徐俊濤， 王 瑩， 馬 飛， 王 麗， 方玉甫， 劉愛民

(1.河南省中醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州 450002；2.中山大學第六附屬醫(yī)院新生兒科，廣東 廣州 510655)

燒傷是急救醫(yī)學中最主要的疾病之一，嚴重燒傷可導致身體和心理上的傷疤和慢性殘疾[1]，可引起一系列問題，包括壞死、創(chuàng)傷、成纖維細胞損傷、炎癥、血液和淋巴毛細血管淤滯、膠原大量產(chǎn)生等[2]，當前治療藥物包括抗生素、消炎藥、銀鹽，但具有多種缺點和不良反應(yīng)[3]。黃芩素是一種黃酮化合物，最初來源于黃芩的根和黃芩苷的苷元[4]，具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗炎癥、神經(jīng)保護作用[5]，能促進皮膚隨機皮瓣存活[6]，但其在燒傷中的作用還有待進一步探究。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種細胞因子、趨化因子、黏附因子等的表達，在感染引起的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[7]。本研究旨在探究黃芩素對小鼠燒傷愈合的治療作用，以及其涉及的主要機制。

1 材料

1.1 動物 8～12周齡雄性BALB/c小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2019-028。實驗獲得河南省中醫(yī)院動物保護和使用委員會批準。

1.2 試劑與藥物 胎牛血清(批號1237698)、DMEM(批號8128032)購自美國Gibco公司；膜聯(lián)蛋白V-碘化丙啶(Annexin V-PI)雙染凋亡試劑盒(批號20150314)購自美國BD公司；二甲基亞砜(DMSO，貨號D8418)、黃芩素(純度>98%，貨號465119)、鼠源TNF-α重組蛋白(貨號H8916)購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒(貨號ab228554)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2，貨號ab182858)、caspase-3(貨號ab184787)、白介素-6(IL-6，貨號ab229381)、白介素-1β(IL-1β，貨號ab254360)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2，貨號ab181286)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9，貨號ab228402)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB，貨號ab239882)、總NF-κB(t-NF-κB，貨號ab207297)、β-actin(貨號ab8227)抗體購自英國Abcam公司；磷酸化NF-κB抑制蛋白-α(p-IκBα，貨號2859)、總IκBα(t-IκBα，貨號4812)購自美國Cell Signaling Technology公司；所有二抗均購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 儀器 超凈工作臺(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)；CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱、酶標儀、流式細胞儀、高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；凝膠成像儀(加拿大Carestream公司)；光學顯微鏡(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 小鼠燒傷模型建立 雄性BALB/c小鼠用戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉，剃掉背部毛發(fā)，暴露皮膚，將預熱到165 ℃的銅塊(2 cm×2 cm，150 g)接觸皮膚區(qū)域10 s(不對銅塊施加額外壓力，以確保使用相似壓力造成每次燒傷)。將小鼠隨機分為對照組，燒傷組，20、50 mg/kg黃芩素組，黃芩素(50 mg/kg)+TNF-α重組蛋白(5 μg/kg)組，每組8只，給藥組小鼠每隔2 d腹腔注射相應(yīng)劑量藥物，持續(xù)14 d。在第0～14天，每隔2 d對創(chuàng)面進行拍照，由2名研究人員采用IPP 6.0軟件對創(chuàng)面面積進行分析，并在第14天處死小鼠，計算傷口面積，公式為傷口面積=(殘余創(chuàng)面面積/初始創(chuàng)面面積)×100%。

2.2 組織學分析 在燒傷第8天將小鼠處死，用組織剪沿燒傷創(chuàng)面邊緣5 mm的位置取正方形組織塊，厚度為皮膚全層，置于10%福爾馬林緩沖液中固定至少24 h，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，切成5 μm厚切片，脫蠟后進行蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學顯微鏡(×100)下觀察組織病理形態(tài)變化。

2.3 原代皮膚成纖維細胞制備及培養(yǎng) 小鼠剃毛后處死，置于75%乙醇中浸泡10 min，PBS沖洗3次，取背部皮膚，去除血管脂肪等多余組織，PBS沖洗3次，切成小塊，加入0.05%胰酶消化液消化1 h，DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，PBS清洗細胞懸液，均勻鋪于細胞培養(yǎng)皿底部，并加入含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4 細胞熱刺激 將原代小鼠成纖維細胞置于熱水器水箱中，在52 ℃下孵育30 s，隨后放到正常環(huán)境中培養(yǎng)。

2.5 給藥 細胞經(jīng)熱刺激后，分別用20、50 μmol/L黃芩素干預細胞48 h；或細胞經(jīng)熱刺激后，用50 μmol/L黃芩素、100 ng/mL TNF-α重組蛋白共同干預細胞48 h。

2.6 細胞凋亡檢測 按“2.5”項下方法給藥48 h后，PBS清洗細胞3次，重懸于含Annexin V-FITC、PI各10 μL的結(jié)合緩沖液中，室溫避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，實驗重復3次。

2.7 細胞增殖檢測 將原代皮膚成纖維細胞以每孔1×104個細胞的密度接種至96孔板，按“2.5”項下方法給藥，在正常條件下分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，隨后在每孔加入10 μL CCK8試劑并混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶標儀檢測細胞在450 nm波長處的光密度(OD)值，計算增殖率，實驗重復3次。

2.8 Western blot檢測蛋白相對表達 采用RIPA裂解液提取細胞或組織中的蛋白，取20 μL進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(10%)電泳(120 V，2 h)，電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜(250 mA，2 h)，10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗在4 ℃下過夜孵育，加入二抗室溫孵育2 h。采用凝膠成像儀曝光蛋白條帶，Image-Pro Plus軟件分析條帶灰度值，實驗重復3次。

3 結(jié)果

3.1 黃芩素抑制熱刺激對小鼠皮膚成纖維細胞凋亡、增殖和炎癥因子的作用 如圖1所示，與對照組比較，皮膚成纖維細胞受熱刺激后，細胞增殖率、抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01)，細胞凋亡率升高(P<0.01)，促凋亡因子caspase-3、炎癥因子(IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9)蛋白表達升高(P<0.01)；與熱刺激組比較，20、50 μmol/L黃芩素處理能增加細胞增殖能力以及Bcl-2蛋白表達(P<0.05，P<0.01)，抑制細胞凋亡(P<0.05，P<0.01)，降低caspase-3、IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9蛋白表達(P<0.05，P<0.01)。

注：A～B為細胞凋亡情況，C為細胞增殖能力，D～F為細胞凋亡相關(guān)蛋白表達，G～K為細胞炎癥相關(guān)蛋白表達。與對照組比較，**P<0.01；與熱刺激組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 黃芩素抑制熱刺激誘導的NF-κB通路 如圖2所示，與對照組比較，皮膚成纖維細胞受熱刺激后，p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達升高(P<0.01)；與熱刺激組比較，20 、50 μmol/L黃芩素能抑制p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達(P<0.05，P<0.01)。

注：A為細胞蛋白條帶圖，B～C為細胞p-NF-κB、p-IκBα蛋白相對表達量。與對照組比較，**P<0.01；與熱刺激組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 黃芩素通過NF-κB通路抑制熱刺激對小鼠皮膚成纖維細胞凋亡、增殖和炎癥因子的作用 與熱刺激組比較，50 μmol/L黃芩素處理能抑制細胞凋亡(P<0.05)，下調(diào)p-NF-κB、p-IκBα、caspase-3、IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9蛋白表達(P<0.05)，增加細胞增殖和Bcl-2蛋白表達(P<0.05)；與50 μmol/L黃芩素組比較，100 ng/mL TNF-α(NF-κB通路激活劑)重組蛋白處理可逆轉(zhuǎn)黃芩素的作用，見圖3。

注：A～C為細胞NF-κB、IκBα蛋白表達，D～E為細胞凋亡率，F(xiàn)～H為細胞凋亡相關(guān)蛋白表達，I為細胞增殖能力，J～N為炎癥相關(guān)蛋白表達。與對照組比較，**P<0.01；與熱刺激組比較，#P<0.05；與50 μmol/L黃芩素組比較，$P<0.05。

3.4 黃芩素通過NF-κB通路促進小鼠燒傷恢復 與燒傷組比較，50 mg/kg黃芩素干預能促進燒傷愈合(P<0.05)，5 μg/kg TNF-α則抑制50 mg/kg黃芩素對創(chuàng)面愈合的促進作用(P<0.05)。在燒傷后第8天，燒傷組表皮結(jié)構(gòu)不完整，明顯增厚，表皮附近細胞數(shù)較其他2組減少，并觀察到瘢痕形成；50 mg/kg黃芩素組有少量毛囊形成，纖維組織排列較整齊，開始形成較完整的表皮；50 mg/kg黃芩素和5 μg/kg TNF-α共處理組表皮附近細胞數(shù)較燒傷組增多，表皮厚度較黃芩素組厚。與對照組比較，燒傷組織中IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01)；與燒傷組比較，20、50 mg/kg黃芩素干預能降低燒傷組織中IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(P<0.05，P<0.01)，升高Bcl-2蛋白表達(P<0.05，P<0.01)；與50 mg/kg黃芩素組比較，5 μg/kg TNF-α處理能升高IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(P<0.05)，降低Bcl-2蛋白表達(P<0.05)。見圖4。

注：A為燒傷面積統(tǒng)計，B為燒傷組織HE染色(×100)，C～I為細胞凋亡和炎癥相關(guān)蛋白表達。與對照組比較，**P<0.01；與燒傷組比較，#P<0.05，##P<0.01；與50 mg/kg黃芩素組比較，$P<0.05。

4 討論

燒傷至今仍是世界上導致死亡和殘疾的重要原因之一，其愈合過程是現(xiàn)代醫(yī)學的一大挑戰(zhàn)。盡管先進的臨床護理技術(shù)使燒傷病人死亡率有所下降，但仍面臨許多問題，如燒傷感染、傷口愈合延遲和肥厚性瘢痕形成等[8]。傳統(tǒng)中藥具有副作用小，成本低的優(yōu)勢，已被選作燒傷治療的替代藥物或輔助藥物[9]。

皮膚成纖維細胞是組成皮膚真皮的主要結(jié)構(gòu)成分，是傷口愈合過程中最重要的細胞成分之一，它們通過增殖、遷移、膠原形成和細胞因子分泌影響皮膚功能[10-11]。正常情況下，皮膚成纖維細胞維持一定的增殖和代謝速率，并分泌一定量的基質(zhì)和細胞因子以維持皮膚完整性和正常代謝。然而，在燒傷等環(huán)境壓力下，成纖維細胞表現(xiàn)出異常行為，包括增殖速度加快，炎性細胞因子分泌和細胞外基質(zhì)產(chǎn)生增多[12]。本研究中，小鼠原代皮膚成纖維細胞受熱刺激后，細胞凋亡增加，細胞增殖能力降低，且促炎性細胞因子(IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9)分泌增加。此外，熱刺激還可激活皮膚成纖維細胞中NF-κB信號通路。

黃芩素具有抗炎和抗氧化作用。Lin等[6]發(fā)現(xiàn)，黃芩素能促進皮膚隨機皮瓣存活，這與增強血管生成，減少氧化應(yīng)激和細胞凋亡有關(guān)。黃芩素通過影響Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號刺激血管生成，通過增強抗氧化因子活性抑制氧化應(yīng)激，通過調(diào)節(jié)磷酸肌醇三激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號抑制細胞凋亡[13-14]。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子控制多種生理過程，包括炎癥、免疫、細胞凋亡、細胞增殖和血管生成[15]。黃芩素通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抗炎作用[16]。研究表明，TNF-α在體內(nèi)外均能很好地激活NF-κB,可以作為NF-κB信號通路的陽性激活劑。本研究顯示，20、50 μmol/L黃芩素干預均可逆轉(zhuǎn)熱刺激誘導的皮膚成纖維細胞凋亡增加，增殖減少，炎性細胞因子分泌增加，NF-κB通路激活；而100 ng/mL TNF-α重組蛋白干預逆轉(zhuǎn)了黃芩素對熱刺激誘導的細胞損傷的保護作用，提示黃芩素發(fā)揮其功能主要通過抑制NF-κB信號通路活性。

研究表明，多種傳統(tǒng)中藥對小鼠燒傷愈合具有促進作用，如石榴皮提取物促進大鼠深度二級燒傷創(chuàng)面愈合，具有較強抗菌活性[17]。黃芩素已被報道在促進成纖維細胞膠原合成中發(fā)揮重要作用[18]。此外，黃芩素可通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad2/3信號傳導途徑減輕肥厚性瘢痕的形成[19]。本研究顯示，50 mg/kg黃芩素腹腔注射能降低燒傷組織中炎性細胞因子和促凋亡因子蛋白表達，升高抗凋亡因子表達，且可促進小鼠燒傷傷口愈合；而5 μg/kg TNF-α重組蛋白腹腔注射則抑制了黃芩素對燒傷愈合的促進作用，提示黃芩素主要通過抑制NF-κB信號通路促進小鼠燒傷恢復。

綜上所述，黃芩素可通過抑制NF-κB信號通路，緩解熱刺激對原代小鼠皮膚成纖維細胞的損傷，促進小鼠燒傷愈合。