周笑犁，王艷麗，吳承木，朱光旭，潘滿林

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省普通高等學校功能食品重點實驗室，貴州 貴陽 550005；3.貴陽學院生物與環(huán)境工程學院，貴州 貴陽 550005）

近年來，由于人們生活水平的不斷提高，高糖高脂飲食攝入越來越多，且心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等慢性疾病的患病率與日俱增，這與機體內(nèi)自由基的過度累積促進了機體組織細胞的衰老和凋亡有關。并且，機體內(nèi)血液膽固醇含量的增高也是誘發(fā)心血管疾病的重要原因[1]。因此，如何有效消除機體內(nèi)自由基，控制高膽固醇等心血管系統(tǒng)疾病的誘因成為研究關注的焦點。有報道稱，若長期飲用酸駝奶、酸馬奶等乳酸菌發(fā)酵奶制品可降低人體患心血管疾病風險[2-3]。其中乳酸菌作為各類發(fā)酵制品的重要組分之一，不僅能改善食品的發(fā)酵性能、風味特性等，還能抑制有害菌的增殖，具有協(xié)調(diào)人體代謝、抗腫瘤、降低膽固醇水平、改善肝功能、緩解乳糖不耐癥和增強免疫等功能活性[4-7]。

亞硝酸鹽作為常見的食品添加劑之一，存在于許多儲藏性或發(fā)酵食品中。由于亞硝酸鹽在食品中廣泛存在，它可能會與食品中蛋白質(zhì)分解的胺類物質(zhì)結合成為亞硝基化合物，從而對人體產(chǎn)生急性中毒、致癌作用及其他危害[8-9]。已有報道乳酸菌[9]、部分芽孢桿菌[10]等對亞硝酸鹽也具有一定的降解能力，如LP9010 具有高效降解亞硝酸鹽的能力[11]，王英等[8]從農(nóng)家自制的酸豆角中分離到1 株具有強降解亞硝酸鹽能力的乳酸菌。但這些益生特性卻有著菌種和菌株的特異性，因此從豐富的發(fā)酵資源中篩選具有開發(fā)潛力的乳酸菌具有重要的現(xiàn)實意義。

課題組前期發(fā)現(xiàn)果蔬自然發(fā)酵液中涵蓋了細菌和真菌兩大類，且以細菌占絕對優(yōu)勢；并發(fā)現(xiàn)發(fā)酵體系中亞硝酸鹽含量呈先增加后降低的趨勢，與此同時乳酸菌也在發(fā)酵中后期呈現(xiàn)快速增長的趨勢[12]。進而從中分離得到了3 株優(yōu)勢乳桿菌，發(fā)現(xiàn)它們具有良好的生長特性，及高溫、高鹽、膽鹽及人工胃、腸耐受特性[13]。因此，本文以前期鑒定的3 株乳桿菌為實驗材料，進一步探究它們的表面特性、抗氧化能力差異，并分別對膽固醇、亞硝酸鹽等降解能力進行評價；旨在為發(fā)酵食品的菌株功能特性挖掘提供理論依據(jù)，對其應用于健康食品的制備和保護人體健康具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarumstrain Heal19，簡稱L1）、乳桿菌屬（Lactobacillus brevisstrain LMT1-73，簡稱L2）、植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarumstrain SRCM100440，簡稱L3） 均為前期從番茄自然發(fā)酵液中分離所得[13]；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵 均為分析純，科密歐化學試劑（天津市）有限公司；MRS 培養(yǎng)基 杭州百思生物技術有限公司；3,5-二硝基水楊酸、硫代巴比妥酸、二甲苯、雙氧水、六氰合鐵酸鉀、三氯化鐵 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；亞油酸 上?？ㄒ辽锛夹g有限公司；膽固醇南京奧多福尼生物科技有限公司；膽固醇檢測試劑盒南京建成生物工程研究所。

SPX-1508BII 生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限責任公司；UV2700 紫外分光光度計 日本島津儀器有限公司；xMark 酶標儀 安諾倫（北京）生物科技有限公司；DF-101S 恒溫加熱磁力攪拌器 予華儀器（鞏義市）責任公司；TGL-16A 高速臺式離心機湖南平凡科技有限公司；LDZM-60L 高壓滅菌鍋上海審安醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 表面特性的測定

1.2.1.1 表面疏水性測定 MRS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 株乳桿菌一定時間，5000 r/min 離心10 min 收集菌體，用生理鹽水洗滌，并調(diào)整受試菌株菌液濃度，使其在600 nm 波長下A 值約為0.5。取菌懸液，加入等體積二甲苯，漩渦振蕩后，在室溫下培養(yǎng)1 h（此時形成兩相體系）。吸取2 mL 水相，以生理鹽水為空白對照，測定A600[14-15]。

其中A0和A 分別是與二甲苯混勻前后水相在600 nm 下測量所得的A 值。

1.2.1.2 自身凝聚力測定 MRS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 株乳桿菌，5000 r/min 離心10 min 收集菌體，用生理鹽水洗滌，用生理鹽水調(diào)整受試菌株的菌液濃度，使其在600 nm 波長下A 值約為0.5。取調(diào)整好的菌懸液于試管中，靜置，分別靜置1、2、3、4、5、12、24 h后吸取上層溶液于600 nm 波長下測其吸光度[14-15]。

其中A0和Ai分別是與自凝聚前后上層溶液在600 nm 下測量所得的A 值。

1.2.2 抗氧化能力測定

1.2.2.1 上清液及菌體重懸液的制備 乳桿菌MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16～18 h，4 ℃ 3000 r/min 離心5 min 并收集上清夜，放入冰箱4 ℃下保存，備用；對剩下的菌體沉淀進行洗滌兩次后重懸，調(diào)整菌數(shù)濃度至1×109CFU/mL。

1.2.2.2 DPPH 自由基清除能力 分別取0.4 mmol/L DPPH 乙醇溶液以及2 mL 樣品溶液（上清液、菌體重懸液）于試管混勻，置于室溫下避光反應30 min，然后5000 r/min 離心10 min，以無水乙醇為空白對照，在波長517 nm 處測定樣品吸光值[16-18]（Ai），無水乙醇代替DPPH 乙醇溶液的反應體系為樣品空白組（Aj），以無水乙醇代替樣品液的反應體系為控制組（A0），所有樣品測定三次平行。

1.2.2.3 羥基自由基的清除能力 在1 mL 樣品溶液（上清液、菌體重懸液）中分別加入9 mmol/L FeSO41 mL 和9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液1 mL，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動反應，在暗室下反應20 min，在510 nm 波長處測各組樣品的吸光值[16-18]。羥基自由基清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100式中：Ai：樣品的吸光度；Aj：水替代H2O2的吸光度；A0：水替代樣品的吸光度。

1.2.2.4 抗脂質(zhì)過氧化能力 分別在3 mL 樣品溶液（上清液、菌體重懸液）中加入0.5 mL 0.02 mol/L PBS 溶液、2.5 mL 亞油酸乳化液、1 mL 1%FeSO4，37 ℃水浴1.5 h 后再依次加入0.2 mL 4%三氯乙酸和2 mL 0.8%硫代巴比妥酸，100 ℃水浴30 min 后迅速冷卻至室溫，然后4000 r/min 離心15 min，最后收集上清液于532 nm 下測吸光度（A1），對照組以等體積蒸餾水代替樣品（A0）[16-18]。計算抗脂質(zhì)過氧化能力。

1.2.2.5 還原能力 分別在1 mL 樣品溶液（上清液、菌體重懸液）中加入2.5 mL PBS 緩沖液、2.5 mL 1%鐵氰化鉀，50 ℃水浴保溫20 min 后迅速冷卻，然后加入10%三氯乙酸2.5 mL，5000 r/min 離心10 min，在2.5 mL 上清液中加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，將其混合充分后靜置10 min，在700 nm 波長處測吸光值[16-18]。

1.2.3 降解亞硝酸鹽能力測定

1.2.3.1 亞硝酸鹽降解能力 取100 μL 菌液（1×109CFU/mL）接種到10 mL 含有200 mg/L NaNO2的MRS 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24、48 h[8-9]。參照國標GB 5009.33-2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法繪制標準曲線，以不含亞硝酸鈉的MRS 肉湯為空白對照，并測定樣品中的亞硝酸鹽含量。標準亞硝酸鹽溶液繪制標準曲線，y=0.0285x+0.0014，R2=0.9998。

式中：C0為未接菌含亞硝酸鈉培養(yǎng)基中亞硝酸鈉含量；C1為接菌培養(yǎng)后培養(yǎng)基中亞硝酸鈉含量。

1.2.3.2 乳桿菌對不同濃度亞硝酸鹽的降解能力取100 μL 菌液（1×109CFU/mL）接種到亞硝酸鹽含量分別為200、400、600、800、1000 mg/L 的10 mL MRS 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)0、6、12 h 后，分析亞硝酸鹽降解率。

1.2.4 降解膽固醇能力測定

1.2.4.1 膽固醇降解率 按5%菌液（1×109CFU/mL）接種至膽固醇培養(yǎng)基（在牛膽鹽0.2 g，蔗糖酯0.1 g，膽固醇0.1 g 和1 mL 吐溫-80 中加入5 mL 冰乙酸后60 ℃超聲15 min，將得到膠束溶液快速加入到MRS 液體培養(yǎng)基中，快速攪拌均勻后滅菌，室溫冷卻備用）[17,19]，37 ℃培養(yǎng)24 h，1000 r/min 離心10 min；取上清液按膽固醇試劑盒測定方法進行測定，并計算降解率。

式中：C0為不接菌的MRS-CHOL 培養(yǎng)基的膽固醇含量；C1為接入樣品24 h 后的培養(yǎng)基中膽固醇含量。

1.2.4.2 菌體與上清液降解能力 參照1.2.2.1 方法得到上清液和菌體重懸液，加入含有膽固醇的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定膽固醇含量，計算降解率[20]。

1.2.4.3 上清液降脂成分初探 L1 上清液中多糖、蛋白質(zhì)和脂肪分別采取乙醇沉淀法、乙酸乙酯抽提法和硫酸銨沉淀法進行提取[19]，然后加入膽固醇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定膽固醇含量，計算降解率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3 次，采用IBM SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，使用Duncan等多重方法對數(shù)據(jù)進行比較，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 表面特性分析

疏水性試驗結果如圖1（A）所示，除菌株L2 外（P＜0.05），其他兩株菌具有較高的疏水性，均超過50%，且差異不顯著（P＞0.05）。表面疏水性作為考察乳桿菌粘附性的主要指標，乳桿菌只有具備一定的黏附能力，才能防止因腸道的蠕動而使乳酸菌被快速排除。有研究發(fā)現(xiàn)[14,18]益生菌生物膜疏水能力與黏附能力呈正相關，疏水性越高，粘附性則越強[21]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)三株乳桿菌在一定程度上能耐受胃腸環(huán)境[13]，通過疏水性實驗又進一步發(fā)現(xiàn)L1 和L3具有較高的表面疏水性，這可能有助于細菌粘附到腸粘膜，更容易在人體腸道中定植，在人體中發(fā)揮益生作用[14-15]。

圖1 乳桿菌的表面特性Fig.1 Surface properties of Lactobacillus

由圖1（B）可知，3 株乳桿菌的自凝聚率隨著靜置時間的延長而逐漸增大，其中L1 在3 h 內(nèi)自凝聚率變化差異不顯著（P＞0.05），3 株菌從3 h 后自凝聚率顯著增大（P＜0.05）。靜置4 h 時，3 株菌的自動凝集率均超過20%，12 h 后自動聚集超過70%（P＜0.05），其中L1 的自凝聚力顯著低于其他各組（P＜0.05）。本實驗中的3 株乳桿菌均低于龔虹等[14]報道的德氏乳桿菌DM8909 和羅伊乳桿菌RC-14 在4 h 的自凝聚能力，而與戊糖片球菌和鼠李糖乳桿菌PB01 自凝聚能力相似[15]。說明本實驗從果蔬發(fā)酵液中分離得到的3 株優(yōu)勢乳桿菌自凝率速率較低，需要12 h 才能具有較好的作用，說明不同來源的乳桿菌自凝聚能力快慢存在菌株差異性。

2.2 抗氧化能力分析

DPPH 法、羥自由基清除能力、還原力等都是測定抗氧化能力的常用方法。但是這些測定結果都只能表明某一種或某一水平上的抗氧化能力，故本實驗從多維度考察乳桿菌的抗氧化能力差異。

由圖2（A）可以得出，3 株乳桿菌具有較好的DPPH 自由基清除能力，上清液和菌體重懸液的清除率分別不低于90%和80%；且三株菌之間的清除能力差異不顯著（P＞0.05）；上清液的清除率顯著高于菌體重懸液（P＜0.05）。這可能是由于乳桿菌上清液中含有更多能夠清除DPPH 自由基的物質(zhì)，如多糖等具有一定的供氫能力，通過氫原子轉移或電子轉移，對DPPH 自由基發(fā)生中和作用[22-23]。

圖2（B）顯示，3 株乳酸桿菌上清液的清除羥自由基能力顯著高于菌體重懸液（P＜0.05），其中L1、L3 的上清液比L2 具有更強的羥自由基清除能力（P＜0.05），而L2 的菌體重懸液則比L1、L3 具有更強的羥自由基清除能力（P＜0.05）。表明3 株乳酸桿菌清除羥自由基的活性物質(zhì)主要在代謝產(chǎn)物中而非菌體本身。這與劉倩霞等[24]、丁麗麗等[25]研究相似，這可能是乳桿菌在生長、代謝過程中產(chǎn)生了Fe2+、Cu2+等金屬離子螯合物等并分泌到培養(yǎng)上清液中，參與氧化反應，從而使羥基自由基變少[24-25]。而不同乳酸菌清除自由基的能力存在一定差異，可能是因為其活性物質(zhì)及其含量不一樣[26-27]。

圖2 3 株乳酸桿菌的體外抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of 3 strains of Lactobacillus in vitro

由圖2（C）可知，3 株乳桿菌的上清液和菌體重懸液具有一定抗脂質(zhì)過氧化的能力，尤其菌體重懸液比上清液具有更強的抗脂質(zhì)過氧化能力（P＜0.05）。王悅齊等[28]研究結果為：乳酸菌中具有抗脂質(zhì)過氧化的物質(zhì)大部分在上清液中；說明本實驗中乳桿菌不僅上清液具有良好的清除自由基的能力，菌體細胞中也可能含有抑制催化亞油酸脂質(zhì)過氧化的作用。并且無論菌體還是上清液，L2 都表現(xiàn)出更好的抗氧化能力（P＜0.05），L1 則相對較弱（P＜0.05）；說明抗脂質(zhì)過氧化的活性物質(zhì)在不同乳桿菌株中的含量分布存在差異。

由圖2（D）可知，3 株乳桿菌均具有較強的還原能力，且上清液的還原能力顯著強于菌體重懸液（P＜0.05），其中L3 的還原能力顯著高于L1、L2（P＜0.05）；表明乳桿菌上清液中代謝產(chǎn)物作為電子供應者，它供應的電子不僅能使Fe3+還原為 Fe2+，也可以與自由基反應[29]。

從上述抗氧化活性指標可得出，三株乳桿菌對體外活性氧積累具有一定調(diào)節(jié)作用，但又存在一定差異，如上清液具有更強的DPPH 自由基、羥自由基清除率及還原能力，而菌體重懸液則主要表現(xiàn)出更好的抗脂質(zhì)氧化能力；其中L1 和L3 上清液具有更強羥自由基清除率，L2 則具有較強的抗脂質(zhì)過氧化能力，L3 上清液具有較好的還原能力；其原因可能是不同乳桿菌及其所分泌的抗氧化物質(zhì)存在種類、數(shù)量和濃度上的區(qū)別[30]，有待進一步深入探究3 株乳桿菌代謝產(chǎn)物的差異。

2.3 降解亞硝酸鹽能力分析

乳桿菌通常在食品發(fā)酵中表現(xiàn)出良好的降解亞硝酸鹽功能[9]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)番茄自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽在前20 d 內(nèi)逐漸增加，隨后亞硝酸鹽含量迅速降低，與此同時乳酸菌豐度也逐漸增加[12]，因此對此時發(fā)酵體系中分離的優(yōu)勢乳桿菌進行亞硝酸鹽降解能力的探究。在本實驗的3 株菌培養(yǎng)24 h時，亞硝酸鹽降解率在70%以上，尤其是L1 和L3 顯著高于L2（P＜0.05）；培養(yǎng)48 h 后，3 株菌的降解率均超過了90%（圖3）。其中，2 株植物乳桿菌對亞硝酸鹽的降解速度較快，降解能力最強，在24 h 基本趨于穩(wěn)定；這可能由于植物乳桿菌具有更豐富的代謝產(chǎn)物亞硝酸還原酶可降解或清除亞硝酸鹽[8-11]。而L2 的降解力從24 h 到48 h 有顯著增加（P＜0.05），這可能與菌株自身的生長能力有一定關系。

圖3 3 株乳桿菌對亞硝酸鹽降解能力Fig.3 Degradation ability of 3 strains of Lactobacillus to nitrite

然后考察了3 株乳桿菌12 h 內(nèi)在不同亞硝酸鹽濃度下的變化規(guī)律，結果見圖4。隨著亞硝酸鹽濃度的增加，3 株乳桿菌對其降解率逐漸下降，但亞硝酸濃度為1 g/L 時，20 h 后其降解率仍有20%左右。由此可見，本實驗從果蔬發(fā)酵液中分離得到的3 株優(yōu)勢乳桿菌具有良好的亞硝酸鹽耐受和降解能力，這可為開發(fā)有關降亞硝酸鹽發(fā)酵食品提供一定的理論基礎。

圖4 3 株乳桿菌對不同濃度亞硝酸鹽的降解情況Fig.4 Degradation ratio of NaNO2 by Lactobacillus under different concentration of NaNO2

2.4 降解膽固醇能力分析

體外降膽固醇實驗作為判定課題組前期從果蔬發(fā)酵液中分離得到的乳桿菌是否具有潛在降脂能力的重要標準之一。由圖5 可知，3 株乳桿菌培養(yǎng)24 h后對膽固醇的降解率均不低于19%，說明本實驗的3 株乳桿菌對膽固醇具有一定潛在降解特效。已有報道發(fā)酵果蔬中6 種乳酸菌對膽固醇的清除率在18.5%～28%之間[31]，本實驗結果與之相近。其中L1 的降解能力最高，但略低于林斌等[32]從自然發(fā)酵酸乳中植物乳桿菌HLX37 的膽固醇降解率，而L1 略高于動物雙歧桿菌LPL-RH、長雙歧桿菌TTF和植物乳桿菌LPL-1 的降解率[33]。相比之下，本研究的3 株乳桿菌的體外降膽固醇能力處于中等水平。再對3 株菌的上清液和菌體重懸液的膽固醇降解能力進行了比較分析，如圖6 所示，結果發(fā)現(xiàn)上清液比菌體重懸液具有更強的膽固醇降解能力（P＜0.05）。說明乳桿菌對膽固醇的降解活性主要存在于上清液中，發(fā)揮這些降解作用的物質(zhì)可能為初級和次級代謝產(chǎn)物。因此以具有較強膽固醇降解能力的L1 為對象，進一步探究其上清液中發(fā)揮降解膽固醇作用的物質(zhì)。如圖7 所示，發(fā)現(xiàn)L1 上清液發(fā)揮降解膽固醇作用的物質(zhì)大部分為蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)，且這些物質(zhì)基本均為次級代謝產(chǎn)物；而脂類幾乎不具有降解膽固醇的能力。這可為開發(fā)有關降膽固醇產(chǎn)品提供一定的理論基礎。

圖5 菌懸液體外膽固醇降解率Fig.5 Cholesterol degradation rate of bacterial suspension in vitro

圖6 上清液和菌體重懸液對膽固醇的降解能力Fig.6 Cholesterol degradation ability of supernatant and bacterial suspension

圖7 L1 上清液不同組分對膽固醇的降解能力Fig.7 Cholesterol degradation ability of different components of L1 supernatant

3 結論

本研究發(fā)現(xiàn)果蔬發(fā)酵液中3 株優(yōu)勢乳桿菌具有良好的表面特性，尤其L3 的表面疏水性和自身凝聚力均表現(xiàn)良好，分別為57.7%和95.2%（24 h），可能對黏附于腸道具有一定積極作用，是益生菌制劑開發(fā)應用中的潛力菌。再通過體外功能活性評價，發(fā)現(xiàn)3 株菌的上清液具有較強的DPPH 自由基清除率（＞90%）、羥自由基清除率（＞68%）及還原能力（＞1.0），而菌體則主要表現(xiàn)出更好的抗脂質(zhì)氧化能力（＞35%）；其中L1 和L3 上清液具有更強羥自由基清除率，L2 則具有較強的抗脂質(zhì)過氧化能力（上清液37.43% vs 菌體55.9%），L3 上清液具有較好的還原能力。并且3 株菌均具有一定亞硝酸鹽耐受和降解能力以及膽固醇降解能力，其中L3 具有更好的亞硝酸鹽降解能力，膽固醇降解能力則主要體現(xiàn)在上清液中。綜上所述，前期從番茄為原料的果蔬發(fā)酵液中分離得到的3 株優(yōu)勢乳桿菌均有作為發(fā)酵果蔬或功能性益生產(chǎn)品的潛在應用前景，也可進一步嘗試將幾株菌混合或與其他益生菌協(xié)同發(fā)酵果蔬原料，開發(fā)營養(yǎng)功效更全面的益生食品。