于明慧，薛 傲，趙德萍，徐艷明，2，薛 慧，姜 晶，孫慧峰，張 寧，2

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007；3. 黑龍江省藥品檢驗研究院生物安全檢驗研究所，黑龍江哈爾濱 150088）

阿 爾 茨 海 默 ?。?，2］（Alzheimer's disease，AD）是老年人癡呆最常見的原因，也是世界范圍內老年患者的主要健康問題。目前，AD 的發(fā)病機制假說眾多，但尚無有效的治療藥物。研究表明，AD 的發(fā)病機制與氧化應激有關，氧化應激誘導的細胞凋亡可能是導致AD 的潛在因素［3］，改善氧化應激和細胞凋亡有助于緩解AD 造成的神經損傷［4］。中醫(yī)認為，其病病位在腦，與心肝脾腎密切相關，病性為本虛標實，其基本病機是精虧髓減，氣血兩虛，心不藏神，神失其位，形神相離發(fā)為呆證［5］。補陽還五湯出自清朝王清任的《醫(yī)林改錯》，由生黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍組成，合而用之，則大補元氣、活血通絡、祛瘀，諸癥可愈［6］。文獻報道，補陽還五湯可以通過維持血腦屏障完整性發(fā)揮神經保護作用［7］，還可以抑制AD 模型小鼠腦組織炎癥反應，減少神經細胞凋亡［8］。相關研究表明，補陽還五湯對AD 模型小鼠腦神經血管單元有一定的保護作用［9］，但在D-gal 造模后對血漿代謝物的影響等方面尚未有報道。

代謝組學將先進的分析技術平臺與多變量統(tǒng)計學分析相結合，通過對機體代謝輪廓的改變進行分析，科學地闡釋中醫(yī)藥對疾病的治療效果及其作用機制［10，11］，GC-MS 在代謝組學研究方面技術成熟穩(wěn)定，選擇性好，具有相對完善的數據庫，一次分析提供全面的信息、定性更準等優(yōu)勢［12］。本研究采用D-gal 模型以及GC-MS 代謝組學，探討補陽還五湯治療后血漿的代謝物的變化和途徑，為臨床使用提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物

選取3 月齡昆明種小鼠24 只，雌雄各12 只，體重（25±5）g，于遼寧長生生物公司購入，合格證號：SCXK（遼）2015-0001。整個實驗過程均遵循了實驗動物管理與環(huán)境保護方面的有關規(guī)范。

1.2 補陽還五湯來源及給藥劑量

黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁按處方比例混合（6∶2∶2∶2∶2∶1∶1），由黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院校醫(yī)室提供。給藥劑量18.2 g·kg-1·d-1，給藥劑量以生藥量換算。

1.3 主要儀器

新物體識別（RD-1121-NR-M，上海移數信息科技有限公司）；石蠟包埋機（SYD-B，沈陽裕德）；轉輪式切片機（RM2016，德國LEICA 公司）；電熱恒溫水浴鍋（DK-2000-IIIL，天津市泰斯特儀器公司）；氣相色譜儀Agilent 6890N、質譜儀Agilent 5975B、彈性石英毛細管柱（DB-5MS，美國安捷倫公司）。

1.4 分組及給藥

將實驗小鼠按體重隨機分為3 組?？瞻祝–ontrol）組、模型（Model）組灌胃給予雙蒸水；補陽還五湯（BYHWT）組灌胃治療，給予補陽還五湯藥液（18.2 g·kg-1·d-1）。Control 組皮下注射生理鹽水，其余各組皮下注射D-gal（125 mg·kg-1·d-1），各組造模給藥同時進行，連續(xù)8 周。第8 周進行動物行為學實驗，行為學實驗結束后采集血漿樣本。

1.5 新物體識別

按照文獻［13］進行操作，首先將小鼠放入空箱中熟悉環(huán)境，然后在箱體兩側放入兩個相同的小正方體，對小鼠進行訓練，訓練5 min 后，將其中一個小正方體替換為小球，記錄實驗小鼠5 min 內對小球的接觸時間為（Tn）和對小正方體的接觸時間為（Tf）。用識別指數=（Tn-Tf）/（Tn+Tf）表示小鼠對物體的識別能力。識別指數表示小鼠的學習記憶能力。

1.6 HE 染色

取材時用4%多聚甲醛灌流固定24 h，經緩水流沖洗一晚，用梯度乙醇以及二甲苯等試劑進行脫水，之后浸泡在融化的蠟中。隨后進行包埋，冷凍，切片5～8 mm，脫蠟，脫水，最后進行染色；染色液I 5～7 min；水洗；染色液Ⅱ，水洗；增色劑Ⅲ。脫水晾干后封片，顯微鏡下觀察小鼠海馬區(qū)病理學改變。

1.7 GC-MS 代謝組學

1.7.1 樣本處理 各組動物在行為學實驗結束后眼球取血，放入經肝素化的EP 管中，離心，分離血漿。取100 μL 血漿樣品加入300 μL 甲醇∶丙酮（1∶1），渦旋60 s，孵育10 min。離心。取200 μL 的上清液到1.5 mL 離心管中，干燥后進行衍生化。加入60 μL 甲氧胺鹽酸鹽，在70 °C 保持1 h，隨后加入60 μL MSTFA（含1%TMCS），70 °C 孵育1 h，最后加入60 μL 0.1 mg/mL 正庚烷（含22 烷）作內標，GC-MS 進樣。

1.7.2 色譜條件與質譜條件 血漿代謝組學分析在6890N-5975BGC-MS 系統(tǒng)上進行，采用DB-5MS柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，安捷倫，MA，USA）。溫度程序最初設置為70 °C，保持4 min，在15 °C/min 下上升到310 °C，然后保持4 min。輔助溫度和噴射器溫度為280 °C，噴射體積為1 μL（4∶1 分流比）。氦載氣流量設為20 mL/min。MS 掃描范圍在m/z45～800 之間。EI 源溫度保持在230 °C。

1.8 數據處理

在質譜儀上導出CDF 格式文件，使用Abf.Converter4.0.0 轉 換 為Abf 格 式，在MSDIAL4.70 軟 件上進行圖譜對比分析、降噪音、峰對齊、峰合并以及正態(tài)化，以Area 導出數據。使用在線軟件代謝分析儀（www.metaboanalyst.ca）和SIMCA14.1 軟件對數據 進 行PCA 分 析、OPLS-DA 分 析、VIP predictive以及置換檢驗。行為學數據使用GraphPad Prism5統(tǒng)計學軟件進行處理，數據以平均數±標準差（±s）表示，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 新物體識別實驗

實驗結果見表1 和圖1，模型組比空白組小鼠的新物體識別指數出現(xiàn)下降（P＜0.05）；補陽還五湯組較模型組小鼠新物體識別指數提高（P＜0.05）。

表1 各組小鼠新物體識別指數（n=8，±s）Tab 1 Identification index of new objects in each group（n=8，±s）

表1 各組小鼠新物體識別指數（n=8，±s）Tab 1 Identification index of new objects in each group（n=8，±s）

注：與Control 組相比，*P＜0.05；與Model 組相比，#P＜0.05。

組別Control識別指數0.333±0.129 Model 0.129±0.077*0.265±0.107#BYHWT

圖1 各組小鼠新物體識別指數（n=8，±s）Fig 1 Identification index of new objects in each group（n=8，±s）

2.2 病理形態(tài)學變化

結果如圖2 所示，空白組的小鼠海馬區(qū)的神經細胞整齊，總量較多，核仁清澈，無核固縮；模型組小鼠海馬區(qū)神經元細胞排列混亂，部分神經元丟失，神經細胞發(fā)生皺縮，核仁不顯，固縮小明顯；與模型組比較，補陽還五湯組海馬內的神經元細胞編排更加有序，神經元數量更多，細胞形狀更加正規(guī)，核仁也更清澈，無明顯核固縮。

圖2 小鼠海馬區(qū)神經細胞病理形態(tài)（HE 染色，×40）Fig 2 Pathological morphology of mouse hippocampal neurons（HE stain，×40）

2.3 小鼠血漿質控樣本總離子流疊加圖

如下圖3 所示，通過分析QC 樣品的離子流圖的重疊現(xiàn)象，可以看出各峰之間良好的區(qū)分，對時間的保留程度也一致。在此基礎上，通過單維統(tǒng)計分析和多元統(tǒng)計分析法挑選出Control 組、Model組、BYHWT 組之間的不同代謝物，并開展下一步研究。

圖3 D-gal 模型小鼠血漿組織質控樣本總離子流疊加圖Fig 3 Superposition diagram of total ion flow in plasma tissue quality control samples from model mice

2.4 PCA 得分圖與系統(tǒng)穩(wěn)定性分析

PCA 得分圖（圖4）如下所示。通過對Control組、Model 組 和BYHWT 組 進 行PCA 分 析，Model組與Control 組之間的位點差異分離現(xiàn)象尤為突出，說明D-gal 模型小鼠血漿代謝物產生了較為明顯的差異。BYHWT 組和Model 組之間的組間差別很顯著，說明在給中藥方劑補陽還五湯干預后內源性代謝物水平出現(xiàn)了顯著的變化。

圖4 空白組、模型組和補陽還五湯組PCA 得分圖Fig 4 PCA score of Control group，Model group and BYHWT group

2.5 正交偏最小二乘方法判別分析（OPLS-DA）

為進一步尋找每個組別之間的差異代謝產物，用OPLS-DA 分析方法分別對Control 組與Model組、Model 組和BYHWT 組小鼠的血漿樣品進行分析。結果顯示如下圖5、6 所示，OPLS-DA 得分圖中顯 示Model 組 與Control 組、BYHWT 組 與Model 組之間分離明顯，聚合度較好，表面代謝產物在Model組和Control 組、BYHWT 組和Model 組之間差異明顯。在OPLS-DA 置換圖中，Model 組與Control 組對比R2X=0.602、R2Y=0.868，BYHWT 組與Model組對比R2X =0.564、R2Y=0.96，說明該模型擬合效果比較好。Model 組與Control 組對比Q2在Y 軸上的截距=-0.24，BYHWT 組與Model 組對比Q2在Y 軸上的截距=-0.539，表明分析模型可靠穩(wěn)定。

圖5 模型組與空白組的OPLS-DA 與OPLS-DA 置換檢驗圖Fig 5 OPLS-DA of Model group and Control group and OPLS-DA permutation test chart

2.6 差異代謝物分析結果

本實驗通過OPLS-DA 對模型組和空白組、補陽還五湯組和模型組血漿數據進行系統(tǒng)分析，使用VIP predictive 和t檢驗方法查找每個組別之間的變量，直接篩選出各組間的代謝物（VIP＞1.0，P＜0.05）。如表2 所示，在以上的處理方法下，發(fā)現(xiàn)了5個差異代謝產物，分別是L-焦谷氨酸、賴氨酸、焦磷酸，肌酸酐、α-乳糖。與空白組相比，模型組肌酸酐、α-乳糖、賴氨酸含量顯著升高，L-焦谷氨酸和焦磷酸含量顯著降低；和模型組相比，補陽還五湯組肌酸酐、α-乳糖、賴氨酸含量顯著降低，下調至正常水平，L-焦谷氨酸和焦磷酸含量升高，升高回調至較為正常水平。

表2 差異代謝物結果表（n=6）Tab 2 Differential metabolite results（n=6）

2.7 代謝通路富集分析

利用KEGG 的代謝物數據庫對5 個不同代謝物進行了代謝路線富集分析，以獲取影響阿爾茨海默病小鼠的代謝網絡中異常的代謝通路。結果主要包括通路谷胱甘肽的代謝、賴氨酸退化、氨酰生物合成等代謝途徑。

3 討論

由于阿爾茨海默病的復雜性和異質性，現(xiàn)在臨床應用的阿爾茨海默病的生物標志物和治療靶點較少。本研究發(fā)現(xiàn)血漿中幾種代謝物的數量受到D-gal 誘導的影響，并且這些異常通過補陽還五湯治療明顯得到改善。

L-焦谷氨酸普遍存在于人的大腦和腦脊液中，有助于提升記憶力［14］，L-焦谷氨酸能夠抑制乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶、Bacel 酶的活性，從而減少膽堿能神經的傳遞，膽堿能神經的傳遞在AD 認知損傷中起著重要作用，有改善AD 的效果［15］。本實驗中，L-焦谷氨酸含量上調至正常水平，說明補陽還五湯可能通過抑制膽堿能神經元傳遞，起到改善學習記憶的作用。此外，L-焦谷氨酸也是谷胱甘肽代謝的中間產物，在一些危重患者中，谷胱甘肽再生阻塞會引起焦谷氨酸酸中毒［16］。，谷胱甘肽［17］是腦中主要的抗氧化防御分子。它是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的三肽，通過提供一種活性氧的還原物來中和發(fā)揮抗氧化作用［18］。這種反應既可以通過非酶作用發(fā)生，也可以通過谷胱甘肽過氧化物酶［19］的催化作用發(fā)生。體外和動物研究表明，谷胱甘肽損耗在一些神經退行性疾病如AD 在神經元死亡和涉及神經元損失方面起著重要作用［20］，使其成為預防或減少神經退行性變的潛在治療靶點。賴氨酸乙酰化廣泛存在于所有生物體中，在調節(jié)蛋白質合成中起到重要作用，同時涉及多種代謝途徑如糖酵解和檸檬酸循環(huán)，還可以調節(jié)細胞質和線粒體功能［21］。研究表明，線粒體動力學缺陷可以引起AD、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥和亨廷頓病等相關病理，包括阻礙代謝狀態(tài)、減少ATP 生成和增強氧化應激等［22］。氨基酰-tRNA 合成酶廣泛存在于細胞內，催化氨基酸與對應的tRNA 之間發(fā)生酯化反應生成氨基酰-tRNA，為蛋白質合成提供原料并保證遺傳信息的準確傳遞［23］。氨基酰-tRNA 合成酶突變會造成多種神經退行性疾?。?4］，本實驗中，賴氨酸下調至正常水平以及KEGG 獲取的代謝通路表明，補陽還五湯可能通過促進賴氨酸乙酰化調節(jié)線粒體功能以及能量代謝達到改善AD 的作用。

綜上所述，補陽還五湯對D-gal 模型小鼠具有良好的治療效果，其機制可能是通過改善氧化應激、線粒體功能以及能量代謝等方面來實現(xiàn)對神經元細胞的保護作用。因此，我們將繼續(xù)對補陽還五湯改善AD 的神經生物學機制進行探究，為研發(fā)安全有效的治療AD 的新藥提供新的思路。

作者貢獻度說明：

于明慧：動物造模實驗、行為學實驗、病理染色實驗/GC-MS 實驗實施，撰寫文章；張寧：實驗設計，審校；孫慧峰：實驗設計；徐艷明：行為學實驗教學；趙德萍：病理染色實驗教學；薛慧：GC-MS 實驗教學；姜晶：GC-MS 實驗教學；薛傲：審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。