鄭 晶，魏 尚，鄧慧孜，牛海艷

（1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科，海南 ?？?570000；2.海南醫(yī)學院病理教研室，海南 海口 570000）

肝細胞性肝癌是原發(fā)性肝癌中最常見類型，影響肝細胞性肝癌患者預后走向的重要環(huán)節(jié)是早發(fā)現、早治療［1］。小肝癌期往往缺乏特異性臨床癥狀而不易發(fā)覺，臨床確診常依賴于穿刺活檢病理診斷［2］。但是肝細胞性肝癌組織學形態(tài)較復雜多變。高分化肝細胞性肝癌需與正常肝組織或良性肝結節(jié)性病變相鑒別；低分化肝細胞性肝癌則需要與肝內膽管細胞癌以及轉移性腺癌等相鑒別。在實際臨床應用中，單單僅靠一種抗體診斷過于理想化，往往不可靠，特別是鑒別肝細胞增生性病變良、惡性，需要聯合多種抗體共同診斷［3］。有相關研究表明CD10、HSP70、GS 和CD34 在鑒別高分化肝細胞性肝癌與肝局灶性結節(jié)狀增生以及肝硬化等良性肝病變方面有重要的診斷意義［4，5］。但在實際工作中時常會遇到標記物表達與形態(tài)學不符合或者標記物表達不確切而無法起到鑒別診斷作用的情況。且上述標記物在肝細胞性肝癌診斷應用中的特異性和敏感性很難統(tǒng)一。是否可以引入一種新的標記物，作為肝細胞性肝癌的診斷標記物的關鍵補充？甾醇氧-酰基轉移酶（Sterol O-acyltransferase，SOAT），又稱酰基輔酶A：膽固醇?；D移酶（Acyl-CoA：cholesterol acyltransferase，ACAT），是膽固醇酯化的關鍵酶［6］。多項研究表明，SOAT1 在肝細胞性肝癌中表達上調，通過改變腫瘤細胞內膽固醇穩(wěn)態(tài)進而促進腫瘤細胞增 殖［7，8］。在 本 研 究 中，筆 者 嘗 試 探 討SOAT1 聯合多種標記物在肝細胞性肝癌診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

收集海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2019 年8 月1 日～2021 年10 月30 日肝細胞性肝癌及配對癌旁肝組織樣本，共58 例，良性肝病變組織（包括肝臟局灶結節(jié)性增生及肝腺瘤）共12 例，并制作組織芯片。

1.2 試劑

SOAT1 一抗購自美國Thermo Fisher Scientific，HSP70、GS、CD10、CD34 一抗及免疫組化檢測用試劑均購自福州邁新試劑公司。

1.3 方法

1.3.1組織芯片制作 首先制作沒有裂紋的完整空白蠟塊，并鉆出組織位置孔。按順序將肝細胞性肝癌組織、癌旁肝組織及良性肝病變組織排進已鉆好洞的空白蠟塊中，并在適當位置選取胃黏膜組織作為標志。蠟塊表面淋熱蠟封邊，至于模具上，烤箱（60 ℃）1 h。室溫放置10 min 左右，冰箱充分冷凍后脫模［9］。

1.3.2免疫組織化學染色及結果判讀 運用Envision System 二步法進行免疫組化染色，一抗SOAT1 稀釋比為1∶50。免疫組化結果判讀依據文獻［10］，具體見表1：染色分數=染色表達強度×陽性表達范圍。評分標準如下：2 分以下為陰性（-），2分及以上為陽性（+）。

表1 SOAT-1 免疫組化結果判讀標準Tab 1 Interpretation criteria of SOAT-1 immunohistochemical results

依據以下HSP70、GS、CD10、CD34 四種抗體表達模式［4，5］，做出陰/陽性判斷。

HSP70 陽性表達模式：在肝細胞性肝癌組織中癌細胞的細胞質和細胞核呈現黃色或（和）棕黃色顆粒染色，彌漫著色；陰性表達模式：肝細胞胞質不著色，核呈淺藍色，陰性表達為主。

GS 陽性表達模式：在肝細胞性肝癌組織中癌細胞主要呈強弱不等的彌漫著色或完全陰性；陰性表達模式：表達于中央靜脈周圍肝細胞的細胞質，呈現黃色或（和）棕黃色顆粒染色，遠離中央靜脈的肝細胞胞質不著色，核呈淺藍色。

CD10 陽性表達模式：在肝細胞性肝癌組織中表達減少、不表達或強陽性表達；陰性表達模式：肝細胞間毛細膽管的細胞膜或細胞質呈現小管狀、分枝狀、逗點狀的黃色或（和）棕黃色染色。

CD34 陽性表達模式：在肝細胞性肝癌組織中表達于癌細胞梁索間的血管內皮細胞，呈裂隙狀或分支狀均勻彌漫分布；陰性表達：模式肝血竇內皮細胞染色為陰性。

所有免疫組化結果由3 名資深病理醫(yī)師獨立判讀，綜合3 名病理科醫(yī)師的判讀結果作為最終結果。

1.3.3 統(tǒng)計學處理 利用IBM SPSS Statistics 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。用卡方檢驗四格表中部分理論頻數小于5，容易出現偏差，故運用確切概率法進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。本研究無法評估各種標記物的敏感性和特異性。根據文獻［11］分別評估肝細胞性肝癌每種標記物免疫組織化學染色的陽性符合率（Positive Percent Agreement，PPA）與非肝細胞性肝癌組織中的陰性符合率（Negative Percent Agreement，NPA）作為替代方法。PPA 類似于敏感性，而NPA 類似于特異性。

2 結果

2.1 SOAT1 蛋白表達

對組織芯片行SOAT1 免疫組化檢測，發(fā)現SOAT1 在肝細胞性肝癌組織癌細胞胞質中和胞膜上表達，見圖1；58 例肝細胞性肝癌組織中有37 例SOAT1 表達為陽性，陽性表達率為63.79%。58 例配對癌旁組織中均未見SOAT1 表達，陰性表達率為100.00%。SOAT1 蛋白在癌組織中的表達水平明顯上調（P＜0.001），見表2。12 例良性肝病變組織中SOAT1 亦未見表達，陰性表達率為100.00%，其表達水平明顯低于肝細胞性肝癌組織（P=0.001），見表3。且不同分化程度的肝細胞性肝癌中表達情況不同。在高分化肝細胞性肝癌中SOAT1普遍呈現低表達或不表達（圖1A），即染色強度弱且僅少量腫瘤細胞著色；在低分化肝細胞性肝癌中SOAT1 普遍呈現高表達（圖1B），即染色強度強且多量腫瘤細胞著色。

圖1 SOAT1 在不同分化程度肝細胞性肝癌中的表達（×400）Fig 1 Expression of SOAT1 in hepatocellular carcinoma with different degrees of differentiation（×400）

2.2 HSP70、GS、CD10、CD34 的表達及其與SOAT1 表達的關系

58 例肝細胞性肝癌組織HSP70、GS、CD10、CD34 四種標記物的表達情況如下（圖2 及表2）：HSP70 陽性表達48 例，陽性符合率為82.75%，陽性表達模式為在肝細胞性肝癌組織中癌細胞的細胞質和細胞核呈現黃色或（和）棕黃色顆粒染色，彌漫著色（圖2A）；GS 陽性表達52 例，陽性符合率為89.66%，陽性表達模式為在肝細胞性肝癌組織中癌細胞主要呈強弱不等的彌漫著色或完全陰性（圖2D）；CD10 陽性表達共37 例，陽性符合率為63.79%，陽性表達模式為在肝細胞性肝癌組織中表達減少、不表達或強陽性表達（圖2C）；CD34 全部呈現陽性，陽性符合率為100.00%，陽性表達模式為在肝細胞性肝癌組織中表達于癌細胞梁索間的血管內皮細胞，呈裂隙狀或分支狀均勻彌漫分布（圖2D）。58 例配對癌旁組織上述4 種標記物的陰性表達模式如前材料與方法中所述。HSP70 陰性表達（圖2E）56例，陰性符合率為96.55%；GS 陰性表達（圖2F）3例，陰性符合率為5.17%；CD10 陰性表達（圖2G）共57 例，陰性符合率為98.27%；CD34 陰性表達（圖2H）20 例，陰性符合率為34.48%。HSP70 和CD34 在肝細胞性肝癌組織中的表達均高于相應的癌旁肝組織（P＜0.001，表2），CD10 在肝細胞性肝癌組織中的表達低于相應的癌旁肝組織（P＜0.001，表2），而GS 在肝細胞性肝癌組織中和相應癌旁肝組織中的表達沒有明顯差別（P=0.490，表2）。

圖2 HSP70、GS、CD10、CD34 在癌旁肝組織及肝細胞性肝癌中的表達情況（×400）Fig 2 Expression of HSP70，GS，CD10，CD34 in paracancerous tissue and hepatocellular carcinoma（×400）

表2 5 種標記物在肝細胞性肝癌與癌旁肝組織中的表達（n=58）Tab 2 Expression of five markers in hepatocellular carcinoma and adjacent liver tissues（n=58）

12 例良性肝病變組織中（表3），HSP70 全部呈現陰性表達，陰性符合率為100.00%；GS 全部呈現陽性表達，陰性符合率為0%；CD10 標記10例呈現陰性表達，陰性符合率為83.34%；CD34標記1 例呈現陰性表達，陰性符合率為8.33%。分別對肝細胞性肝癌組織和良性肝病變組織進行分析發(fā)現，HSP70 在肝細胞性肝癌組織中的表達水平高于良性肝病變組織（P＜0.001，表3），CD10 在肝細胞性肝癌組織中的表達水平低于良性肝病變組織（P=0.004，表3），而GS、CD34 在肝細胞性肝癌組織中的表達水平與良性肝病變組織無明顯差別（P=0.309，P=0.171，表3）。

表3 5 種標記物在肝細胞性肝癌與良性病變肝組織中的表達Tab 3 Expression of five markers in liver tissue of hepatocellular carcinoma and benign lesions

在肝細胞性肝癌中，SOAT1 與HSP70、GS、CD34 表達水平有一定相關性（P=0.001，P＜0.001，P＜0.001，表4），而SOAT1 與CD10 的表達無明確相關性（P=0.092，表4）。10 例HSP70陰性肝細胞性肝癌病例中有2 例SOAT1 高表達，6 例GS 陰 性 病 例 中 有2 例SOAT1 高 表 達，21 例CD10 陰性肝細胞性肝癌病例中有10 例SOAT1 高表達。如果以任意3 種標記物陽性為診斷標準，不將SOAT1 計入標記物行列，58 例肝細胞性肝癌中有39 例可被診斷，診斷率為67.24%；而將SOAT1 計入標記物行列，58 例肝細胞性肝癌中有48 例可被診斷，診斷率可提高至82.76%。

表4 SOAT1 與HSP70、GS、CD10、CD34 在肝細胞性肝癌中表達水平的關系Tab 4 Relationship between SOAT1 and the expression levels of HSP70，GS，CD10 and CD34 in hepatocellular carcinoma

3 討論

原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤，全球發(fā)病率及死亡率高，嚴重影響全人類的生命健康和工作生活［12，13］。亞洲是世界上原發(fā)性肝癌發(fā)病率較高的地區(qū)之一［14］，并且近年來其發(fā)病率有所上升。肝細胞性肝癌是原發(fā)性肝癌中最常見類型，約占所有肝癌的85%～90%［12，15］。有關研究表明，我國肝細胞性肝癌患者的5 年生存率僅為14%，術后5 年復發(fā)率高達70%［16］。影響肝細胞性肝癌患者預后走向的重要環(huán)節(jié)是早發(fā)現、早治療。小肝癌期往往不易發(fā)覺，當有臨床癥狀時已是中晚期，臨床確診常依賴于穿刺活檢病理診斷，但是肝細胞性肝癌組織學形態(tài)較復雜多變。高分化肝細胞性肝癌需與正常肝組織或良性肝結節(jié)性病變相鑒別；低分化肝細胞性肝癌則需要與肝內膽管細胞癌以及轉移性腺癌等相鑒別。鑒別診斷時最常使用的輔助技術手段是免疫組織化學染色。在實際臨床應用中，僅靠一種抗體診斷過于理想化，往往不可靠，特別是鑒別肝細胞性肝癌與良性肝病變組織，需要聯合多種抗體的表達結果共同輔助診斷［17］。

相關研究表明CD10、HSP70、GS 和CD34 在鑒別高分化肝細胞性肝癌與肝局灶性結節(jié)狀增生以及肝硬化等良性肝病變方面有重要的診斷意義［18］?！对l(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南（2015）》［17］也推薦使用上述標記物進行鑒別診斷。本研究根據文獻分別評估肝細胞性肝癌每種標記物免疫組織化學染色的PPA 與非肝細胞性肝癌組織中的NPA。PPA 類似于敏感性，而NPA 類似于特異性。結果表明，肝細胞性肝癌中PPA 分別為CD34 100.00%、GS 89.66%、HSP70 82.75%、CD10 63.79%；而在癌旁組織中NPA 分別為CD10 98.27%、HSP70 96.55%、CD34 34.48%、GS 5.17%；良性肝病變組織中NPA 分別為HSP70 100.00%、CD10 83.34%、CD34 8.33%、GS 0%。敏感性較好為CD34 及GS，但兩者特異性均較差；而CD10 及HSP70 特異性較好，但兩者敏感性欠缺。因此上述4 種標記物敏感性和特異性很難統(tǒng)一。另外本研究中還分別比較了上述4 種標記物在3 種不同組織中的表達情況。HSP70 在癌旁肝組織及良性肝病變組織中基本陰性表達，與其在肝細胞性肝癌中有明顯差別；CD10在癌旁肝組織及良性肝病變組織中的表達均比其在肝細胞性肝癌中的表達率高；CD34 在肝細胞性肝癌與良性肝病變組織中差別不大，但在癌旁肝組織中表達較弱；GS 在3 種組織中表達無明顯差別。結果表明，CD34 及GS 并不能很好區(qū)分肝細胞性肝癌與良性肝病變組織。基于本研究發(fā)現及實際診斷工作中遇到的問題，是否可以引入一種新的輔助診斷標記物，在肝細胞性肝癌的診斷中作為關鍵補充。

SOAT1 是膽固醇酯化中的關鍵酶，可以酯化內質網上游離膽固醇，形成膽固醇脂儲存在脂滴中，從而維持膽固醇穩(wěn)態(tài)，因此SOAT1 在細胞內膽固醇平衡中起重要作用［19］。Jiang 等［7］采用蛋白質組學研究了早期肝細胞性肝癌和乙型肝炎病毒感染相關的肝癌組織與癌旁肝組織，發(fā)現其中一組腫瘤組織SOAT1 高表達并且其腫瘤細胞內膽固醇穩(wěn)態(tài)被破壞。他們使用SOAT1 抑制劑（avasimibe）治療經過肝細胞性肝癌細胞移植的小鼠模型，結果SOAT1 高表達組腫瘤大小明顯減少，說明靶向抑制SOAT1 可以抑制肝細胞性肝癌的增殖［7］。Chen等［8］探究了SOAT1 基因變異與肝細胞性肝癌之間關系。該研究收集了221 例肝細胞性肝癌患者腫瘤組織的DNA 與229 名健康對照個體血液組織的基因組DNA，評估3 種外顯子SOAT1 變異體（rs10753191，V323V；rs3753526，L475L；rs1330 6731，Q526R）對肝細胞性肝癌發(fā)生風險的影響，其中rs10753191，V323V 變異體在校正血脂水平后與肝細胞性肝癌風險降低相關。因此，SOAT1 可能通過脂質代謝途徑改變肝細胞性肝癌風險。這項研究首次揭示了SOAT1 基因變異改變了肝細胞性肝癌的易感性。

本研究對58 例配對肝細胞性肝癌、癌旁肝組織及12 例良性肝病變組織樣本進行了SOAT1 免疫組化檢測，結果表明SOAT1 在肝細胞性肝癌組織中呈現明顯高表達（37/58），而在對應癌旁肝組織（0/58）及12 例良性肝病變組織中（0/12）均呈現低表達。且相關性分析顯示SOAT1 與HSP70、GS、CD34 表達水平有相關性，而SOAT1 與CD10 無明確相關性?；谖墨I報道及本研究結果結果，嘗試將SOAT1 引入，作為肝細胞增生性病變良惡性鑒別診斷的標記物之一，探討其聯合CD10、HSP70、GS 和CD34 在肝細胞性肝癌診斷中的應用。

本研究中有部分肝細胞性肝癌病例呈現出HSP70、GS 或者CD10 的陰性表達模式，而這些病例部分呈現SOAT1 高表達，說明SOAT1 可作為肝細胞性肝癌輔助診斷的補充標記物。我們以任意3種標記物陽性為診斷標準，不將SOAT1 計入標記物行列，58 例肝細胞性肝癌中有39 例可被診斷，診斷率為67.24%；而將SOAT1 計入標記物行列，58例肝細胞性肝癌中有48 例可被診斷，診斷率可提高至82.76%。 綜 上 所 述，SOAT1、HSP70、GS、CD10、CD34 這5 種抗體聯合應用在肝細胞性肝癌診斷中具有一定可行性。SOAT1 表達程度與腫瘤的分化程度有一定的相關性，即分化程度越低，SOAT1 表達率越高。腫瘤分化越低，預示患者預后越差。因此SOAT1 還可作為肝細胞性肝癌預后判斷指標之一。

本研究存在一定局限性，研究中肝細胞性肝癌病58 例，病例數偏少，并且該研究為回顧性研究，未進行可靠性和真實性評價。

作者貢獻度說明：

鄭晶：負責實驗設計、切片染色結果判讀及論文撰寫；牛海艷：負責切片染色結果判讀及文章審核校準；魏尚：負責病例收集，免疫組化實驗及切片染色結果判讀；鄧慧孜：負責組織收集，病例資料收集和整理

所有作者聲明無利益沖突。