李志明， 黃 勇， 龍 鳳,2*， 孫少康， 劉曉燕， 趙 玉

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的癌癥之一，已成為世界第一大癌癥[1]。三陰性乳腺癌是乳腺癌的一種亞型，由于其特殊的分子異質(zhì)性及高侵襲性，目前藥物、手術(shù)效果均欠佳[2-5]，故明確本病內(nèi)在分子機(jī)制，研發(fā)高效、低毒、可靶向性的抗癌新藥及藥物組合刻不容緩。冬凌草甲素是冬凌草的主要活性成分，多次被報(bào)道在乳腺癌中扮演抗癌角色，但其具體抗癌分子機(jī)制尚不明確。已有研究表明AFAP1-AS1在乳腺癌中高表達(dá)，患者具有較高的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[6]，敲低AFAP1-AS1可通過(guò)影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[7]。lncRNA可充當(dāng)microRNA(miRNA)海綿或競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)，調(diào)控下游靶基因，影響癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。因此，本研究觀察siRNA靶向沉默lncRNAAFAP1-AS1并聯(lián)合冬凌草甲素對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及EMT的影響，分析冬凌草甲素抗三陰性乳腺癌可能的ceRNA調(diào)控分子機(jī)制，旨在進(jìn)一步揭示冬凌草甲素抗乳腺癌作用的新分子靶標(biāo)，以期為以lncRNAAFAP1-AS1為靶點(diǎn)研發(fā)治療乳腺癌的靶向藥物及藥物組合提供藥理學(xué)依據(jù)和奠定科學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，編號(hào)TCHu227。

1.2 試劑與藥物 冬凌草甲素(批號(hào)3239848，純度94.2%)購(gòu)自美國(guó)Merck公司。CCK-8試劑盒(批號(hào)LK811)購(gòu)自日本同仁公司；Transwell小室(批號(hào)02920022)、Matrigel基底膠(批號(hào)9343008)購(gòu)自美國(guó)Corning公司；riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒(批號(hào)S1230)、人屬AFAP1-AS1引物(批號(hào)T0814)、riboFECT CP Transfection Kit(批號(hào)T0915)、RiboTM h-AFAP1-AS1 Smart Silencer-2(批號(hào)T0824)、lncRNA Smart Silencer NC#1(批號(hào)T0710)購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；兔抗人GAPDH(批號(hào)YM3215)、Vimentin(批號(hào)YT4879)、E-cadherin(批號(hào)YT1454)、N-cadherin多克隆抗體(批號(hào)YT2988)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(批號(hào)RS002)均購(gòu)自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司；兔單克隆抗體CDC42(批號(hào)ab187643)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；小鼠單克隆抗體MAP3K10(批號(hào)sc-393675)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(批號(hào)CR2012171)購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器 HERAcell VIOS 160i型CO2恒溫培養(yǎng)箱、Varioskan LUX型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；LightCycler?96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)；PowerPacTM Basic型電泳槽/電轉(zhuǎn)移裝置(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞加到含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 采用riboFECTTM CP試劑盒、RiboTM lncRNA Smart Silencer試劑沉默MDA-MB-231細(xì)胞中AFAP1-AS1表達(dá)，由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成AFAP1-AS1 siRNA的靶序列和包括在人轉(zhuǎn)錄組中沒(méi)有靶標(biāo)的siRNA作為非靶標(biāo)對(duì)照(si-NC)。用riboFECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑在6孔板中以30%～50%的細(xì)胞密度進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，并孵育48 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，以4 μg/mL冬凌草甲素處理的細(xì)胞作為冬凌草甲素組；將si-NC、si-AFAP1-AS1分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中，作為siNC、siAFAP1-AS1組；將si-NC、si-AFAP1-AS1分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中，再用4 μg/mL冬凌草甲素處理，分別作為siNC+冬凌草甲素、siAFAP1-AS1+冬凌草甲素組；對(duì)照組加入含或者不含有血清、0.1% DMSO的DMEM培養(yǎng)液。

2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 以每孔3×103個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過(guò)夜后將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含有不同質(zhì)量濃度冬凌草甲素(0、2、4、6、8 μg/mL，DMSO溶解)的新鮮培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h；或?qū)⒓?xì)胞按“2.2”項(xiàng)下方法分組及給藥，培養(yǎng)48 h，加入CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度(OD)值。對(duì)照孔細(xì)胞存活率為100%，計(jì)算各組細(xì)胞相對(duì)存活率。

2.4 RT-qPCR法檢測(cè)AFAP1-AS1 mRNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞，采用RNAiso Plus試劑提取總RNA，超微量核酸蛋白測(cè)量?jī)x在260 nm/280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)RNA濃度。根據(jù)riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞AFAP1-AS1 mRNA表達(dá)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。AFAP1-AS1正向引物序列5′-CGGCATCCAACTCACAAGAC-3′，反向引物序列5′-GTCCTCTTCCCATGTGAGTCATC-3′，GAPDH內(nèi)參引物由廣州銳博生物技術(shù)有限公司提供。采用2-ΔΔCT法分析AFAP1-AS1相對(duì)表達(dá)。

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞以每孔1×106個(gè)的密度接種于含完全培養(yǎng)基的6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%后更換為不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，200 μL槍頭在每孔中劃線，PBS洗去脫落的細(xì)胞，加入無(wú)血清的含藥或不含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，在倒置顯微鏡下觀察0、48 h劃痕愈合的情況，并計(jì)算遷移率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將40 μL用DMEM稀釋后的基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell小室底部，在37 ℃下孵化過(guò)夜，將各組MDA-MB-231細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/mL。Transwell上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室每孔加入500 μL含20%胎牛血清的DMEM養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用棉簽拭子擦除小室上層未侵襲的細(xì)胞，4%福爾馬林固定膜下的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

2.7 Western blot法檢測(cè)CDC42、MAP3K10蛋白及EMT相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法分組及給藥，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，采用高效RIPA裂解液裂解并提取蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度并定量。蛋白樣品加入4×蛋白上樣緩沖液，水浴加熱變性，保存?zhèn)溆谩⒏鹘M蛋白加至PAGE膠中進(jìn)行電泳，再移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉40 min，加入一抗GAPDH(1∶5 000)、Vimentin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 500)、CDC42(1∶10 000)、MAP3K10(1∶500)，在4 ℃下孵育過(guò)夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)或HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和Western印跡成像系統(tǒng)檢測(cè)目標(biāo)條帶灰度，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

3 結(jié)果

注：與正常組織比較，**P<0.01；與AFAP1-AS1低表達(dá)組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.1 lncRNAAFAP1-AS1在三陰性乳腺癌組織中高表達(dá)并與乳腺癌患者不良預(yù)后有關(guān) 分別通過(guò)GEPIA2和lnCAR database在線工具分析AFAP1-AS1在三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)，結(jié)果如圖1A～1B所示，可知AFAP1-AS1在正常乳腺組織和三陰性乳腺癌組織中差異性表達(dá)(P<0.01)；與正常乳腺組織比較，AFAP1-AS1在三陰性乳腺癌組織中高表達(dá)(P<0.01)。為了進(jìn)一步探討AFAP1-AS1在乳腺癌患者中的預(yù)后意義，通過(guò)lnCAR database在線工具“survival analysis模塊”分析AFAP1-AS1表達(dá)與乳腺癌患者總生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期的相關(guān)性，結(jié)果如圖1C～1D所示，與AFAP1-AS1低表達(dá)的乳腺癌患者比較，AFAP1-AS1高表達(dá)的乳腺癌患者的生存期降低(P<0.05，P<0.01)。

3.2 冬凌草甲素調(diào)控lncRNAAFAP1-AS1表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 如表1所示，與對(duì)照組比較，冬凌草甲素組細(xì)胞存活率降低，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性(P<0.05，P<0.01)。如表2所示，與對(duì)照組比較，冬凌草甲素下調(diào)了MDA-MB-231細(xì)胞中AFAP1-AS1 mRNA表達(dá)(P<0.05)。

如表3所示，與si-NC組比較，沉默AFAP1-AS1表達(dá)后，細(xì)胞存活率降低(P<0.01)，siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯(lián)合使用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制作用比單獨(dú)應(yīng)用siAFAP1-AS1或冬凌草甲素更為明顯(P<0.01)。

表1 冬凌草甲素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響

表2 冬凌草甲素或siAFAP1-AS1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞AFAP1-AS1 mRNA表達(dá)的影響

表3 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響

3.3 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的影響 如圖2、表4所示，與si-NC組比較，siAFAP1-AS1組細(xì)胞相對(duì)遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.05)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用比單獨(dú)應(yīng)用siAFAP1-AS1或冬凌草甲素更顯著(P<0.01)。

圖2 各組MDA-MB-231細(xì)胞遷移(A)和侵襲(B)能力(×200)

表4 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的影響

3.4 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖3、表5所示，與對(duì)照組比較，冬凌草甲素組和siAFAP1-AS1組細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)均升高(P<0.05，P<0.01)，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯(lián)合使用上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，下調(diào)N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的作用比單獨(dú)應(yīng)用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1更顯著(P<0.01)。

圖3 各組MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

3.5 基于生物信息學(xué)分析lncRNAAFAP1-AS1的靶基因 在線數(shù)據(jù)庫(kù)ENCORI、DIANA-LncBasev.2預(yù)測(cè)與AFAP1-AS1相互作用的microRNA，取交集篩選出2個(gè)候選miRNA(圖4A)為miR-2278、miR-155-5p。有研究報(bào)道，miR-155-5p是三陰性乳腺癌中差異上調(diào)的miRNA且miR-155-5p和AFAP1-AS1之間存在互補(bǔ)位點(diǎn)[8-9]。通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)ENCORI、miRDB和TargetScan7.2預(yù)測(cè)miR-155-5p的靶基因，共找到包括絲裂原活化蛋白激酶激酶10(MAP3K10)在內(nèi)的220個(gè)靶基因(圖4B)。通過(guò)Bioconductor在線軟件對(duì)220個(gè)靶基因進(jìn)行GO(圖4C)和KEGG信號(hào)通路(圖4D)分析，發(fā)現(xiàn)其共同靶點(diǎn)主要富集于DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合和細(xì)胞粘附分子結(jié)合等關(guān)鍵生物過(guò)程；主要富集于多種癌癥通路，MAPK、PI3K-Akt和催乳素信號(hào)通路。

表5 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 生物信息學(xué)分析

3.6 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中CDC42、MAP3K10蛋白表達(dá)的影響 如圖5、表6所示，與對(duì)照組比較，冬凌草甲素和siAFAP1-AS1均可下調(diào)CdC42、MAP3K10蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞CdC42、MAP3K10蛋白表達(dá)的抑制作用比單獨(dú)應(yīng)用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1更顯著(P<0.01)。

圖5 各組MDA-MB-231細(xì)胞中Cdc42、MAP3K10蛋白表達(dá)

4 討論

目前已證實(shí)lncRNA作為新功能調(diào)控分子，參與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[10-11]。一項(xiàng)薈萃分析顯示，AFAP1-AS1在多種癌癥中均上調(diào)，AFAP1-AS1高表達(dá)與不良的臨床結(jié)果(如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)密切相關(guān)并參與腫瘤進(jìn)展[12]。

表6 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Cdc42、MAP3K10蛋白表達(dá)的影響

本研究通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析，進(jìn)一步證明了AFAP1-AS1過(guò)表達(dá)與乳腺癌患者總生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期呈負(fù)相關(guān)。冬凌草甲素被報(bào)道可下調(diào)人胰腺癌BxPC-3和PANC-1細(xì)胞中AFAP1-AS1的表達(dá)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，冬凌草甲素可下調(diào)細(xì)胞中AFAP1-AS1表達(dá)，與報(bào)道一致，結(jié)果表明AFAP1-AS1可能是冬凌草甲素治療乳腺癌的潛在分子靶標(biāo)。

本研究探討了冬凌草甲素聯(lián)合siAFAP1-AS1對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的影響，結(jié)果表明，冬凌草甲素組和siAFAP1-AS1組細(xì)胞活力、遷移率和侵襲率均降低，且聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞抑制作用更顯著。EMT是腫瘤遷移的早期事件，它與細(xì)胞間連接的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，對(duì)癌細(xì)胞遷移至關(guān)重要，本研究結(jié)果表明，與單獨(dú)應(yīng)用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1比較，冬凌草甲素聯(lián)合siAFAP1-AS1可降低EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)，升高E-cadherin蛋白表達(dá)，提示冬凌草甲素聯(lián)合siAFAP1-AS1治療乳腺癌可獲得更佳的抗癌療效。

研究表明lncRNA參與ceRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它維持調(diào)控癌細(xì)胞中基因通路的活性和功能平衡[14-15]。本研究通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析共找到包括MAP3K10在內(nèi)的220個(gè)靶基因，而MAPK為顯著性富集的信號(hào)通路之一。MAP3K10是MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控分子，可通過(guò)激活MKK4和MKK7激活JNK通路，參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，MAP3K10在胰腺導(dǎo)管腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，MAP3K10過(guò)表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖[18]。細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42, Cdc42)是MAP3K10上游的信號(hào)分子，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期進(jìn)程和腫瘤血管生成等[19]。在乳腺癌中，Cdc42能夠與下游效應(yīng)蛋白相互作用，抑制表皮生長(zhǎng)因子受體降解，從而使MAPK被持續(xù)激活，最終造成腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移[20]。因此，推測(cè)Cdc42/MAP3K10可能作為AFAP1-AS1靶點(diǎn)參與冬凌草甲素和siAFAP1-AS1抑制MDA-MB-231細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)應(yīng)用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1均可下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中CDC42、MAP3K10蛋白表達(dá)；聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞中CDC42、MAP3K10蛋白表達(dá)的抑制作用更顯著，提示冬凌草甲素和 siAFAP1-AS1對(duì)Cdc42/MAP3K10信號(hào)通路存在一定的抑制作用。

綜上所述，冬凌草甲素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的抑制作用可能是通過(guò)下調(diào)AFAP1-AS1表達(dá)進(jìn)而抑制Cdc42/MAP3K10信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果為冬凌草甲素應(yīng)用于乳腺癌的治療提供了新的藥理學(xué)依據(jù)，為以lncRNAAFAP1-AS1為靶點(diǎn)研發(fā)治療乳腺癌的靶向藥物及藥物組合提供了可能。