郭書婷，馮彩霞，溫敏，馬嘉

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院 研究生院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

腦白質(zhì)高信號（white matter hyperintensity,WMH）被定義為腦小血管病相關(guān)的白質(zhì)受損，排除神經(jīng)免疫性、感染性、代謝性及中毒等病因。WMH 在老年人群中廣泛存在，發(fā)展到一定程度會出現(xiàn)認(rèn)知損害、癡呆、步態(tài)障礙、尿失禁，并與卒中和死亡風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)。內(nèi)皮功能障礙、慢性缺血及血腦屏障受損可能在發(fā)病機(jī)制中起主要作用［1］，但具體的機(jī)制仍需完善?；|(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）主要作用是分解彈性蛋白及膠原蛋白，有研究表明MMP-2 可通過降解緊密連接蛋白及基底膜，破壞血腦屏障［2］。本研究探討MMP-2、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloprotease inducer,EMMPRIN 或稱CD147）、親環(huán)素A（cyclophilin A,CyPA）與WMH 的關(guān)系，為臨床WMH 的干預(yù)提供參考指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用病例對照研究，選擇包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2019 年1 月至2021 年6 月收治的132 例WMH 患者作為WMH 組，其中男72 例，女60 例，年齡60～70 歲，平均（64.18±2.96）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2015 年的中國腦小血管病診治共識中的腦白質(zhì)疏松的影像診斷標(biāo)準(zhǔn)［3-4］的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3 個(gè)月內(nèi)急性腦卒中，既往高血壓、糖尿病病史。②頭顱磁共振血管造影（MRA）、數(shù)字減影血管造影（DSA）、CT 血管造影（CTA）提示顱內(nèi)大血管狹窄≥30%，或者頸部血管超聲、DSA、CTA 提示頸部血管狹窄≥50% 者。③感染、免疫、代謝、中毒、腦積水等其他病因?qū)е碌哪X白質(zhì)病變。④肝、腎、心等嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者。

選擇包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院門診同期58 例健康體檢者作為對照組，其中男27 例，女31 例，年齡60～70 歲，平均（63.31±2.22）歲。經(jīng)相關(guān)檢查無器質(zhì)性病變的，且頭顱MRI 排除WMH，MRA、頸部血管超聲排除顱內(nèi)外大血管狹窄者納入對照組。本研究經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號：2019 年科倫審第LW-004?；颊吆炇鹬橥鈺?。

1.2 研究方法

1.2.1 WMH 的評估WMH 嚴(yán)重程度采用腦白質(zhì)視覺評分（Fazekas）量表。評分標(biāo)準(zhǔn)［3-4］：總分0～6 分，1～2 分輕度，3～4 分中度，5～6 分重度。腦室周圍和深層白質(zhì)兩個(gè)部分分?jǐn)?shù)相加得總分。腦室周圍高信號：0 級正常；1 級鉛筆線狀、帽狀；2 級暈狀；3 級不規(guī)則延伸至深部白質(zhì)。深層白質(zhì)高信號：0 級正常；1 級斑點(diǎn)狀；2 級融合病灶；3 級大片融合病灶。

1.2.2 方法 入組后次日晨空腹抽靜脈血5 mL，3 mL 用于Ficoll 密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，-80℃保存待實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測MMP-2、CD147、CyPA 基因水平。2 mL 用于收集血清，-80℃保存待酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELASA）檢測MMP-2、CD147、CyPA 蛋白水平。

1.2.3 MMP-2、CD147、CyPA 蛋白檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清中MMP-2、CD147、CyPA 蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 MMP-2、CD147、CyPA mRNA 檢測 采用TRIZOL 法提取單個(gè)核細(xì)胞中的RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按總RNA 1 μg 為模板將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR 檢測MMP-2、CD147、CyPA 基因的相對表達(dá)水平。反應(yīng)體系為：預(yù)變性95℃10 min、循環(huán)（40 次）95℃15 s～60℃60 s、溶解曲線75℃～95℃，每20 s 升溫1℃；結(jié)果采用ΔΔCt 法計(jì)算MMP-2、CD147、CyPA 的相對表達(dá)水平。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。見表1。

表1 MMP-2、CD147、CyPA 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，以χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson 分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組患者間年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、3 日晨血壓平均值（收縮壓、舒張壓）、血糖、甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、尿酸比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 MMP-2、CD147、CyPA 表達(dá)水平

WMH 組MMP-2 mRNA、MMP-2 蛋白、CyPA mRNA、CyPA 蛋白水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。WMH 組CD147 蛋白水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），WMH 組CD147 mRNA 水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 兩組MMP-2、CD147、CyPA 表達(dá)水平比較（）

表3 兩組MMP-2、CD147、CyPA 表達(dá)水平比較（）

2.3 不同嚴(yán)重程度WMH 患者M(jìn)MP-2、CD147、CyPA 表達(dá)水平分析

WMH 嚴(yán)重程度按照Fazekas 量表評分分為三組，輕度WMH 組、中度WMH 組、重度WMH 組各44、42、46 例。不同嚴(yán)重程度WMH 之間MMP-2、CyPA 的mRNA 及蛋白表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；不同嚴(yán)重程度WMH 之間CD147 mRNA、CD147 蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，重度WMH組MMP-2、CyPA 的mRNA 及蛋白表達(dá)量均高于輕度組，重度WMH 組MMP-2、CyPA 的蛋白表達(dá)量均高于中度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表4。

表4 不同嚴(yán)重程度WMH 患者M(jìn)MP-2、CD147、CyPA 表達(dá)水平分析（）

表4 不同嚴(yán)重程度WMH 患者M(jìn)MP-2、CD147、CyPA 表達(dá)水平分析（）

注：1）與重度組比較，P<0.017；2）與輕度組比較，P<0.017；3）與中度組比較，P<0.017。

2.4 Pearson 相關(guān)性分析

MMP-2 mRNA 與MMP-2 蛋白表達(dá)量（r=0.638,P=0.000）、CyPA mRNA 與CyPA 蛋白表達(dá)量（r=0.575,P=0.000）、CD147 mRNA 與CD147 蛋白表達(dá)量（r=0.494,P=0.000）均成正相關(guān)。

3 討論

WMH 也稱腦白質(zhì)疏松癥，WMH 的病理生理學(xué)機(jī)制可能涉及慢性低灌注、腦血管反應(yīng)性降低、血腦屏障破壞、氧化應(yīng)激、炎癥、代謝障礙等［5］。血腦屏障由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮，內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接以及基底膜構(gòu)成。基底膜把血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞連接起來，形成神經(jīng)血管單元［6］。MMP-2 稱作明膠酶A，在健康人大腦中MMPs 水平非常低，在病理?xiàng)l件下MMP-2 降解緊密連接蛋白、基底膜，導(dǎo)致血腦屏障病變［2］。MMP-2 還具有神經(jīng)炎癥信號分子的作用，可通過多種機(jī)制促進(jìn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)組織損傷［2］。MMP-2 與腦白質(zhì)損害相關(guān)，其在腦白質(zhì)缺血受損區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增加［7-8］。本研究結(jié)果顯示W(wǎng)MH 組MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于對照組。不同嚴(yán)重程度WMH 之間，重度WMH 組MMP-2 mRNA 及蛋白表達(dá)量均高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測MMP-2 通過破壞血腦屏障，形成血管源性腦水腫，激活炎性細(xì)胞因子，參與了腦白質(zhì)高信號的發(fā)生和發(fā)展。

CD147 是MMPs 的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，也是炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)。CyPA 在體內(nèi)外均能刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥細(xì)胞的遷移［9］。CD147 是CyPA 的受體，CyPA 可直接與CD147 結(jié)合，上調(diào)MMPs 的表達(dá)，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，促進(jìn)基質(zhì)降解，促進(jìn)炎癥細(xì)胞招募［10］。CD147 在正常血管中表達(dá)極少，但在發(fā)生炎癥和血管損傷后其表達(dá)增加［11］。研究發(fā)現(xiàn)，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的CD147，在大腦中動脈短時(shí)間閉塞后表達(dá)迅速增加［12］。本研究中發(fā)現(xiàn)WMH 組CD147 蛋白表達(dá)量高于對照組。研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，在缺氧、感染等病理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)CyPA 分泌到細(xì)胞外，與CD147結(jié)合，以自分泌或旁分泌途徑參與受體CD147 介導(dǎo)的信號通路，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎性活化，最終導(dǎo)致血腦屏障破壞、腦水腫及腦神經(jīng)功能損傷。CyPA 能趨化白細(xì)胞，使單核巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)CD147，分泌MMP 且使其活性增加［15］。本研究結(jié)果顯示W(wǎng)MH 組CyPA mRNA 及蛋白水平均高于對照組。不同嚴(yán)重程度WMH 之間，重度WMH 組CyPA mRNA 及蛋白表達(dá)量均高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測CyPA 參與了腦白質(zhì)病變的發(fā)生、發(fā)展。推測MMP-2 可能通過CD147/CyPA 的相互作用表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)其降解基底膜，破壞血腦屏障，激活炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致了腦白質(zhì)病變。

隨著對腦白質(zhì)病變的研究，人們對腦白質(zhì)的認(rèn)識逐漸深入，提出了全腦保護(hù)的理念。隨著年齡的增加，老年人高血壓、動脈粥樣硬化等患病率亦逐漸增加，顱內(nèi)大血管、小血管病變經(jīng)常交織在一起，為了減少干擾，為了更好的探討WMH的發(fā)病機(jī)制，本研究選擇了無大動脈狹窄、無高血壓的無臨床癥狀的WMH 患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)，無高血壓、無大動脈狹窄的WMH 患者，MMP-2、CyPA 的mRNA 及蛋白表達(dá)量均增加，且與WMH 嚴(yán)重程度有關(guān)，MMP-2、CyPA 有可能成為預(yù)測WMH 發(fā)病及病情進(jìn)展的觀測指標(biāo)。MMP-2是否通過CD147/CyPA 的相互作用參與腦白質(zhì)病變的發(fā)生，后期有待進(jìn)一步研究繼續(xù)驗(yàn)證。