劉瀟予，陳光耀，吳子彧，金 琦，陶慶文

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院中醫(yī)風濕病科，免疫炎性疾病北京市重點實驗室，北京 100029）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以對稱性累積小關節(jié)為主要特征的慢性自身免疫性炎性疾病，在世界范圍內的發(fā)病率約為0.5%～1.0%［1］。RA 的主要病理表現(xiàn)為炎性反應導致滑膜的異常增殖，最終導致滑膜內新生血管的形成，并進一步造成骨侵蝕［2］。未經(jīng)良好控制的RA常導致關節(jié)的損害，并最終導致關節(jié)畸形及功能喪失［3］。以甲氨蝶呤為代表性的改善病情的抗風濕藥物是現(xiàn)代醫(yī)學治療RA 的最常用藥物，但胃腸道反應、骨髓抑制、肝功能損害等一系列的不良反應限制了其臨床使用［4］。中醫(yī)藥治療RA 具有副作用小、療效確切，且能根據(jù)患者的臨床特點進行針對性的治療的特點［5］。中藥雷公藤提取物雷公藤多苷被多項隨機對照試驗實驗證實對RA 具有良好的改善作用，并被相關指南推薦應用于RA 的臨床治療［6］。從中藥中提取有效成分并應用于RA 的臨床治療，成為當今研究的熱點。

骨碎補是水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm.的干燥根莖，具有療傷止痛、補腎強骨的作用，常被應用于風濕相關疾病與骨折的治療。黃酮類化合物是骨碎補藥材中的主要活性成分，而骨碎補總黃酮（total flavonoids of Rhizoma Drynariae，TFRD）被批準應用于骨質疏松的臨床治療。相關研究表明，骨碎補總黃酮對骨折、骨關節(jié)炎、鏈霉素耳毒性及動脈粥樣硬化均具有良好的干預作用［7，8］。相關基礎研究表明，骨碎補總黃酮對破骨細胞活性、炎性細胞因子、基質金屬蛋白酶表達具有良好的抑制作用［9，10］。骨質疏松常伴發(fā)類風濕性關節(jié)炎，在臨床中使用該藥物對RA 伴隨骨質疏松患者進行治療時發(fā)現(xiàn)，TFRD 能夠減輕類風濕性關節(jié)炎關節(jié)腫脹、疼痛等癥狀。同時，RA 的骨侵蝕發(fā)生與破骨細胞異常激活、炎性細胞因子過度表達、基質金屬蛋白酶分泌增加密切相關，故推測TFRD 對RA 具有一定的干預作用。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡藥理學探究其治療類風濕性關節(jié)炎機制，為進一步的實驗研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 骨碎補有效黃酮類成分篩選

以“骨碎補”為關鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析 平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）進行化學成分的篩選。選取滿足口服生物利用度（oral bioavailibility，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的全部成分，并進一步通過分子結構篩選出骨碎補有效成分中的黃酮類成分。

1.2 骨碎補有效黃酮類成分靶點預測

納入TCMSP 數(shù)據(jù)庫中全部骨碎補有效黃酮類成分的相關靶點，并通過Unitprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.Uniprot.org/），對靶點簡稱進行標準化處理。同時，運用Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢有效成分的SMILE 標準結構式，并導入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http：//swisstargetprediction.ch/）和STITCH 數(shù) 據(jù) 庫（http：//stitch.embl.de/）進行靶點預測，以置信度Confidence＞0.4 為條件，將滿足條件的靶點納入后續(xù)研究。

1.3 RA 相關疾病靶點預測

本研究采用GenBank 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org/）搜索RA 疾病相關靶點。以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞，在上述數(shù)據(jù)庫中搜索疾病相關基因并刪除重復基因。并繪制藥物靶點-疾病基因的Venn 圖。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡的構建與核心蛋白的篩選

本 研 究 通 過STRING 數(shù) 據(jù) 庫（https：//stringdb.org/）獲得藥物-疾病共同靶點的蛋白互作網(wǎng)絡關系。將上述交集蛋白靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種設置為“Homo sapiens”，篩選出蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）評分高于0.9 的蛋白關系，并導入Cytoscape 3.8.2 構建PPI 網(wǎng)絡圖。使用Cytoscape 3.8.2 中Analyze Network 功能對該PPI 網(wǎng)絡關系進行拓撲分析，選取Degree 大于平均值的蛋白作為核心蛋白，并生成核心蛋白網(wǎng)絡圖。

1.5 骨碎補總黃酮治療RA 調控網(wǎng)絡的構建

將得到的骨碎補總黃酮有效成分、骨碎補總黃酮成分靶點和骨碎補總黃酮-RA 交集基因及其相互關系導入Cytoscape 3.8.2，構建骨碎補總黃酮-作用靶點-RA 的調控網(wǎng)絡。

1.6 GO 基因富集分析

將骨碎補總黃酮治療RA 的基因靶點導入DAVID enrichment 數(shù) 據(jù) 庫（https：//david. ncifcrf.gov/），物種選擇“H. sapiens”，對作用靶點進行基因富集分析，預測基因的功能分布。按照P值從小到大排列，對生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）和細胞成分（cellular component）3 個模塊進行排序，各篩選出排名前10 的生物過程，統(tǒng)計富集基因數(shù)，并使用Graphpad Prism 8 繪制條形圖。

1.7 KEGG 通路富集分析

對藥物-疾病交集基因進行KEGG 通路富集分析，得到可能受活性成分調控的重要通路。篩選出P＜0.05 的前20 條通路，并進行可視化分析。

1.8 活性成分與核心靶點的分子對接

選取骨碎補總黃酮中關鍵成分以及篩選出的核心蛋白進行分子對接。在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www1.rcsb.org/）下載核心蛋白的結構文件，并保存為pdb 格式；在PubChem 數(shù)據(jù)庫下載骨碎補總黃酮關鍵成分的結構，并通過Open Babel GUI 將關鍵成分結構轉換為mol2 格式。運用AutoDockTools 1.5.6 對骨碎補總黃酮關鍵成分與核心蛋白進行分子對接，并用Pymol 對分子對接結果進行可視化做圖。

2 結果

2.1 骨碎補有效黃酮類成分篩選

以“骨碎補”為關鍵詞，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫共搜索到71 種骨碎補有效成分，其中滿足OB≥30%，OL≥0.18 的骨碎補黃酮類成分共有10 種，包括木犀草素、槲皮素、山奈酚、金魚草素等。骨碎補有效黃酮類成分的具體信息見表1。

表1 骨碎補有效黃酮類成分表Tab 1 Components of effective flavonoids of Rhizoma Drynariae

2.2 骨碎補有效黃酮類成分靶點預測

TCMSP 檢索得到77 個骨碎補有效黃酮類成分的相關靶點。以置信度＞0.4 為條件，分別在SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫和STITCH 數(shù)據(jù)庫檢索得到61 個和108 個相關靶點。刪除重復靶點，總共得到210 個有效成分對應的靶點。

2.3 RA 疾病相關基因預測

以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞，在GenBank數(shù)據(jù)庫查詢到1 263 個相關基因，在GeneCard 數(shù)據(jù)庫查詢到898 個相關基因（相關度≥4），在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫查詢到867 個相關基因（Score≥0.05），在OMIM 數(shù)據(jù)庫中查詢到42 個相關基因。刪去重復基因，共有2 009 個與RA 相關的基因。將RA 疾病相關基因與骨碎補有效黃酮類成分相關靶點取交集，得到123 個交集基因，交集基因的Venn 圖。見圖1。

圖1 骨碎補總黃酮-RA 交集基因Venn 圖Fig 1 Venn diagram of intersection genes of total flavonoids of Rhizoma Drynariae（TFRD）and rheumatoid arthritis（RA）

2.4 骨碎補總黃酮治療RA 的PPI 網(wǎng)絡與核心蛋白

本研究使用STRING 數(shù)據(jù)庫，篩選出互作評分大于0.9 的蛋白關系構建骨碎補總黃酮治療RA 的PPI 網(wǎng)絡，并導入Cytoscape 3.8.2 進行可視化（圖2A）。網(wǎng)絡中包括108 個功能蛋白，541 個相互作用關系，平均節(jié)點度為8.8，局部聚類系數(shù)為0.478，預期邊數(shù)值為112。PPI 網(wǎng)絡中連接靶點數(shù)目（Degree）與蛋白核心程度為正相關，選取Degree 大于平均值的蛋白作為核心蛋白，并生成核心蛋白網(wǎng)絡圖，節(jié)點越大，顏色越深，則該蛋白的連接靶點越多（圖2B）。PPI 網(wǎng)絡中核心蛋白連接靶點數(shù)目，見圖3。與RA 密切相關的蛋白包括STAT3、MAPK1、MAPK3、AKT1、MAPK8、IL-6、TNF、MAPK14、IL-4、IL-2、VEGFA、IL-1β、MAPK9 等，主要涉及炎性細胞因子（腫瘤壞死因子類、白介素類）、細胞因子信號轉導途徑（STAT 與MAPK 信號通路）、新生血管形成等途徑。

圖2 PPI 網(wǎng)絡及核心蛋白網(wǎng)絡圖Fig 2 PPI network and core protein network

圖3 PPI 網(wǎng)絡中核心蛋白連接靶點數(shù)目條形圖Fig 3 Bar graph of the number of core protein junction targets in the PPI network

2.5 骨碎補總黃酮治療RA 調控網(wǎng)絡

本研究主要篩選出10 種骨碎補總黃酮活性成分，其中木犀草素、柚皮素、山奈酚等7 種活性成分參與了RA 調控網(wǎng)絡，使用Cytoscape 3.8.2 構建藥物-有效成分-作用靶點-疾病可視化調控網(wǎng)絡。見圖4。網(wǎng)絡中共有132 個節(jié)點（123 個作用靶點，7 個活性成分，1 個疾病名稱，1 個藥物名稱），253 條連接。圖中藍色長方形表示骨碎補總黃酮，紅色六邊形表示類風濕性關節(jié)炎，綠色橢圓形表示骨碎補總黃酮活性成分，粉紅色“V”形表示藥物-疾病共同靶點，連線表示藥物、有效成分、作用靶點、疾病之間的相互關系。骨碎補總黃酮活性成分的節(jié)點大小反映節(jié)點連接靶點的數(shù)目，節(jié)點越大，表示該節(jié)點在網(wǎng)絡中處于越核心的位置。結果顯示，骨碎補總黃酮活性成分可調控多個作用靶點，其中木犀草素、柚皮素與靶點的連接數(shù)目最多，分別為125 和29個，提示這兩種物質可能是骨碎補總黃酮治療RA的關鍵成分。

圖4 藥物-有效成分-作用靶點-疾病調控網(wǎng)絡Fig 4 Regulatory network of drug-active ingredient-target-disease

2.6 GO 基因富集分析

使用DAVID Enrichment 數(shù)據(jù)庫對骨碎補總黃酮治療RA 的靶點進行GO 基因富集分析，根據(jù)Pvalue 值從小到大篩選出排名前10 的生物過程。見圖5。GO 富集分析顯示，在生物過程方面，作用靶點涉及轉錄的正調控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱpromoter，positive regulation of transcription）、基因表達的正調控（positive regulation of gene expression）、凋亡過程的調控及信號通路（negative regulation of apoptotic process，extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand）、炎癥反應（inflammatory response）等。在細胞成分方面，作用靶點涉及胞質（cytosol）、細胞外區(qū)域（extracellular region）、蛋白質復合體（protein complex）、細胞核（nucleoplasm，nucleus）、轉錄因子復合體（transcription factor complex）等。在分子功能方面，作用靶點涉及酶結合（enzyme binding）、蛋白結合（protein binding）、轉錄因子結合及轉錄激活因子活性（transcription factor binding，transcriptional activator activity）、RNA 聚 合 酶Ⅱ轉錄因子活性（RNA polymerase Ⅱtranscription factor activity）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、細胞因子活性（cytokine activity）等。

圖5 BP、MF、CC 各排名前10 的GO 富集分析結果Fig 5 Top 10 GO enrichment analysis results of biological process（BP），molecular function（MF）and cellular component（CC）

2.7 KEGG 通路富集分析

對上述骨碎補總黃酮-RA 交集基因進行KEGG 通路富集分析，得到顯著富集的相關通路164 條，按富集顯著度從小到大排列，篩選出前20 條KEGG 通路。見圖6。圖中橫坐標表示該通路所富集的基因與通路基因總數(shù)的比率，氣泡大小表示富集基因數(shù)量，氣泡顏色表示P值。結合相關文獻分析，提 示PI3K/AKT 通 路［11］、IL-17 通 路［12］、TNF-α通路［13］、T 細胞受體轉導通路［14］及Th17 細胞分化調節(jié)通路［15］可能在骨碎補總黃酮治療類風濕性關節(jié)炎中發(fā)揮重要作用。將以上通路與骨碎補總黃酮-RA 交集基因靶點構建網(wǎng)絡。見圖7。

圖6 KEGG 通路富集Fig 6 KEGG pathway enrichment

圖7 作用靶點-關鍵通路圖Fig 7 Target-key pathway diagram

2.8 分子對接驗證

為了評估骨碎補總黃酮中關鍵成分與關鍵靶點的的結合親和力，使用AutodockTools 進行分子對接。選取骨碎補總黃酮治療RA 調控網(wǎng)絡中靶點連接數(shù)目最多的木犀草素和柚皮素作為分子對接配體，選取蛋白互作網(wǎng)絡中關鍵蛋白STAT3 和PI3K/AKT 通路中的重要調控蛋白AKT1、PI3K 作為受體進行分子對接。木犀草素與AKT1、PI3K 和STAT3 的 結 合 能 分 別 為-5.45、-6.95 和-6.85 kcal/mol，柚皮素與AKT1、PI3K 和STAT3 的結合能 分 別 為-3.37、-4.38 和-4.13 kcal/mol。見 表2。提示較之于提示柚皮素，木犀草素與關鍵靶點AKT1、PI3K 和STAT3 的結合能力更強，提示其更有可能影響其結構，進而影響其磷酸化，從而調控STAT3 及PI3K/AKT 信 號 通 路。AKT1、PI3K 和STAT3 和骨碎補總黃酮關鍵成分的分子對接模式圖。見圖8。

表2 骨碎補總黃酮關鍵成分與關鍵靶點的的結合能（kcal/mol）Tab 2 Binding energy of key components and key targets of total flavonoids of Rhizoma Drynariae

圖8 骨碎補總黃酮關鍵成分和AKT1、PI3K 和STAT3 的分子對接模式圖Fig 8 Molecular docking patterns of key components of total flavonoids of Rhizoma Drynariae and AKT1，PI3K and STAT3

3 討論

既往研究表明，黃酮類成分是中醫(yī)藥治療RA的關鍵有效成分，可能與其抗炎、抗氧化等機制密切相關［16，17］。本研究對骨碎補總黃酮治療RA 的有效成分篩選并進行分析，提示木犀草素與柚皮素可能是其治療RA 的關鍵成分。在既往研究中發(fā)現(xiàn)，木犀草素被證實能夠通過抑制滑膜的炎性細胞因子表達、基質水解酶表達及炎性因子相關通路，進而發(fā)揮對RA 的治療作用［18］。柚皮素不僅具有較強的抗炎作用，同時還可以有效改善甲氨蝶呤治療RA 過程中造成的肝臟損害［19］。提示骨碎補總黃酮不僅具有潛在的治療RA 的作用，同時與西藥聯(lián)用可能具有減毒增效的機制，值得進一步進行探究。

細胞因子是由免疫細胞（單核細胞、巨噬細胞、T 細胞、B 細胞、NK 細胞等）和某些非免疫細胞（內皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等）經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質。細胞因子與細胞表面受體結合，并進一步通過調控轉錄等途徑啟動復雜的細胞內分子間的相互作用。RA 作為一種自身免疫性炎性疾病，多種細胞因子參與其相關疾病的過程。研究表明RA 伴隨著轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）水平顯著升高，并通過激活炎癥相關基因表達，在炎癥發(fā)展過程中起重要調控作用［20］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是生物體內重要的信號蛋白之一，參與了細胞因子與受體結合后調控轉錄的進程，對生物的生長、分化、應激適應和炎癥反應具有重要的調控作用［21］。腫瘤壞死因子-α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 均為參與炎性反應與免疫應答的重要細胞因子，能夠刺激滑膜的炎性反應，并進一步引起滑膜的異常增殖［22］。TNF-α、IL-6、IL-1β 相關單克隆抗體被應用于RA 及幼年特發(fā)性關節(jié)炎的治療，并顯示出良好的臨床效果［23］。IL-2 和IL-4 分別為Th1 及Th2 細胞分泌的特征性細胞因子，對免疫系統(tǒng)具有重要調節(jié)作用［22］。研究表明，小劑量IL-2可以通過調節(jié)Th17/Treg 平衡，發(fā)揮對RA 的治療作 用［24］。PPI 結 果 提 示，細 胞 因 子TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6 是骨碎補總黃酮干預RA 的關鍵靶點。同時MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14 及STAT3 在骨碎補總黃酮干預RA 的過程中發(fā)揮了重要作用，其中STAT3 是最為核心的調控靶點。Caspase3 及血管內皮生長因子提示骨碎補總黃酮可能參與了RA 的細胞凋亡過程及滑膜新生血管的進程［25，26］。

KEGG 富集 分析表明，PI3K/AKT 通路、IL-17通路、TNF-α 通路、T 細胞受體轉導通路及Th17 細胞分化調節(jié)通路可能在骨碎補總黃酮治療類風濕性關節(jié)炎中發(fā)揮重要作用。共35 個骨碎補總黃酮-RA 交集基因參與了PI3K/AKT 通路的調節(jié)，同時PI3K/AKT 異?；罨梢约せ頝F-κB，進而促進TNF-α、IL-17、IL-6 細胞因子的轉錄，進而激活IL-17 通路、TNF-α 通路、T 細胞受體轉導通路及Th17細胞分化調節(jié)通路。提示PI3K/AKT 通路可能是骨碎補總黃酮治療RA 的最為重要的調控通路。在進一步的分子對接實驗中將骨碎補總黃酮治療RA最為關鍵的成分木犀草素與柚皮素，與關鍵靶點選用PPI 中關鍵蛋白STAT3，PI3K/AKT 通路中重要的調控蛋白PI3K、AKT1 進行分子對接。分子對接結果顯示木犀草素能夠更好與這些靶點相結合，提示其可能通過改變分子結構從而對STAT3、PI3K、AKT 等的相關磷酸化過程進行調控，進一步影響其下游功能。

綜上，骨碎補總黃酮可能通過調控炎性相關細胞因子及相關傳導途徑，從而抑制RA 的炎性反應，而PI3K/AKT 通路可能是骨碎補總黃酮發(fā)揮治療RA 的重要途徑。木犀草素是骨碎補總黃酮治療RA 的關鍵分子，并可能通過抑制相關核心蛋白的構象，進而調控磷酸化發(fā)揮下游途徑作用。未來本課題組將通過進一步實驗研究進行驗證，為骨碎補總黃酮治療RA 提供相關依據(jù)并為臨床應用提供基礎。

作者貢獻度說明：

劉瀟予：設計并執(zhí)行研究方案，采集與分析數(shù)據(jù)，繪制圖表，撰寫論文，最終版本修訂；陳光耀：提出研究思路，采集與分析數(shù)據(jù)，撰寫論文，最終版本修訂；吳子彧、金琦：分析數(shù)據(jù)，繪制圖表，參與論文修訂；陶慶文：監(jiān)督與指導，最終版本審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。