用，能帶來(lái)直接的臨床獲益，這相較于此前的個(gè)案報(bào)道更具說(shuō)服力[26-27]。兩個(gè)臨床試驗(yàn)納入的研究對(duì)象均是中晚期黑色素瘤患者，均為復(fù)發(fā)高危人群。13名患者接受了Sahin團(tuán)隊(duì)mRNA個(gè)體化疫苗治療，其中8位患者在23個(gè)月內(nèi)無(wú)疾病復(fù)發(fā)，另外5位患者在接受疫苗之前已發(fā)生疾病進(jìn)展，在接受治療后有2位獲得了客觀應(yīng)答，其中1位獲得了完全緩解，且26個(gè)月無(wú)復(fù)發(fā)，另1位在疫苗的序貫治療和抗PD-1抗體治療后腫瘤完全消退[26]。Wu團(tuán)隊(duì)則招募了10位高危黑色素瘤術(shù)后患者，通過(guò)全基因組測(cè)序，比較每位患者的癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的基因差異，確定每位患者的基因突變情況，根據(jù)不同的基因突變情況為每位患者制定針對(duì)多達(dá)20種腫瘤新抗原的個(gè)體化癌癥疫苗，最終有6位患者接受了完整的個(gè)體化抗癌疫苗（NeoVax疫苗）治療。25個(gè)月的中位隨訪時(shí)間內(nèi)，4例ⅢB/C期患者無(wú)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的2例ⅣM1a/b期（肺轉(zhuǎn)移）患者經(jīng)4個(gè)療程的抗PD-1治療后，獲得了完全緩解[27]。更為有趣的是，該團(tuán)隊(duì)在對(duì)這6位患者及當(dāng)時(shí)新入組的2名患者進(jìn)行隨訪的4年多的時(shí)間中，8名患者全部存活，其中3名患者未復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的5名患者中，2名Ⅳ期患者受抗PD-1單抗治療后完全緩解，1名患者接受了手術(shù)切除后未發(fā)現(xiàn)疾病證據(jù)，2名患者發(fā)展為不可切除的轉(zhuǎn)移性疾病。對(duì)這些患者的T細(xì)胞進(jìn)行分析后，研究者發(fā)現(xiàn)患者的TCR譜系的多樣性隨著疫苗的多次注射而不斷得到擴(kuò)展，T細(xì)胞對(duì)大多數(shù)新抗原的反應(yīng)在接種后可以維持到4.5年，而且這些患者體內(nèi)還產(chǎn)生了靶向其他新抗原（非NeoVax疫苗抗原）的特異性T細(xì)胞[28]。這一長(zhǎng)期隨訪的試驗(yàn)結(jié)果表明：個(gè)體新抗原疫苗可以刺激黑色素瘤患者產(chǎn)生持久的免疫應(yīng)答。

德美兩個(gè)團(tuán)隊(duì)在黑色素瘤中得到肯定的試驗(yàn)結(jié)果后，又將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[29-30]。研究者通過(guò)單細(xì)胞TCR分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)新抗原疫苗治療后，來(lái)自外周血的新抗原特異性T細(xì)胞可以遷移聚集到顱內(nèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中[29]。由此證明，新抗原靶向疫苗可能有力地改變膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的免疫環(huán)境。近日，Michael Platten團(tuán)隊(duì)用靶向腦膠質(zhì)瘤IDH1突變的腫瘤疫苗治療了32例患者，總體反應(yīng)率達(dá)84.4%，3年無(wú)進(jìn)展率和無(wú)死亡率分別為63%和84%[31]。此外，個(gè)體新抗原疫苗單藥或聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑在非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌、晚期集合管癌、胰腺癌中也展現(xiàn)出良好的治療效果[32-36]。2020年，Chen教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際上發(fā)表了首個(gè)基于新生抗原個(gè)體化多肽疫苗單藥治療泛癌中晚期實(shí)體瘤患者的臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示該類(lèi)疫苗疾病控制率高，且明顯延長(zhǎng)晚期腫瘤患者的生存期[36]。

4 展望

生物信息學(xué)工具、基因組大數(shù)據(jù)和計(jì)算機(jī)算法的發(fā)展，納米材料等新載體的開(kāi)發(fā)推動(dòng)了新抗原的研究與應(yīng)用，使得腫瘤的治療方式向著個(gè)體化和精準(zhǔn)化的方向發(fā)展。目前基于新抗原的腫瘤個(gè)體化治療的研究主要集中于新抗原疫苗及靶向新抗原的TIL回輸，雖然相關(guān)的臨床試驗(yàn)大部分處于Ⅰ期或Ⅱ期階段，但是已有結(jié)果表明這是極具潛力的治療方案。而且相較于免疫檢查點(diǎn)抑制劑單藥使用，其與基于新抗原的個(gè)體化治療方案聯(lián)用顯著延長(zhǎng)了部分患者的生存期，類(lèi)似的試驗(yàn)結(jié)果在EGFR靶向治療聯(lián)合新抗原疫苗中也有體現(xiàn)。此外，臨床研究也顯示，高的新抗原負(fù)荷與免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療腫瘤的臨床持久獲益相關(guān)，提示新抗原不僅具有作為治療靶點(diǎn)的作用，還具有預(yù)測(cè)臨床預(yù)后的潛力，相信其在未來(lái)臨床應(yīng)用中將大放異彩[37-38]。