馬春娟， 王慧卓， 李 冰， 王月潔， 趙家彬， 鮑慧瑋*

(1.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥品食品學(xué)院，吉林 長春 130000；2.白城市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 白城 137000；3.白城市醫(yī)院，吉林 白城 137000；4.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117)

四紅丹是由當(dāng)歸、大黃、地榆(炭)、槐花(炭)、當(dāng)歸(炭)、大黃(炭)6味藥材組成的復(fù)方制劑，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》第1冊(cè)(標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)WS3-B-0525-91)[1]，具有清熱止血功效，用于治療吐血、衄血、便血、婦女崩漏下血[2]。方中藥效物質(zhì)較多，如阿魏酸是當(dāng)歸有機(jī)酸類活性成分，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛作用[3-4]，也是2020年版《中國藥典》當(dāng)歸項(xiàng)下含量測(cè)定的指標(biāo)成分[5]；槐花中主要活性成分蘆丁是一種無毒的生物類黃酮，具有抗炎、止血作用[6-7]；大黃中大黃酚、大黃素甲醚為蒽醌類化合物，也具有清熱瀉火、涼血解毒等功效[8-11]，全方將地榆、槐米、當(dāng)歸、大黃制炭，所謂“出血者屬熱者十之八九”[12-13]，從而增強(qiáng)了止血效果。

中藥復(fù)方制劑組成復(fù)雜，故既要從整體功效出發(fā)，又要從個(gè)體成分入手來揭示其臨床作用。前期查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，尚無關(guān)于四紅丹質(zhì)量控制的報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定方中沒食子酸、蘆丁、阿魏酸、大黃酚、大黃素甲醚的含量，以期為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；DHG-912A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；AB135-S型分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；多功能高速中藥粉碎機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試劑與藥物 四紅丹(自制，批號(hào)20200501、20200502、20200503、20200504、20200505，9 g/丸)。當(dāng)歸、大黃、地榆、槐花等藥材均購于吉林大藥房，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)肖井雷副教授鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》一部項(xiàng)下規(guī)定。沒食子酸(批號(hào)110831-201906，純度91.5%)、阿魏酸(批號(hào)110773-201915，純度99.4%)、蘆丁(批號(hào)100080-201811，純度91.7%)、大黃酚(批號(hào)110796-201922，純度99.4%)、大黃素甲醚(批號(hào)110758-201817，純度99.2%)對(duì)照品均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；甲醇、磷酸為分析純(北京化工廠)；水為純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品6.44 mg，甲醇溶解至2 mL量瓶中，搖勻。分別精密稱取大黃酚、大黃素甲醚、阿魏酸對(duì)照品6.75、8.89、5.59 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解定容，搖勻。精密稱取蘆丁對(duì)照品14.75 mg，再精密吸取上述溶液各1 mL，甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，制得各成分質(zhì)量濃度分別為0.322、1.475、0.067 5、0.088 9、0.055 9 mg/mL的貯備液，精密吸取1 mL，甲醇稀釋10倍，即得(各成分質(zhì)量濃度分別為32.2、147.5、6.75、8.89、5.59 μg/mL)。

2.2 供試品溶液制備 取本品適量，剪碎(約10目)，精密稱取9 g，置于錐形瓶中，加入10倍量70%甲醇回流提取30 min，濾過，重復(fù)2次，合并濾液，旋蒸蒸干，甲醇定容至10 mL，精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 陰性樣品溶液制備 分別取處方量的缺當(dāng)歸-當(dāng)歸(炭)、缺大黃-大黃(炭)、缺當(dāng)歸-地榆(炭)-槐花(炭)-當(dāng)歸(炭)、缺當(dāng)歸-當(dāng)歸(炭)-大黃-大黃(炭)-槐花(炭)-地榆(炭)，按照工藝制成相應(yīng)陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 色譜條件 Phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，10%A；10～30 min，10%～30%A；30～45 min，30%～40%A；45～53 min，40%～53%A；53～78 min，53%～85%A；78～90 min，85%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長275 nm(沒食子酸、蘆丁、大黃酚、大黃素甲醚)、322 nm(阿魏酸)；進(jìn)樣量20 μL。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性考察和專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰與相鄰峰分離良好，理論塔板數(shù)均大于3 000，陰性無干擾。

1.沒食子酸 2.蘆丁 3.大黃酚 4.大黃素甲醚 5.阿魏酸1.gallic acid 2.rutin 3.chrysophanol 4.physcion 5.ferulic acid

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.4、1、2、4、10 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、蘆丁、大黃酚、大黃素甲醚、阿魏酸峰面積RSD分別為0.74%、1.66%、0.45%、0.91%、1.25%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得沒食子酸、蘆丁、大黃酚、大黃素甲醚、阿魏酸峰面積RSD分別為0.43%、1.05%、0.72%、0.35%、0.96%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(批號(hào)20200501)適量，剪碎，精密稱取6份，每份約9 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、蘆丁、大黃酚、大黃素甲醚、阿魏酸含量RSD分別為1.38%、1.89%、1.53%、1.61%、1.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品若干丸，剪碎，分成6份，每份約4.5 g，精密加入蘆丁對(duì)照品10.25 mg、沒食子酸對(duì)照品溶液(0.456 mg/mL)5 mL、大黃酚對(duì)照品溶液(0.483 mg/mL)1 mL、大黃素甲醚對(duì)照品溶液(0.625 mg/mL)1 mL、阿魏酸對(duì)照品溶液(0.792 mg/mL)0.5 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.7 樣品含量測(cè)定 制備5批樣品，每批剪碎，取約9 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)首先考察了甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯對(duì)四紅丹提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇提取時(shí)效率高，雜質(zhì)少，而且它為流動(dòng)相組成部分，色譜圖中干擾主峰的雜質(zhì)較少，有利于測(cè)定。再考察了回流提取、浸漬、超聲提取等方法，發(fā)現(xiàn)浸漬法時(shí)間較長，提取率低；回流提取法時(shí)間較短，提取更完全；超聲提取法雖然操作簡(jiǎn)便快捷，但時(shí)間較長，提取也不夠完全。最終確定，供試品溶液制備方法為70%甲醇回流提取30 min。

3.2 檢測(cè)波長選擇 本實(shí)驗(yàn)參考2020年版《中國藥典》和文獻(xiàn)[14-17]報(bào)道，考察了檢測(cè)波長275、322、254、257 nm，根據(jù)各成分色譜峰峰形及吸收情況，最終確定為275 nm(沒食子酸、蘆丁、大黃酚、大黃素甲醚)、322 nm(阿魏酸)。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 各成分含量測(cè)定(mg/丸，n=3)

3.3 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸[18-20]，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.1%磷酸洗脫時(shí)各成分色譜峰峰形與相鄰峰的分離度較好，出峰時(shí)間適宜，最終確定其作為流動(dòng)相。

3.4 體積流量選擇 體積流量過小時(shí)，分析時(shí)間較長，影響實(shí)驗(yàn)效率；體積流量過大時(shí)，系統(tǒng)壓力上升，從而對(duì)色譜柱造成一定損害。本實(shí)驗(yàn)考察了體積流量0.5、1、1.5 mL/min對(duì)5種成分分離效果的影響，最終確定為1 mL/min。