徐 楠， 趙宇郁， 張 偉， 尚亞倩， 馬桂芝*， 滕 亮

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.廣東藥科大學醫(yī)藥商學院，廣東 廣州 510006；3.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，新疆 烏魯木齊 830054)

額日赫木-8散為新疆維吾爾自治區(qū)博州蒙醫(yī)醫(yī)院制劑，出自《四部醫(yī)典》，又稱清熱八味散，由紅花、黃連、紫花地丁、麥冬、人工牛黃、檀香、瞿麥、石膏、冰糖組成[1]，具有清熱解毒之效，可增強正常小鼠免疫反應[2]，聯(lián)用三臣丸對小兒上呼吸道感染高熱效果顯著[3]，還可作為SARS治療的輔助用藥[4]。

目前，額日赫木-8散質(zhì)量標準僅有性狀描述，無法全面反映其整體質(zhì)量狀況，也不能保證其臨床應用安全性和有效性；相關質(zhì)量控制文獻也主要集中在TLC鑒別[5]和有效成分定量測定[6-9]方面，無法準確全面評價該制劑質(zhì)量。中藥指紋圖譜能系統(tǒng)全面地反映中藥品質(zhì)的真實性、一致性、穩(wěn)定性，結(jié)合化學模式識別可全面獲得其質(zhì)量信息，故在中藥制劑的質(zhì)量控制中被廣泛應用[10-12]。

本實驗建立了額日赫木-8散HPLC指紋圖譜，并結(jié)合化學模式識別評價不同批次樣品的一致性和穩(wěn)定性，找出差異性成分。同時，采用2020年版《中國藥典》中《藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則》相關要求，建立主要藥材紫花地丁中秦皮乙素含量的測定方法，以期為提高全方質(zhì)量控制水平奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AD高效液相色譜儀，配置SPD-M20A 230 V光電二極管陣列紫外可見光檢測器、πNAP COSMASIL C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(日本島津公司)；New Classic MF分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，0.01 mg)；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率50 kHz)；Milli-Q艾柯超純水儀(美國密理博公司)；Agilent SB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美國安捷倫科技公司)。

1.2 試劑與藥物 檀香(批號170805)、紅花(批號170308)、黃連(批號170518)、紫花地丁(批號170618)、麥冬(批號160116)、人工牛黃(批號160101)、瞿麥(批號170716)、石膏(批號170718)、冰糖(批號141620)均由新疆博州蒙醫(yī)醫(yī)院提供，經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院劉冰主任中藥師鑒定為正品。羥基紅花黃色素A對照品(批號MUST17082905，純度≥98%)購自成都曼思特生物科技有限公司；秦皮乙素對照品(批號C25J7Y18390，純度≥98%)、阿魏酸對照品(批號20130301，純度≥98%)均購自上海源葉生物科技有限公司。額日赫木-8散(新疆博州蒙醫(yī)醫(yī)院，批號20170915、20171201、20180208、20180410，供含量測定用；批號20180822、20180917、20181024、20181119、20181213、20190104、20190225、20190318、20190423、20190526，編號S1～S10，供指紋圖譜建立用)。甲醇為色譜純(美國Sigma公司)；其他試劑均為分析純(天津永晟精細化工有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜建立

2.1.1 溶液制備

2.1.1.1 對照品溶液 精密稱取秦皮乙素、羥基紅花黃色素A、阿魏酸對照品適量，60%甲醇溶解，即得。

2.1.1.2 供試品溶液 精密稱取本品適量，置于25 mL量瓶中，精密加入60%甲醇20 mL，超聲處理20 min，取出，放冷，60%甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.1.3 陰性樣品溶液 按處方比例及制備工藝，精密稱取除紫花地丁外的其余藥材，按“2.1.1.2”項下方法制備，即得。

2.1.2 色譜條件 Agilent SB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相0.1%磷酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～20 min，85%～75%A；20～25 min，75%～70%A；25～30 min，70%A；30～40 min，70%～80%A；40～45 min，80%～71%A；45～68 min，71%A；68～85 min，71%～72%A；85～100 min，72%～75%A；100～105 min，75%～85%A；105～110 min，85%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長345 nm；進樣量10 μL。

2.1.3 方法學考察

2.1.3.1 精密度試驗 精密稱取本品1 g，按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定6次，以4號峰(秦皮乙素)為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.2 重復性試驗 精密稱取本品1 g，共6份，按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，以4號峰(秦皮乙素)為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.1.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取本品1 g，按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0、1.5、3、4.5、6、7.5、9 h在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，以4號峰(秦皮乙素)為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%，表明溶液在9 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 圖譜生成 取10批樣品，按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，采用“中藥指紋圖譜相似度評價軟件”(2012.13723版本)，以S1為參照圖譜，采用中位數(shù)法，經(jīng)多點校正后得到指紋圖譜共有模式，選擇分離度和重復性良好、特征明顯的17個色譜峰作為共有峰，生成對照圖譜，見圖1～2，相似度見表1，發(fā)現(xiàn)均大于0.9，提示各批次之間成分一致性理想。

圖1 10批樣品HPLC指紋圖譜

圖2 共有峰對照圖譜

選擇保留時間穩(wěn)定、峰面積適宜、分離度和對稱性良好的4號峰(秦皮乙素峰)作為參照，測得各共有峰相對保留時間RSD均小于0.45%，表明其出峰時間較穩(wěn)定，但其相對峰面積RSD相差較大，表明存在一定批間差異。

2.1.5 色譜峰歸屬 按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣測定，通過與對照品色譜圖保留時間和全波長紫外掃描圖譜比對，發(fā)現(xiàn)4號峰為秦皮乙素，5號峰為羥基紅花黃色素A，9號峰為阿魏酸，見圖3。

1.秦皮乙素 2.羥基紅花黃色素A 3.阿魏酸1. esculeyin 2. hydroxylaffin A 3. ferulic acid

2.2 化學模式識別

2.2.1 聚類分析 采用組間平均聯(lián)接法，以平方Euclidean距離為測度，對10批樣品共有峰峰面積進行聚類分析[13-16]，結(jié)果見圖4。由此可知，類間距為5時，各批樣品聚為3類，S2～S9為一類，S1、S10各一類；不同批次樣品之間各成分含量存在差異，可能是由于生產(chǎn)工藝及原材料采收、加工、產(chǎn)地所致[12-15]。

圖4 10批樣品聚類分析樹狀圖

2.2.2 主成分分析 對10批樣品共有峰峰面積進行因子分析，結(jié)果見表2。由此可知，3個主成分累積方差貢獻率為91.677%，可代表樣品大部分信息；以絕對值大于0.5為重要性標準，4號峰(秦皮乙素)、9號峰、7號峰對2個及2個以上主成分的貢獻較大。

表2 主成分因子載荷矩陣

根據(jù)文獻[16]報道計算10批樣品綜合得分F，公式為F=0.529F1+0.369F2+0.102F3，結(jié)果見表3。

表3 10批樣品綜合得分及排序

采用 SIMICA 14.1軟件進行主成分分析，結(jié)果見圖5～6。由此可知，質(zhì)量參數(shù)(R2X)、預測度(Q2)均大于0.5，表明模型預測性較好[13-17]；前2個主成分貢獻率最大，累積貢獻率達85.568%。另外，圖6所得結(jié)果與表2一致。

圖5 主成分分析散點得分圖

圖6 主成分分析載荷圖

2.2.3 偏最小二乘判別分析(PLS-DA) 將10批樣品共有峰峰面積導入SIMCA 14.1軟件，采用PLS-DA模型，經(jīng)Permutatons驗證，得到Q2為負值，表明模型可靠，不存在過度擬合現(xiàn)象，建模成功[12,14-15]。得分散點圖見圖7，可知相似度高的樣品聚合為一類，與主成分分析結(jié)果基本一致。載荷圖見圖8，距離原點越遠的點權重值越大，在區(qū)分樣本中的作用越大。圖9顯示，在95%置信區(qū)間內(nèi)4號峰(秦皮乙素)、10號峰、12號峰、15號峰的變量重要性投影值(VIP值)均大于1，為引起批次間差異的主要標志性成分。

圖7 偏最小二乘判別分析散點得分圖

圖8 偏最小二乘判別分析載荷圖

圖9 偏最小二乘判別分析VIP值圖

2.3 秦皮乙素含量測定 主成分分析、偏最小二乘判別分析顯示，4號峰(秦皮乙素)變化既可影響質(zhì)量評分，也是引起批次差異的主要標志性成分，故對其含量進行測定[17-19]。

2.3.1 色譜條件 πNAP COSMASIL C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～28 min,75%B；29～41 min,45%B；42～51 min,60%B；52～60 min,75%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長345 nm；進樣量10 μL，色譜圖見圖10。由此可知，秦皮乙素色譜峰與其他成分色譜峰達到基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于7 000，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

1.秦皮乙素1.aesculetin

2.3.2 方法學考察

2.3.2.1 線性關系考察 精密吸取“2.1.1.1”項下對照品溶液，依次倍量稀釋，得到系列質(zhì)量濃度，分別精密吸取10 μL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)進行回歸，得方程為Y=30 415X-2 470.1(r=0.999 9)，在0.414 1～106 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.2.2 精密度試驗 精密稱取本品1.0 g，按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得秦皮乙素峰面積RSD為0.28%，表明儀器精密度良好。

2.3.2.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取本品1.0 g，按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液，常溫下于0、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24 h在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得秦皮乙素峰面積RSD為0.70%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2.4 重復性試驗 精密稱取本品1.0 g，按“2.1.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得秦皮乙素含量RSD為0.58%，表明該方法重復性較好。

2.3.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取6份秦皮乙素含量已知的本品1.0 g，加入340 μg/mL對照品溶液，按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 秦皮乙素加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.3.3 樣品含量測定 精密稱取4批本品各1.0 g，每批3份，按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表5。

2.3.4 限度確定 根據(jù)表5結(jié)果，結(jié)合紫花地丁采收季節(jié)、貯藏條件與時間、制劑生產(chǎn)水平，建議每1 g額日赫木-8散中含秦皮乙素不得低于321.2 μg/g。

3 討論

3.1 色譜柱選擇 預實驗發(fā)現(xiàn)，Agilent SB C18色譜柱可實現(xiàn)更多色譜峰的較好分離，符合指紋圖譜宏觀研究目的，故本實驗選擇其進行額日赫木-8散HPLC指紋圖譜研究。另外，πNAP C18色譜柱雖然分析時間相對較長，但秦皮乙素分離度良好，可能與其硅膠固定相上鍵合的萘乙基有關，故本實驗選擇其進行各成分含量測定。

表5 秦皮乙素含量測定結(jié)果(n=3)

3.2 化學模式識別與含量測定研究 本實驗采用3種化學模式識別方法[20-21]，其中聚類分析表明，當類間距為5時，10批樣品聚為3類，提示各批樣品之間雖然相似度較高，但卻仍存在差異；PCA表明，3個主成分的累積方差貢獻率為91.677%，可代表樣品大部分信息，但與聚類分析結(jié)果存在一定差異，可能與評價指標[13]不同有關；通過比較主成分和差異性質(zhì)量標志物，確認秦皮乙素(4號峰)為共同標志化合物。秦皮乙素具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[22-23]，與額日赫木-8散傳統(tǒng)功效密切相關，故選擇該成分作為含量測定指標。

4 結(jié)論

本實驗建立額日赫木-8散HPLC指紋圖譜，并測定秦皮乙素含量，該方法簡便準確，可為控制全方質(zhì)量提供參考。