劉 琨，劉軍麟，袁丞達(dá)，陸春婉，殷 梅

（1. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院皮膚性病科，海南 ?？?570311；2. 杭州市中醫(yī)院皮膚性病科，浙江 杭州 310005；3. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院體檢科，海南 ?？?570311）

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病，其發(fā)病由T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，且受環(huán)境和遺傳因素共同影響。既往研究表明維生素D及其衍生物可通過多種途徑對銀屑病皮損的治療產(chǎn)生作用。此外，銀屑病患者的血清1，25（OH）2D3水平比對照組顯著降低，且在銀屑病關(guān)節(jié)炎患者中，血清1，25（OH）2D3水平與疾病活動度呈負(fù)相關(guān)［1-3］。血清25（OH）D3水平通常是評價人體內(nèi)維生素D3含量高低的指標(biāo)［4］，而血清25（OH）D3水平取決于維生素D 結(jié)合蛋白（vitamin D binding protein，VDBP）的濃度以及維生素D3與VDBP 親和力。VDBP 由GC 基因編碼，該基因位于染色體4q13.3，長約64 kb，包含15 個外顯子。雖有報道GC 基因及其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與癌癥、肥胖、代謝綜合征或其他疾病具有相關(guān)性［5-8］，但目前尚未發(fā)現(xiàn)有明確報道表明GC 基因與銀屑病有明顯相關(guān)性。

基于上述情況，本研究在相對隔離的海南漢族尋常性銀屑病及正常人群中采用二代測序技術(shù)對GC 基因及其上、下游各2 kb 區(qū)域進(jìn)行重測序，獲取該區(qū)域內(nèi)的所有SNP 并進(jìn)行基于SNP 的關(guān)聯(lián)分析，以期全面、深入揭示GC 基因與銀屑病的關(guān)系。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

2018 年3 月～2020 年2 月在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院門診及病房101 例海南籍漢族尋常性銀屑病患者，所有患者符合尋常性銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，男、女性患者分別為65 例、36 例，年齡18～82 歲，平均（45.31±14.05）歲。另從海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院體檢中心收集79 例海南籍漢族健康人為正常對照，男、女性分別為47 例、32 例，年齡21～78 歲，平均（41.76±12.86）歲。將自祖父輩起為海南籍且無明確的島外遷入史作為海南籍的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。兩組人群間及人群內(nèi)均無親緣關(guān)系，且對照組人群均無銀屑病家族史。年齡、性別在兩組間均無統(tǒng)計學(xué)差異（分別為t=1.745，P=0.083；χ2=0.446，P=0.504）。

本研究已通過海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，研究對象均填寫基本情況表并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 靶基因捕獲測序 對兩組樣本的GC 基因及其上、下游各2 kb 區(qū)域進(jìn)行全長測序，步驟如下：（1）樣 本DNA 質(zhì) 量 檢 測；（2）DNA 片 段 化；（3）末端修復(fù)；（4）3'端加上單個腺苷酸“A”；（5）連接測序接頭；（6）文庫片段篩選；（7）擴(kuò)增文庫；（8）目的區(qū)域芯片雜交；（9）雜交文庫清洗及純化；（10）PCR 擴(kuò)增DNA 文庫；（11）文庫的質(zhì)量檢測；（12）上機(jī)測序。該檢測由上海天昊生物科技有限公司完成。

1.2.2 統(tǒng)計分析 利用Hardy-Weinberg 檢驗在對照組中對所有SNP 進(jìn)行檢驗。入選SNP 標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）對 照 組Hardy-Weinberg 檢 驗 的P值 大 于0.05；（2）最小等位基因頻率＞0.01。

采用PLINK 2.00 軟件在共顯性模型（以正常純合為參照）、顯性模型（低頻率的等位基因為顯性）、隱性模型（低頻率的等位基因為隱性）及等位基因模型等4 種遺傳模式下進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。使用Bonferroni 法和錯誤發(fā)現(xiàn)率法（false discovery rate，F(xiàn)DR）進(jìn)行校正。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 采用SIFT Score 軟件預(yù)測氨基酸改變是否影響基因功能，如SIFT 值＜0.05則表明該變異可嚴(yán)重影響蛋白功能。采用SIFT Score Pred 軟件預(yù)測其致病性，D 為有害，T 為良性。

2 結(jié)果

本研究通過對79 例健康對照和101 例銀屑病病例中的GC 基因及其上、下游各2 kb 進(jìn)行全長測序，共測得94 個SNP。按上述標(biāo)準(zhǔn)篩選出93 個SNP 進(jìn)行基于SNP 的關(guān)聯(lián)分析。

2.1 基于SNP 的關(guān)聯(lián)分析

對篩選出的93 個SNP 在4 種遺傳模式下進(jìn)行 關(guān) 聯(lián) 分 析（圖1～4），有21 個SNP 在 至 少1 種遺傳模式下有統(tǒng)計學(xué)意義（P值＜0.05）。這些SNP 的OR值 為0.289～2.295，95%CI為0.048～12.670（表1）。 這21 個SNP 中，16 個（rs1565 572、rs16845007、rs16846912、rs222009、rs222010、rs222035、 rs222040、 rs2276460、 rs2282678、rs3755967、 rs705120、 rs705121、 rs73827381、rs73827382、rs7668653、rs844806）位 于 內(nèi) 含 子區(qū)，3 個（rs16847118、rs72649506 和rs72649508）位于非翻譯區(qū)域（untranslational region，UTR），2個（rs4588 和rs4752）位于外顯子區(qū)。

圖1 共顯性模型的卡方檢驗曼哈頓圖Fig 1 Manhattan plot of Chi square test based on codominant mode

圖2 顯性遺傳模型的卡方檢驗曼哈頓圖Fig 2 Manhattan plot of Chi square test based on dominant mode

圖3 隱性遺傳模型的卡方檢驗曼哈頓圖Fig 3 Manhattan plot of Chi square test based on recessive mode

圖4 等位基因模型的卡方檢驗曼哈頓圖Fig 4 Manhattan plot of Chi square test based on allelic mode

表1 有統(tǒng)計學(xué)差異的21 個SNP 的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（卡方檢驗）Tab 1 Association analyses results of 21 SNPs with statistical differences（Chi square test）

續(xù)表

2.2 生物信息學(xué)分析

位于外顯子11 的rs4588G＞T 為非同義突變，可導(dǎo)致蘇氨酸轉(zhuǎn)換為賴氨酸（Thr→Lys），SIFT Score 為0.481、SIFT Score Pred 為T，而位于外顯子8 的rs4752A＞G 未導(dǎo)致氨基酸的改變，為同義突變。

3 討論

GC 基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、修飾、翻譯后合成分布在3 個結(jié)構(gòu)域上，由458 個氨基酸組成的VDBP。不同領(lǐng)域的學(xué)者均認(rèn)為GC 基因與體內(nèi)維生素D 水平及活性顯著相關(guān)，是合成活性維生素D 并發(fā)揮其生物學(xué)功能的關(guān)鍵基因。本研究旨在SNP 的層面探索GC基因與尋常性銀屑病的關(guān)系。

SNP 可位于基因的任何位置，其中位于外顯子區(qū)域的SNP 稱為編碼SNP，編碼SNP 發(fā)生變異存在兩種形式。一是同義突變，即堿基發(fā)生變異，但翻譯的氨基酸無變化。本研究中發(fā)現(xiàn)的rs4752 雖然出現(xiàn)了A→G 變異，但其翻譯的仍為半胱氨酸（Cys），并不引起基因功能改變。雖然生物信息學(xué)分析提示該位點翻譯的氨基酸未發(fā)生改變，但在本研究中4 種不同遺傳模式的統(tǒng)計學(xué)分析中提示其在共顯性、顯性及等位基因3 種遺傳模式下均與銀屑病易感性相關(guān)（分別為P=0.012、P=0.009、P=0.022）。這可能和同義突變雖然不能引起氨基酸的變化，但可以影響信使RNA 的剪切、穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)相關(guān)［10］，這些變化均可對蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展，亦可作為藥物干預(yù)靶點。同義突變導(dǎo)致疾病發(fā)生的另一種可能：雖然部分同義突變并未影響RNA 剪切，也不影響信使RNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)，但是卻改變了合成蛋白的折疊結(jié)構(gòu)，從而影響了基因功能，據(jù)推測這可能是變異后的密碼子是罕見密碼子的結(jié)果［11］。另一種是非同義突變，即SNP 導(dǎo)致了氨基酸改變，從而很可能導(dǎo)致基因功能改變。本研究發(fā)現(xiàn)的rs4588G＞T 在共顯性模型中與銀屑病易感性相關(guān)（P=0.028），且生物信息學(xué)分析提示rs4588G＞T 會將蘇氨酸錯譯為賴氨酸。本研究的前期工作提示該SNP 的變異會導(dǎo)致VDBP 轉(zhuǎn)變?yōu)镚C2 型，且GC2 與25（OH）D3的親和力下降［12］。這提示在生物學(xué)功能上，GC 基因的不同亞型可能會影響維生素D 相關(guān)信號在組織或細(xì)胞水平上的傳遞。本研究的生物信息學(xué)分析結(jié)果提 示 該SNP 的SIFT Score 為0.481，SIFT Score Pred 為T，是良性突變。在文獻(xiàn)檢索中我們雖未發(fā)現(xiàn)rs4588 和銀屑病關(guān)聯(lián)，但有研究結(jié)果提示除了與人體內(nèi)維生素D 水平顯著相關(guān)外，其與結(jié)直腸癌的發(fā)病（OR=2.34，95%CI=1.25～4.37）及2 型糖尿病發(fā)病風(fēng)險升高（OR=8.9，95%CI=1.89～41.99，P＜0.001）均 具 有 相 關(guān) 性［5，6］。此 外，也 有 研 究 表 明rs4588 僅與血清維生素D 水平基礎(chǔ)值相關(guān)（P=7.86×10-7），而與補(bǔ)充維生素D 后的血清維生素D水平變化無關(guān)（P=0.15）［13］。

本次研究尚發(fā)現(xiàn)位于內(nèi)含子區(qū)的16 個易感SNP，其中11 個SNP 未見與疾病具有相關(guān)性的報道（rs1565572、rs16845007、rs222009、rs222010、rs2276460、 rs2282678、 rs705121、 rs73827381、rs73827382、rs7668653 及rs844806），其余5 個SNP（rs222040、 rs16846912、 rs222035、 rs3755967、rs705120）與其他疾病或血清25（OH）D3水平存在相關(guān)性。

一項來自挪威的578 對新生兒母子（女）參與的研究表明胎兒的rs222040 是新生兒臍帶血中25（OH）D3水平相關(guān)性最強(qiáng)的預(yù)測因子（P＜0.001）。該研究進(jìn)一步證實除了肝臟外，胎盤中也可表達(dá)GC 基因，但母體和胎兒中的VDBP 是否參與胎盤維生素D 的轉(zhuǎn)運(yùn)尚有待進(jìn)一步驗證［14］。在有2 207名高加索婦女參與的有關(guān)血清25（OH）D3與維生素D 代謝通路基因的相關(guān)研究中也表明rs222040 與血清25（OH）D3基礎(chǔ)值高度相關(guān)（P=1.59×10-4）［13］。

來自上海的3 108 人參與的研究提示，單倍型rs842999/rs705120/rs222040/rs4588/rs7041/rs104 88854 GAGTAC 是導(dǎo)致25（OH）D3水平降低的風(fēng)險因素（P=2.0×10-5），而低水平的25（OH）D3也與VDBP 水平降低顯著相關(guān)。據(jù)此，研究者推測GC基因的變異導(dǎo)致VDBP 水平降低進(jìn)而引起血清25（OH）D3水平降低，但他們認(rèn)為這一結(jié)果由該單倍型中內(nèi)含子區(qū)域的SNP（包括rs222040）導(dǎo)致的可能性不大，而非同義突變的rs4588 可能是其潛在的致病風(fēng)險位點［15］。此外，一項關(guān)于家族性哮喘及維生素D 代謝信號通路的相關(guān)研究表明，rs222040 與血清總IgE 水平升高相關(guān)而與維生素D 水平不相關(guān)（PIgE=0.016，P25（OH）D3=0.382）［7］。這 提 示 本 研 究 中發(fā)現(xiàn)的部分變異也可能并不直接對尋常性銀屑病發(fā)病產(chǎn)生影響，而只是一個標(biāo)記位點，它和真正的尋常性銀屑病的易感位點間存在強(qiáng)連鎖不平衡。

2010 年1 篇 載 于Lancet 上 的 文 獻(xiàn) 提 示，rs3 755967 與體內(nèi)低水平的25（OH）D3水平顯著相關(guān)（P=2.42×10-75）［16］。此后多名學(xué)者對rs3755967 進(jìn)行了進(jìn)一步研究。其中一項浙江舟山2 658 名孕婦參與的GC 基因多態(tài)性與孕婦體內(nèi)25（OH）D3水平及補(bǔ)充維生素D 后25（OH）D3水平變化的關(guān)聯(lián)研究表明［17］，rs3755967 在整個妊娠周期 中均與 較低的25（OH）D3水平相關(guān)（P≤0.0001），且在孕早期補(bǔ)充維生素D 后，不同的基因型（CT/TT）與體內(nèi)25（OH）D3水平上升差異明顯相關(guān)（P值均＜0.0001）。該研究還發(fā)現(xiàn)rs3755967 和rs7041 呈高度LD（r2＞0.96）?；谠撽P(guān)聯(lián)分析結(jié)果，研究者認(rèn)為是rs4588和rs7041 這兩種非同義突變合成的不同亞型的VDBP 對維生素D 親和力的差異導(dǎo)致了妊娠周期中25（OH）D3水平不同及補(bǔ)充維生素D 后體內(nèi)25（OH）D3上升的差異變化，而非rs375596 對血清游離25（OH）D3水平有直接影響。

一項美國團(tuán)隊利用上海乳腺癌研究中心Ⅰ期及Ⅱ期數(shù)據(jù)的GWAS 研究表明rs3755967 與中國女性乳腺癌風(fēng)險無明顯相關(guān)性［18］，而一項來自國內(nèi)關(guān)于中國女性乳腺癌的分層研究則提示，rs3755967 的CT 基因型與乳腺癌低風(fēng)險顯著相關(guān)（OR=0.77，95%CI=0.62～0.96，P=0.021）。結(jié)合既往的流行病學(xué)調(diào)查，該團(tuán)隊認(rèn)為GC 基因通過影響體內(nèi)活性25（OH）D3水平調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡，在乳腺細(xì)胞中，低水平的25（OH）D3可能會削弱酶的活性和減少1，25（OH）2D3的生成來調(diào)節(jié)這一作用。此外，該研究尚發(fā)現(xiàn)rs17467825、rs2298850、rs3755967 和rs2282679 高度連鎖不平衡（r2=1.0、0.9、1.0），結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，他們認(rèn)為rs2282679 與腫瘤風(fēng)險相關(guān)，而rs3355967 位于內(nèi)含子區(qū)域，可能參與基因表達(dá)調(diào)控或影響氨基酸修飾，確切原因需要進(jìn)一步探索［8］。另有研究顯示，VDBP 還可能通過非維生素D 信號通路直接參與包括趨化作用和巨噬細(xì)胞活化在內(nèi)的抗腫瘤過程。該研究認(rèn)為VDBP 參與激活巨噬細(xì)胞分子，并通過葡萄糖苷酶去糖基化形成VDBP-巨噬細(xì)胞激活因子，增強(qiáng)促凋亡酶的活性，最終通過JAK1/2 和p38 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)展［19］。

一項有79 366 名參與者的國際研究證實，歐洲和北美人群中rs3755967 與血清25（OH）D3水平降低顯著相關(guān)（P=4.7×10-343）［20］，這一結(jié)論與德國一項8 417 名老人參與的研究結(jié)果相似［21］。而另一項相關(guān)研究提示rs3755967 與阿拉伯人及南亞人的血清25（OH）D3低水平顯著相關(guān)，與東南亞人的血清25（OH）D3水平不相關(guān)［22］。這提示rs3355967 可能在不同種族間的生物學(xué)效應(yīng)不盡相同，亦有可能由于被檢測人群的生活環(huán)境不同，導(dǎo)致結(jié)果有所差異。

此外，rs222035、rs222040 及rs705120 被證實分別與血清游離25（OH）D3水平、家族性哮喘及血清25（OH）D3基 線 水 平 存 在 相 關(guān) 性，且rs7041、rs222035 和 rs842999 高 度 連 鎖 不 平 衡（r2＞0.92）［7，13，23，24］。

本研究尚發(fā)現(xiàn)3 個位于UTR 的SNP（rs1684 7118、rs72649506、rs72649508），經(jīng)檢索，均未發(fā)現(xiàn)與銀屑病相關(guān)的報道，尚需進(jìn)一步研究。

總之，本研究揭示，在海南籍漢族人群中，有21個與尋常性銀屑病有關(guān)的易感SNP，位于GC 基因的內(nèi)含子、外顯子及UTR，其中外顯子上的SNP 可導(dǎo)致蛋白改變，且有較大可能影響基因功能。這表明GC 基因與尋常性銀屑病的易感性存在關(guān)聯(lián)，但因本研究樣本量較小，尚待在大樣本量和/或其他人群中進(jìn)行更大規(guī)模的探索，并進(jìn)而通過功能學(xué)研究證實。

作者貢獻(xiàn)度說明：

劉琨：并列第一作者，負(fù)責(zé)病例標(biāo)本收集、實驗操作及論文初稿寫作等；劉軍麟：并列第一作者，負(fù)責(zé)研究設(shè)計、文章撰寫指導(dǎo)及修改工作；袁丞達(dá)：負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)處理，文章修改；陸春婉：并列通訊作者，負(fù)責(zé)病例和對照標(biāo)本收集、實驗操作；殷梅：通訊作者，對照樣本收集、文獻(xiàn)檢索及文章內(nèi)容審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。