王 莉，陳小菊，林 青，鄭林媚，孔 嬌，毛東瑞

（海南省人民醫(yī)院，海南醫(yī)學院附屬海南醫(yī)院產科，海南?？?570013）

子癇前期（peeclampsia，PE）是妊娠期特有的一種疾病，以妊娠20 周后出現(xiàn)新發(fā)高血壓及多器官功能受累為臨床表現(xiàn)，常導致母兒高患病率及高死亡率［1，2］。PE 病因不清，機制復雜多樣，目前認為母胎界面免疫失衡、低氧、滋養(yǎng)細胞侵襲異常、過度全身炎癥反應是PE 的主要發(fā)病機制［3，4］。其中外來抗原導致母胎界面免疫失衡成為研究熱點［5］。

程序性細胞死亡配體 1（program cell death-ligand-1，PD-1）是外周組織T 淋巴細胞介導的免疫應答的主要免疫抑制因子，通過限制效應T細胞反應介導引起外周組織損傷，不僅參與病毒與細菌引起的感染性疾病、腫瘤免疫逃逸、移植排斥免疫及自身免疫等［6-8］，而且與母胎免疫耐受誘導以及妊娠維持密切相關［9］。研究證明［10-13］，PD-1 在PE患者外周血Treg 細胞上表達水平較同期正常孕婦增加，在Thl7 細胞上的表達水平卻比同期正常孕婦降低，且這種差異與病情的嚴重程度正相關，這種差異表達抑制了Treg 細胞的產生及分化，卻異常激活了Thl7 細胞。由此，我們推測PD-1/PD-L1 通路功能失調可能是PE 患者Treg/Th17 失衡的原因。本研究檢測PE 患者母胎界面PD-1、PD-L1 、Foxp3和RORγc 的表達水平，探討其在PE 的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2021 年3 月～2022 年3 月在海南醫(yī)學院附屬海南醫(yī)院接受住院診治并終止妊娠的單胎妊娠孕婦，其中PE 組、輕度PE（sPE）組和對照組各20例，診斷標準參考第8 版《婦產科學》。各組受試者的年齡、孕次和產次等差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。排除標準：本次妊娠為多胎妊娠，孕前患有糖尿病、高血壓、慢性腎臟病和肝炎等疾病，或者有自身免疫性疾病或血液病，或曾接受輸血、移植、免疫治療等治療，或有煙酒嗜好及濫用藥物史。本課題經海南醫(yī)院醫(yī)學倫理委員批準開展，且簽署了研究內容知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1標本采集及處理 獲取PE 組、sPE 組及對照組受試者的胎盤組織。剖宮產術胎盤娩出后，無菌操作，自胎盤母體面切取約100 mg 的胎盤組織，注意勿切取鈣化或出血部分，生理鹽水沖洗3 次，隨即裝于RNA 酶的EP 管內，置入-80 ℃低溫冰箱保存。

1.2.2qRT-PCR 法 檢 測 胎 盤 中PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγcmRNA 的表達水平 NCBI 上查找目的基因mRNA 系列，采用Primer 6.0 軟件設計引物，PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγc的引物均由廣東文華氏生物有限公司合成。取出保存的胎盤組織，提取組織總RNA 并檢測其純度，采用PCR 的逆轉錄模式合成cDNA（試劑盒說明書嚴格執(zhí)行操作），以cDNA 模板，認真按照試劑盒的操作步驟（美國ABI 公司）進行PCR 擴增反應，加樣，上機，檢測目的基因PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγc。以上步驟重復3 次，最終值為3 次的平均值，以此計算mRNA 表達水平?；蛳鄬Ρ磉_水平用2-ΔΔCT表示（內參為GAPDH）。PCR 引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Tab 1 PCR primer sequence

1.2.3Western blot 法 檢 測 胎 盤 中PD-1、PD-L1、Foxp3 和RORγc 蛋白的表達水平 取凍存的胎盤組織，RIPA 裂解液（索萊寶，北京）提取組織蛋白，BCA 試劑盒（索萊寶，北京）進行蛋白濃度定量，上樣，SDS-PAGE 電泳后轉膜，將膜浸入封閉液，室溫搖床1 h，結合兔抗人PD-1 和PD-L1、鼠抗人Foxp3和RORγc（均為Abcam，美國）以及鼠抗GAPDH（CST，美國），隨后置入4 ℃冰箱，次日取出，加入羊抗兔／抗鼠雙抗抗體，輕吹混勻，室溫搖床1 h。充分洗滌，凝膠成像系統(tǒng)掃描，ImageJ 軟件分析掃描結果。

1.3 統(tǒng)計學處理

將所有數(shù)據輸入SPSS 21.0 軟件進行處理，正態(tài)計量資料采用（±s）表示，使用方差分析進行差異比較；若為非正態(tài)分布，則用M（P25，P75）表示，秩和檢驗進行差異比較。計數(shù)資料采用例（%）表示，卡方檢驗進行差異比較。檢驗水準α＝0.05（雙側），兩兩比較時α 校正＝0.05／比較次數(shù)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料分析

PE 組、sPE 組及對照組的臨床資料特征。3 組研究對象年齡、孕周、孕次、產次比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），收縮壓、舒張壓比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 各組臨床資料比較（n=20，±s）Tab 2 Comparison of the clinical data of all groups（n=20，±s）

表2 各組臨床資料比較（n=20，±s）Tab 2 Comparison of the clinical data of all groups（n=20，±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與PE 組比較，##P＜0.01。

組別sPE 組PE 組對照組舒張壓（mmHg）70.98±2.19**##90.56±4.53**105.36±3.43 470.300 0.000 FP年齡（歲）26.84±3.74 27.13±3.26 26.99±3.22 0.242 0.786孕周36.45±1.86 37.27±0.68 38.17±1.67 0.297 0.744孕次1.23±0.59 1.34±0.61 1.28±0.57 1.092 0.342產次0.19±0.51 0.20±0.46 0.22±0.42 0.258 0.773收縮壓（mmHg）164.06±5.00**##151.94±4.50**114.39±8.62 289.100 0.000

2.2 PD-1、PD-L1、Foxp3 和RORγc 的mRNA 表達水平

qRT-PCR 法 檢 測 各 組 胎 盤PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγc的mRNA 表達水平，結果顯示，與對 照 組 相 比，PE 組 和sPE 組 的PD-1、PD-L1、Foxp3mRNA 表達水平均明顯下降（P均＜0.05）（圖1A、B、C）；其中，sPE 組受試者的PD-1、PD-L1和Foxp3mRNA 較PE 組下降更顯著，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。相較正常孕婦胎盤組織，PE 組受試者和sPE 組受試者RORγc基因的mRNA 表達均顯著增高；sPE 組受試者的RORγc基因mRNA 表達較PE 組升高更顯著（圖1D），組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

圖1 PD-1、PD-L1、Foxp3 和RORγc 的mRNA 表達水平Fig 1 The mRNA expression level of PD-1，PD-L1，F(xiàn)oxp3 and RORγc

表3 各組患者PD-1、PD-L1、Foxp3 和RORγc mRNA 表達水平（n=20，±s）Tab 3 The mRNA expression level of PD-1，PD-L1，F(xiàn)oxp3 and RORγc of all groups（n=20，±s）

表3 各組患者PD-1、PD-L1、Foxp3 和RORγc mRNA 表達水平（n=20，±s）Tab 3 The mRNA expression level of PD-1，PD-L1，F(xiàn)oxp3 and RORγc of all groups（n=20，±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與PE 組比較，##P＜0.01。

RORγc 1.89±0.05**##1.29±0.04**0.33±0.02 7 811 0.000組別sPE 組PE 組對照組F P PD-1 0.08±0.01**##0.19±0.01**0.58±0.02 8 884 0.000 PD-L1 0.09±0.01**##0.21±0.01**0.62±0.02 9 173 0.000 Foxp3 0.22±0.02**##0.49±0.04**0.87±0.05 1 226 0.000

2.3 對 照 組、PE 組 及sPE 組 胎 盤PD-1、PD-L1、Foxp3 和RORγc 蛋白的表達水平

Western blot 法檢測結果顯示（圖2A），與對照組相比，PE 組和sPE 組的PD-1、PD-L1、Foxp3 蛋白表達水平明顯下降（圖2B、C、D）；與PE 組相比，sPE 組患者的PD-1、PD-L1 和Foxp3 蛋白表達水平下降更顯著，3 組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，PE 組和sPE 組的RORγc蛋白表達水平明顯上升；與PE 組相比，sPE 組患者的RORγc 蛋白表達升高更顯著（圖2E），組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組患者PD-1、PD-L1、Foxp3 和RORγc 蛋白表達水平（n=20，±s）Tab 4 Protein expression levels of PD-1，PD-L1，F(xiàn)oxp3 and RORγc of all groups（n=20，±s）

表4 各組患者PD-1、PD-L1、Foxp3 和RORγc 蛋白表達水平（n=20，±s）Tab 4 Protein expression levels of PD-1，PD-L1，F(xiàn)oxp3 and RORγc of all groups（n=20，±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與PE 組比較，##P＜0.01。

RORγc 1.68±0.05**##0.87±0.03**0.28±0.02 8 362 0.000組別sPE 組PE 組正常組FP PD-1 0.38±0.02**##0.59±0.01**0.98±0.03 3 556 0.000 PD-L1 0.33±0.01**##0.62±0.02**0.89±0.03 2 011 0.000 Foxp3 0.09±0.01**##0.20±0.02**0.58±0.03 2 864 0.000

圖2 PD-1、PD-L1、Foxp3 和RORγc 蛋白的表達水平Fig 2 Protein expression level of PD-1，PD-L1，F(xiàn)oxp3 and RORγc

3 討論

適應性和先天免疫系統(tǒng)在不同類型的妊娠疾病如子癇前期的發(fā)生過程和發(fā)病機制中具有重要的作用。螺旋動脈調節(jié)失調和滋養(yǎng)細胞侵襲不足，刺激胎盤產生各種炎癥細胞因子和抗血管生成因子導致PE。T 淋巴細胞在妊娠免疫耐受及免疫應答中的作用成為近年來的研究熱點之一。

Th1、Th2、Th17 和Treg 細胞均來源于CD4+T淋巴細胞，這些細胞之間的正常聯(lián)系對于預防妊娠疾?。ㄈ鏟E）是必要的。Treg 通過調節(jié)抗原提呈、靶細胞裂解、分泌抑制性細胞因子等不同機制發(fā)揮抑制作用［14，15］，在維持正常妊娠及減少母胎并發(fā)癥中起到重要作用［16］。如果Treg 細胞數(shù)目減少，其發(fā)揮的免疫抑制功能相應減弱，從而引起母胎界面免疫耐受受損，是導致不孕、復發(fā)性流產、子癇前期等不良妊娠結局的重要病因［17］。已有研究證實，Tregs 的免疫抑制和細胞調節(jié)功能均依賴于Foxp3的表達［18，19］。RORγc 分子是調節(jié)Th17 細胞的關鍵轉錄因子，參與自身免疫性疾病發(fā)病以及移植后機體的排異反應［20］。有研究表明，F(xiàn)oxp3 過表達能進一步誘導幼稚的CD4+T 前體轉化為Tregs 細胞［21］，相反，F(xiàn)oxp3 的功能缺陷將導致人類先天性Treg 細胞缺陷和嚴重的系統(tǒng)性免疫紊亂［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者胎盤組織中的Foxp3 低表達，且隨著疾病進展而加劇下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示Foxp3 低表達可導致機體的免疫抑制作用下降，導致母胎間免疫耐受性失衡，誘發(fā)PE。Th17 細胞的核轉錄因子RORγc 隨著病情的加重明顯上升（P＜0.01），提示PE 患者母胎界面存在Treg數(shù)量的缺乏和Th17 細胞的過度激活，與國內外研究者的結論一致［23-27］。Treg 和Th17 細胞失衡可誘發(fā)PE 的慢性炎癥，然而導致其細胞免疫失衡的主要因素尚未完全闡明。

PD-1 常見于激活的T 細胞、B 細胞和巨噬細胞等效應細胞，PD-L1 不僅存在腫瘤細胞及上皮細胞，還能胎盤的滋養(yǎng)細胞上表達［27］。PD-1 及PD-LI之間的相互作用已成為調節(jié)免疫反應和外周耐受性的關鍵角色。PD-1 通過負性調控T 細胞分泌促炎因子來下調免疫系統(tǒng)對機體的反應［28-30］。研究證實，母胎耐受以及正常的妊娠維持是通過PD-1/PD-L1 通路誘導Treg 細胞分化，阻止Th17 細胞活化，促進妊娠期Treg/Th17 細胞平衡來實現(xiàn)的［31-34］。研究發(fā)現(xiàn)，給孕鼠腹腔注射anti-PD-L1，引起PD-1/PD-L1 通路傳導阻滯，抑制Treg 細胞發(fā)育，異?；罨疶hl7 細胞，最終導致小鼠的產仔數(shù)及仔鼠的重量下降，胚胎流產率增加［35］。PD-1/PD-L1 通路通過同時利用兩種外周耐受機制來防御潛在的致病效應T 細胞：（1）促進Treg 的發(fā)育和功能；（2）直接抑制致病效應T 細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，PE 組及sPE 組患者母胎界面PD-1、PD-L1 表達降低；PD-L1 的低表達，抑制了輔助性T 細胞分化為Treg 細胞，促進Treg 細胞凋亡，表現(xiàn)為母胎界面Foxp3 表達水平降低；PD-1 低表達，促 進Th17 細胞的分化和增殖，表現(xiàn)為母胎界面RORγc 的表達水平顯著升高；這結果與文獻報道結果一致［35，27］，因此，PD-1/PD-L1 通路的改變可能與人類妊娠中Treg/Th17 失衡有關。

綜上所述，PD-1/PD-L1 的表達可能是平衡Tregs 和Th17 細胞并維持胎母界面耐受的關鍵因素。由此推測，PE 炎癥環(huán)境下，CD4+T 細胞向Thl7 細胞分化，從而產生Treg/Thl7 失衡，PD-1/PD-L1 信號通路在該過程中發(fā)揮重要的調控作用。

作者貢獻度說明：

王莉參與論文選題、設計、部分實驗及論文撰寫、修改；陳小菊：負責標本收集及臨床資料統(tǒng)計；林青、鄭林媚、孔嬌和毛東瑞：負責實驗及統(tǒng)計學分析。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。