李忠原， 李保宏， 劉苗苗， 楊 穎， 田景振,2 *， 崔清華

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)青島中醫(yī)藥科學(xué)院，山東 青島 266041；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，山東 濟(jì)南 250355)

甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖，相關(guān)產(chǎn)品在國內(nèi)外均占有重要份額[1]，其化學(xué)成分以三萜皂苷類和黃酮類為主[2]，具有抗?jié)?、抑菌、抗炎、解痙、降血脂、鎮(zhèn)痛、抗心律失常、抗腫瘤、抗病毒等作用[3-4]。目前，國內(nèi)外大量報(bào)道顯示甘草具有廣譜抗病毒的潛力，如甘草水提物可抑制H3N2型流感病毒[5]，甘草水提物與水提醇沉后的沉淀可抑制呼吸道合胞病毒(RSV)[6-7]，甘草皂苷類成分可抑制H1N1型流感病毒[8-9]，甘草酸可作用于新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)刺突蛋白發(fā)揮抗病毒作用[10]并抑制腸道病毒71型(EV71)[11-12]、乙型肝炎病毒(HBV)[13]、丙型肝炎病毒(HCV)[14]。本實(shí)驗(yàn)研究甘草對(duì)RSV、1型單純皰疹病毒(HSV-1)、腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒B3(CV-B3)、柯薩奇病毒B5(CV-B5)的體外抗病毒效果，豐富了該藥材抗病毒譜。另外，甘草可歸肺經(jīng)，而RSV可經(jīng)呼吸道感染人體造成病毒性肺炎，并且甘草對(duì)其作用效果最強(qiáng)，故本實(shí)驗(yàn)又篩選了相關(guān)活性部位，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)初步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 甘草購自亳州中強(qiáng)中藥飲片有限公司(產(chǎn)地新疆和田，批號(hào)191101)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。利巴韋林(批號(hào)807A021)、阿昔洛韋(批號(hào)1023A021)(北京索萊寶科技有限公司)。胎牛血清(批號(hào)42A0378K)、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(批號(hào)8120010)、磷酸鹽緩沖液(批號(hào)8120150)、0.25% EDTA胰酶(批號(hào)1951208)(美國Gibco公司)；青鏈霉素混合液(北京白鯊易科技有限公司，批號(hào)70011000)；二甲亞砜(DMSO，美國Amresco公司，批號(hào)821D035)；噻唑藍(lán)染液(美國VWR公司，批號(hào)1636C097)；Nrf2試劑盒(批號(hào)B06011498)、NF-κB p105試劑盒(批號(hào)B07011499)、Keap1試劑盒(批號(hào)A16019408)(武漢華美生物工程有限公司)；TLR4試劑盒(批號(hào)12/2020)、TNF-α試劑盒(批號(hào)12/2020)、IFN-β試劑盒(批號(hào)12/2020)(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.2 宿主細(xì)胞及病毒毒種 非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)、人喉癌上皮細(xì)胞(Hep2細(xì)胞)購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司；RSV、HSV-1、EV-71、CV-B3、CV-B5由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供，保存于山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.3 動(dòng)物 4周齡BALB/c雌性小鼠40只，體質(zhì)量12～14 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(魯)2017-0022。

1.4 儀器 Spectra Max M5型酶標(biāo)儀(美國Molecular Device公司)；HFsafe-1200TE型生物安全柜、HF90型CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；TDD5M型臺(tái)式平衡離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；ALPHA 1-4 LD plus型冷凍干燥機(jī)(德國Christ公司)；CKX-31型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 供試品制備

2.1.1 甘草水提物 取200 g藥材洗凈，加12倍量水浸泡30 min，加熱回流提取90 min，共2次，藥液離心過濾，濃縮至原藥材1 g/mL，冷凍干燥，即得。體外實(shí)驗(yàn)所用水提物粉末以含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液配制成10 mg/mL溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃下冷藏備用。

2.1.2 不同溶劑萃取部位 取藥材200 g洗凈，按“2.1.1”項(xiàng)下方法提取濃縮，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3～5次至有機(jī)層幾乎無色，將各部分萃取液分別濃縮、減壓干燥至干粉狀，并以含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液配制成6 mg/mL(正丁醇、水部位)、0.6 mg/mL(石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯部位)溶液(輔以1% DMSO助溶)，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得，4 ℃下冷藏備用。

2.2 體外抗病毒作用研究

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與復(fù)蘇 液氮罐中取出保存的細(xì)胞，在37 ℃下迅速融化，于生物安全柜中將其懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞，將混懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(溫度37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度75%)中培養(yǎng)，6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)待單層細(xì)胞80%匯合時(shí)，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。

2.2.2 病毒擴(kuò)增 待細(xì)胞匯合至70%左右時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，PBS清洗去除細(xì)胞碎片，加入0.2 mL病毒液(RSV、HSV-1、EV71、CV-B3、CV-B5)，輕搖培養(yǎng)皿使病毒與細(xì)胞充分接觸，于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每15 min輕搖培養(yǎng)皿，2 h后棄去培養(yǎng)液，清洗后加入10 mL含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液，每天鏡檢觀察病變，48 h后停止培養(yǎng)，病毒組培養(yǎng)皿密封反復(fù)凍融3～4次，將病毒液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，3 000 r/min離心3 min，取上清液分裝，在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 病毒毒力測定 將細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)12 h。取“2.2.2”項(xiàng)下病毒液按10倍比稀釋8個(gè)濃度，加于單層細(xì)胞中培養(yǎng)48 h，每個(gè)病毒稀釋度重復(fù)6個(gè)孔，細(xì)胞病變效應(yīng)法(CPE)觀察感染情況，按照Reed-Muench公式計(jì)算各病毒滴度TCID50。

2.2.4 藥物細(xì)胞毒性測定 將細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)12 h，將“2.1”項(xiàng)下供試液按2倍比稀釋8個(gè)質(zhì)量濃度后加入到細(xì)胞中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、空白對(duì)照組，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，CPE法觀察感染情況，用MTT法檢測細(xì)胞活性，采用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測光密度(OD)值，通過GraphPad Prism 5軟件擬合藥物CC50。

2.2.5 藥物抗病毒活性測定 細(xì)胞按“2.2.4”項(xiàng)下方法培養(yǎng)，并以100 TCID50/孔的病毒感染細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、空白對(duì)照組，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，CPE法觀察感染情況，MTT法檢測細(xì)胞活性，采用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測OD值，通過GraphPad Prism 5軟件擬合藥物EC50。

2.3 加時(shí)實(shí)驗(yàn) 為了研究甘草活性部位作用在RSV復(fù)制周期的具體階段，故又進(jìn)行了加時(shí)實(shí)驗(yàn)[15]。實(shí)驗(yàn)前24 h，將Hep2細(xì)胞以每孔8×104個(gè)的密度接種于24孔板，設(shè)置空白對(duì)照組、藥物干預(yù)組，每種藥物[甘草正丁醇部位萃取物(0.3 mg/mL)、甘草水部位(3 mg/mL)、利巴韋林(100 μmol/L)]分為8份，分別在-2、0、2、4、6、8、12、16 h時(shí)加入，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3孔，在0 h時(shí)棄去原培養(yǎng)液，加入新的冷培養(yǎng)液，以感染復(fù)數(shù)(MOI)為3的病毒量在4 ℃下感染細(xì)胞2 h，隨后用冷PBS洗滌細(xì)胞3次，加入新培養(yǎng)液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于20 h時(shí)收集上清液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法檢測上清液病毒毒力。

2.4 甘草體內(nèi)抗RSV作用研究

2.4.1 造模及給藥 將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為空白組、模型組、利巴韋林(陽性藥，36 mg/kg)組、甘草正丁醇部位(30 mg/kg)組，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后每天灌胃相應(yīng)藥物(0.1 mL/只)，空白組、模型組灌胃等體積生理鹽水。在給藥第1天用乙醚麻醉小鼠，滴鼻給予病毒(100 μL/只，滴度為3.4×107TCID50/mL)，連續(xù)2 d，空白組滴鼻給予等體積對(duì)照培養(yǎng)液。

2.4.2 樣品處理與指標(biāo)檢測 按照預(yù)定方案給藥4 d，在第5天給藥1 h后，小鼠眼球取血，脫頸處死，解剖取肺組織，稱定質(zhì)量，計(jì)算肺指數(shù)，再用4%甲醛固定，經(jīng)脫水、組織透明、浸蠟、包埋、切片、烘干后，HE染色以觀察肺部病變。將小鼠全血于4 ℃下過夜，在4 ℃、3 000 r/min下離心20 min，取上清，ELISA法檢測血清TLR4、NF-κB、TNF-α、IFN-β、Keap1、Nrf2水平。

3 結(jié)果

3.1 病毒毒力 如表1所示，HSV-1、EV71以Vero細(xì)胞為宿主細(xì)胞，RSV、CV-B3、CV-B5以Hep2細(xì)胞為宿主細(xì)胞。

3.2 抗病毒譜 如表2所示，甘草水提物對(duì)5種病毒均有較好的抑制作用，其中對(duì)RSV效果最強(qiáng)。

3.3 甘草抗RSV活性部位篩選 如圖1所示，甘草正丁醇部位活性最強(qiáng)，TI值為36.22；其次是水部位，TI值>15.71。

圖1 活性部位的篩選

3.4 加時(shí)實(shí)驗(yàn) 如圖2A所示，陽性藥利巴韋林在6～10 h時(shí)對(duì)RSV具有一定的抑制作用，主要是在復(fù)制階段，而在-2～6 h時(shí)作用較差。如圖2B所示，甘草正丁醇部位在-2～4、6～12 h時(shí)對(duì)RSV具有一定的抑制作用，12 h后逐漸減弱，主要是在吸附、復(fù)制階段，而在穿入階段不明顯，呈現(xiàn)出藥物預(yù)防效果。如圖2C所示，甘草水部位在-2～8 h時(shí)對(duì)RSV具有一定抑制作用，8 h后逐漸減弱，主要是在吸附、復(fù)制階段，呈現(xiàn)出藥物預(yù)防、抑制病毒穿入效果。

注：-2 h處的點(diǎn)表示藥物作用在-2～0 h，0 h處的點(diǎn)表示藥物作用在0～2 h，2 h及2 h以后的點(diǎn)均表示藥物作用在該點(diǎn)至20 h。若2 h之后某兩點(diǎn)的滴度相同，則表示在這段時(shí)間內(nèi)藥物對(duì)病毒沒有抑制作用。

3.5 甘草正丁醇部位抗RSV作用及其機(jī)制

3.5.1 對(duì)病理形態(tài)的影響 如圖3所示，模型組小鼠肺泡壁增厚，多數(shù)肺泡腔變小或幾乎看不見，肺泡腔內(nèi)及肺間質(zhì)有明顯出血，伴有炎性細(xì)胞浸潤；空白組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)未見滲出物，未見炎性細(xì)胞浸潤；甘草正丁醇部位組小鼠肺泡壁增生情況得到改善，肺泡形態(tài)趨于正常肺泡腔出血情況減輕，炎性細(xì)胞浸潤情況減輕；利巴韋林組小鼠肺泡壁較模型組得到改善，肺泡腔及肺間質(zhì)出血情況得到改善，炎性細(xì)胞浸潤情況減輕。

圖3 甘草正丁醇部位對(duì)小鼠肺組織病理變化的影響(HE，×200)

3.5.2 對(duì)肺指數(shù)的影響 如圖4所示，與空白組比較，模型組小鼠肺指數(shù)升高(P<0.01)，提示造模成功；與模型組比較，甘草正丁醇部位組和利巴韋林組小鼠肺指數(shù)均降低(P<0.05)。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

3.5.3 對(duì)炎癥及免疫反應(yīng)相關(guān)因子的影響 如圖5所示，與模型組比較，甘草正丁醇部位可降低小鼠血清TLR4水平(P<0.05)；甘草正丁醇部位和利巴韋林可降低小鼠血清NF-κB及TNF-α水平(P<0.05)，升高IFN-β水平(P<0.05)。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

3.5.4 對(duì)氧化應(yīng)激通路的影響 如圖6所示，與模型組比較，甘草正丁醇部位可降低小鼠血清Keap1水平(P<0.05)，甘草正丁醇部位和利巴韋林均可升高血清Nrf2水平(P<0.01)。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)首先考察了甘草水提物對(duì)RSV、HSV-1、EV71、CV-B3、CV-B5的體外抗病毒作用，結(jié)果顯示其對(duì)以上5種病毒均有一定程度的體外抗病毒作用，其中抗RSV的效果最好。然后對(duì)甘草抗RSV的活性部位進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)甘草抗RSV的有效部位是正丁醇與水部位，結(jié)果提示甘草抗RSV的活性成分可能是極性相對(duì)較大的成分，如多糖、皂苷、黃酮類等成分。進(jìn)一步研究了甘草正丁醇部位和水部位抗RSV的初步機(jī)制，陽性藥利巴韋林主要作用在病毒的復(fù)制階段，甘草正丁醇部位、水部位在RSV復(fù)制周期針對(duì)多個(gè)階段(吸附、穿入、復(fù)制)具有抑制RSV的作用，后續(xù)需針對(duì)不同的作用階段尋找其抑制RSV的作用通路進(jìn)行深入研究。

病毒入侵機(jī)體后可造成組織的氧化應(yīng)激損傷以及一系列的炎癥損傷。TLR4是連接固有免疫與炎癥的橋梁，宿主的TLR4可識(shí)別RSV的F蛋白，在TLR4信號(hào)傳導(dǎo)中進(jìn)一步激活NF-κB通路，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[16]。干擾素(IFN)是機(jī)體所產(chǎn)生的具有廣譜抗病毒作用的一種細(xì)胞因子，RSV的G蛋白可抑制IFN-β的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)RSV的免疫逃逸[17]。Cuadrado等[18]提出Nrf2可作為呼吸道病毒疾病治療的潛在靶點(diǎn)，在生理?xiàng)l件下，Nrf2與Keap1偶聯(lián)于細(xì)胞質(zhì)中，應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2從胞漿解離至細(xì)胞核內(nèi)并促進(jìn)抗氧化基因的表達(dá)，Nrf2和NF-κB存在功能性的相互作用，Nrf2的降低會(huì)加劇NF-κB的活性，Nrf2的激活可促進(jìn)炎癥的緩解。甘草體內(nèi)抗RSV實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，甘草正丁醇部位可以提高感染RSV小鼠血清IFN-β水平，抑制RSV的免疫逃逸；通過抑制TLR4/NF-κB通路并降低TNF-α水平，抑制RSV所引起的肺部炎癥反應(yīng)；并且可以通過Keap1/Nrf2通路降低小鼠的氧化應(yīng)激水平從而改善RSV引起的小鼠肺組織損傷。

中藥抗病毒的特點(diǎn)是多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用，關(guān)于中藥的抗病毒作用可從抑制病毒、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[19]。本實(shí)驗(yàn)通過抑制病毒、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激方面，對(duì)甘草體內(nèi)外抗病毒作用進(jìn)行了初步研究，為后續(xù)深入的機(jī)制研究及活性物質(zhì)基礎(chǔ)的尋找奠定一定基礎(chǔ)。