陳銀翠， 杜 靜， 王琪琪， 王云勝， 張傳博

(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

黃芪可用于治療糖尿病及其并發(fā)癥，其主要成分為甘露糖、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ、毛蕊異黃酮葡萄糖苷等，具有補氣、止汗、消腫等功效[1-2]。2020年版《中國藥典》把黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為黃芪藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，其中黃芪甲苷具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化等作用；毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有保護骨骼、改善疲勞等作用[3]。我國古代醫(yī)學(xué)典籍中記載了大量發(fā)酵中藥炮制品，研究發(fā)現(xiàn)，利用微生物發(fā)酵中藥材，可提高中藥材有效成分的產(chǎn)出率和利用率[4]。郭瑞等[5]利用植物乳桿菌發(fā)酵黃芪，發(fā)現(xiàn)其異黃酮含量增加。尹秀娟等[6]利用芽孢菌發(fā)酵黃芪，發(fā)現(xiàn)黃芪發(fā)酵物能提高豬的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，促進(jìn)其免疫器官的發(fā)育和成長。Qiao等[7-8]利用乳酸桿菌發(fā)酵黃芪飼喂肉雞，發(fā)現(xiàn)其對肉雞的生長、血清生化參數(shù)和糞便微生物菌群均有良好改善作用。

冠突散囊菌屬于散囊菌屬，是在特殊溫濕度條件下，茯磚茶通過“發(fā)花”工藝滋生的一種天然益生菌，俗稱“金花菌”，其能分泌多種胞外酶[9-11]，并可將纖維素和多糖等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)。本研究利用冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵黃芪，促進(jìn)黃芪有效成分釋放和轉(zhuǎn)化，并評價其體外抗氧化活性和降糖作用，以期為進(jìn)一步開發(fā)中藥材提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 冠突散囊菌從安化黑茶中分離，經(jīng)貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室分離保存。黃芪購自榆林市廣濟堂中藥開發(fā)有限責(zé)任公司，批號20081902，經(jīng)專家鑒定為正品，切片后在35 ℃下烘干備用。

1.2 試劑 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號610G021)、黃芪甲苷對照品(批號1226B023，純度≥98%)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，批號W12A9E55779)、抗壞血酸(批號F20130819)、阿卡波糖(批號M13M11K109686)、蘆丁(批號1009H022)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，批號RH171390)、α-淀粉酶(批號R13O9Y72167)、α-葡萄糖苷酶(批號L24S11Y125689)均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 儀器 RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海洪旋實驗儀器有限公司；Biotek Epoch2全波長酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司，DH6000II電熱恒溫培養(yǎng)儀購自天津市泰斯特儀器有限公司；Agilent 1269高效液相色譜儀購自美國Agilent公司。

1.4 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基購自山東拓普生物工程有限公司，批號20201015；黃芪基質(zhì)培養(yǎng)基(黃芪50 g、水40 mL)、大米基質(zhì)培養(yǎng)基(大米50 g、水40 mL)均為實驗室自制，在115 ℃下滅菌30 min。

2 方法

2.1 冠突散囊菌活化和孢子懸浮液制備 使用竹簽將冠突散囊菌保存菌種接種于制備好的PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)5 d后接種鏟刮取菌絲，轉(zhuǎn)移到盛有100 mL無菌水的三角瓶中，28 ℃、120 r/min振蕩30 min，血球計數(shù)板計數(shù)，并稀釋成細(xì)胞密度為4×106/mL，即得。

2.2 冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵 按照接種量為培養(yǎng)基質(zhì)量的5%將冠突散囊菌接種到黃芪基質(zhì)上，在28 ℃下培養(yǎng)。發(fā)酵第6天時，黃芪基質(zhì)上布滿冠突散囊菌菌絲，生長旺盛，即為發(fā)酵結(jié)束。以滅菌未接菌種黃芪、大米培養(yǎng)基質(zhì)為對照。

2.3 發(fā)酵物提取制備 按照文獻(xiàn)[12]報道，將發(fā)酵產(chǎn)物置于35 ℃烘箱中烘干后粉碎，稱取適量粉末，95%乙醇提取(料液比1∶10)，浸泡過夜，超聲提取3次，過濾后收集濾液，35 ℃旋蒸濃縮得浸膏，作為發(fā)酵黃芪，以大米培養(yǎng)基和未接種黃芪為對照同法提取，分別作為大米培養(yǎng)冠突散囊菌、未發(fā)酵黃芪，將提取物保存在4 ℃冰箱中。

2.4 總黃酮含量測定 采用硝酸鋁顯色法[13]測定“2.3”項下提取物總黃酮含量，以蘆丁為對照品。吸取提取物溶液1 mL，置于10 mL試管中，加5%亞硝酸鈉0.5 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁0.5 mL，搖勻，靜置6 min，加10%NaOH溶液4 mL，搖勻，靜置15 min，吸取200 μL至96孔板中，在510 nm波長處測定吸光度，平行3次，取平均值。

2.5 HPLC分析

2.5.1 供試品溶液制備 取發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌、未發(fā)酵黃芪提取物適量，50%甲醇溶解成所需質(zhì)量濃度，即得。

2.5.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，置于棕色量瓶中，50%甲醇定容，制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的溶液，即得。

2.5.3 色譜條件 按文獻(xiàn)[14]報道，Agilent Zorbax C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～15 min，81%B；15～25 min，81%～71%B；25～35 min，71%～60%B；35～65 min，60%B～0)；體積流量1 L/min；柱溫35 ℃；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量20 μL。ELSD參數(shù)為漂移管溫度93.8 ℃；氣體體積流量2.7 L/min。

2.6 抗氧化活性、降糖作用研究

2.6.1 清除DPPH自由基 按照文獻(xiàn)[12]報道，取發(fā)酵黃芪、未發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌提取物適量，50%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的溶液，分別在5 mL EP試管中加入1 mL，再加入0.1 mmol/L DPPH溶液1 mL，搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min，取200 μL，在517 nm波長處測定吸光度A1；取等體積50%甲醇代替DPPH溶液，在517 nm波長處測定吸光度A2；取等體積50%甲醇代替樣品溶液，在517 nm波長處測定吸光度A3。以質(zhì)量濃度為4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的抗壞血酸為陽性對照，平行3次，取平均值，計算DPPH自由基抑制率和IC50值，公式為抑制率=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

2.6.2 清除ABTS自由基 按照文獻(xiàn)[15]報道，將7.4 mmol/L ABTS溶液、2.6 mmol/L K2S2O8溶液按1∶1比例混合，室溫避光暗處理16 h，乙醇稀釋成吸光度為0.70±0.02(734 nm波長處)，現(xiàn)配現(xiàn)用。取發(fā)酵黃芪、未發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌提取物適量，50%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的溶液，分別取0.1 mL，加入ABTS工作液3.9 mL，充分搖勻，室溫避光靜置6 min，吸取200 μL，在734 nm波長處測定吸光度A1；取等體積無水乙醇代替ABTS工作液，在734 nm波長處測定吸光度A2；取等體積50%甲醇代替樣品溶液，在734 nm波長處測定吸光度A3。以質(zhì)量濃度為4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的抗壞血酸為陽性對照，平行3次，取平均值，計算各組ABTS自由基抑制率和IC50值，公式為抑制率=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

2.6.3 抑制α-淀粉酶 按照文獻(xiàn)[16]報道，取發(fā)酵黃芪、未發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌提取物適量，蒸餾水依次溶解稀釋成質(zhì)量濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的溶液，于96孔板中加入PBS溶液40 μL、提取物溶液40 μL、α-淀粉酶溶液20 μL，混勻，在37 ℃下反應(yīng)10 min，加入可溶性淀粉溶液30 μL，混勻，在37 ℃下反應(yīng)10 min，加入HCl溶液20 μL，終止反應(yīng)，最后加入碘液120 μL，混勻，在565 nm波長處測定吸光度A1；取等體積PBS溶液代替淀粉溶液，在565 nm波長處測定吸光度A2；取等體積PBS溶液代替樣品和α-淀粉酶溶液，在565 nm波長處測定吸光度A3。以質(zhì)量濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的阿卡波糖為陽性對照，平行3次，取平均值，計算α-淀粉酶活性抑制率和IC50值，公式為抑制率=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

2.6.4 抑制α-葡萄糖苷酶 按照文獻(xiàn)[17]報道，取發(fā)酵黃芪、未發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌提取物適量，蒸餾水依次溶解稀釋成質(zhì)量濃度為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL，于96孔板中加入PBS溶液145 μL、各提取物溶液15 μL、α-葡萄糖苷酶15 μL，混勻，在37 ℃下反應(yīng)10 min，加入PNPG 15 μL，混勻，在37 ℃下反應(yīng)20 min，再加入Na2CO360 μL，在405 nm波長處測定吸光度A1；取等體積PBS溶液取代α-葡萄糖苷酶，在405 nm波長處測定吸光度A2；取等體積PBS溶液取代PNPG，在405 nm波長處測定吸光度A3。以質(zhì)量濃度為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的阿卡波糖為陽性對照，平行3次，取平均值，計算α-葡萄糖苷酶抑制和IC50值，公式為抑制率=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

3 結(jié)果

3.1 總黃酮含量 冠突散囊菌在黃芪基質(zhì)上長勢良好，在接種的第2天長出少量白色菌絲，第3天白色菌絲明顯出現(xiàn)，長勢比大米培養(yǎng)基上更快。接種第5天，黃芪基質(zhì)上生長的黃色菌絲比大米培養(yǎng)基明顯，接種第6天冠突散囊菌菌絲完全布滿黃芪基質(zhì)，表明黃芪基質(zhì)可充分滿足冠突散囊菌的生長。以吸光度為縱坐標(biāo)(A)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為A=0.939 9X+0.013 2(R2=0.999 2)，在0.1～1 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。發(fā)酵前后，總黃酮平均含量分別為7.11、5.51 mg/g，即發(fā)酵后該成分含量更高。

3.2 專屬性考察 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷對照品溶液適量，在“2.5.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰明顯，附近無其他成分干擾。

3.3 線性關(guān)系考察 取“2.5.1”項下對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，50%甲醇定容至10 mL，在“2.5.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷方程分別為Y=139 930.134 0X+49.669 4(R2=0.999 99)、Y=23 475.091 3X+21.062 2(R2=0.999 90)，在0.02～0.15 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 精密度試驗 取“2.5.1”項下對照品溶液，在“2.5.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷峰面積RSD分別為1.52%、1.35%，表明儀器精密度良好。

3.4.2 重復(fù)性試驗 按“2.5.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.5.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷峰面積RSD分別為0.35%、0.77%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4.3 穩(wěn)定性試驗 取“2.5.1”項下供試品溶液，于0、2、4、6、8、10 h在“2.5.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷峰面積RSD分別為1.83%、0.91%，表明溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4.4 加樣回收率試驗 精密取各成分含量已知的發(fā)酵產(chǎn)物，加入0.2 mg/mL對照品溶液，按“2.3”項下方法提取，按“2.5.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.5.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷平均加樣回收率(RSD)分別為100.10%(3.35%)、99.27%(6.25%)。

3.5 色譜分析 圖2顯示，在相同質(zhì)量濃度下發(fā)酵黃芪比未發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌檢測出更多成分吸收峰，包括1、2、5、7、9、10、11、13號等新峰；未發(fā)酵黃芪與發(fā)酵黃芪有重疊峰，如3、4、10號；大米培養(yǎng)冠突散囊菌中上述峰極少，只有16、17號，也是冠突散囊菌特有的。由此可知，在相同質(zhì)量濃度下，冠突散囊菌發(fā)酵前后黃芪中各成分吸收峰強度發(fā)生顯著變化，甚至出現(xiàn)新的成分吸收峰。

3.6 抗氧化活性、降糖作用

3.6.1 清除DPPH自由基 圖3顯示，在0.125～4 mg/mL范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度增加，發(fā)酵黃芪、未發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌對DPPH自由基清除能力逐漸增強，在4 mg/mL時三者和抗壞血酸的清除率分別為63.71%、95.42%、95.06%、95.74%，表明冠突散囊菌具有一定的清除DPPH自由基能力；抗壞血酸、發(fā)酵黃芪、未發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌IC50值分別為0.009 3、0.250 0、0.559 2、2.661 0 mg/mL，即對DPPH自由基的清除作用依次為抗壞血酸>發(fā)酵黃芪>未發(fā)酵黃芪>大米培養(yǎng)冠突散囊菌。

3.6.2 清除ABTS自由基 由圖4可知，在0.125～4 mg/mL范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度增加，抗壞血酸、發(fā)酵黃芪、未發(fā)酵黃芪對ABTS自由基清除率呈升高趨勢，其中發(fā)酵黃芪比未發(fā)酵黃芪更明顯，在4 mg/mL時兩者清除率分別為84.86%、23.71%；不同質(zhì)量濃度下大米培養(yǎng)冠突散囊菌清除率都在7.50%左右，表明它基本上不具有清除能力；抗壞血酸、發(fā)酵黃芪、未發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌IC50值分別為0.017 1、1.604 7、12.896 7、32.833 3 mg/mL，即對ABTS自由基的清除作用依次為抗壞血酸>發(fā)酵黃芪>未發(fā)酵黃芪>大米培養(yǎng)冠突散囊菌。

3.6.3 抑制α-淀粉酶 由圖5可知，在0.625～20 mg/mL范圍內(nèi)，大米培養(yǎng)冠突散囊菌對α-淀粉酶的抑制平緩穩(wěn)定，平均抑制率為52.40%，表明它具有一定的抑制能力；阿卡波糖未表現(xiàn)出劑量依賴性，對α-淀粉酶的平均抑制率為55.17%，其原因可能是該藥物不穩(wěn)定，需避光操作，而本實驗在配制、測量過程中沒有完全達(dá)到這一點；隨著質(zhì)量濃度增加，發(fā)酵黃芪、未發(fā)酵黃芪樣品對α-淀粉酶的抑制呈濃度依賴性，以發(fā)酵黃芪更明顯，表明經(jīng)冠突散囊菌發(fā)酵后可增強黃芪抑制率；發(fā)酵黃芪、未發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌、阿卡波糖IC50值分別為1.223 7、2.522 7、2.828 7、6.976 7 mg/mL，即對α-淀粉酶的抑制作用依次為發(fā)酵黃芪>未發(fā)酵黃芪>大米培養(yǎng)冠突散囊菌>阿卡波糖。

3.6.4 抑制α-葡萄糖苷酶 圖6顯示，在0.0625～2 mg/mL范圍內(nèi)，抗壞血酸對α-葡萄糖苷酶的抑制率最強，在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時達(dá)95.90%；發(fā)酵黃芪抑制作用高于未發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌，后兩者抑制作用相當(dāng)，表明黃芪發(fā)酵后可提高上述活性；阿卡波糖、發(fā)酵黃芪、未發(fā)酵黃芪、大米培養(yǎng)冠突散囊菌IC50值分別為0.161 9、1.384 7、1.996 3、2.159 7 mg/mL，即對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用依次為阿卡波糖>發(fā)酵黃芪>未發(fā)酵黃芪>大米培養(yǎng)冠突散囊菌。

4 討論與結(jié)論

冠突散囊菌具有抗氧化、調(diào)節(jié)糖代謝等功效[18]。本研究利用冠突散囊菌發(fā)酵黃芪，發(fā)現(xiàn)總黃酮和黃芪甲苷含量較未發(fā)酵分別增加了1.29、2.01倍，顯著提高了DPPH、ABTS自由基清除率，并能抑制α-淀粉酶和α-葡糖苷酶活性，說明冠突散囊菌發(fā)酵對黃芪的生物活性產(chǎn)生了積極作用，推測黃芪經(jīng)冠突散囊菌發(fā)酵后類黃酮、皂苷類及其他未知成分含量提高并有新化合物生成，其對抗氧化活性和降糖作用發(fā)揮著重要作用。此外，經(jīng)HPLC法檢測發(fā)酵黃芪出現(xiàn)了新的成分吸收峰，如1、2、5、7、8、9、10、11、13號峰，且共同成分吸收峰3、4、10號含量不同，其原因一方面可能是冠突散囊菌分泌某些胞外酶如纖維素酶、果膠酶、氧化酶等使黃芪中大分子細(xì)胞壁物質(zhì)降解，從而使細(xì)胞內(nèi)的黃芪甲苷等活性物質(zhì)更易于釋放[10,19-20]，導(dǎo)致發(fā)酵后黃芪甲苷的含量增加；另一方面可能是冠突散囊菌分泌的大量水解酶類將苷元物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為次級苷或其他苷元物質(zhì)[21]，具體的轉(zhuǎn)化途徑和生成的新化合物還需進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，利用微生物發(fā)酵中藥材，借助其產(chǎn)生的豐富酶系對中藥材進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，這是尋求新化合物和提高中藥材有效成分產(chǎn)出率及利用率的有效途徑。

自由基參與糖尿病的發(fā)生和發(fā)展，其表達(dá)異?？勺钄嘁葝u素信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致胰島素抵抗和敏感性降低，致使血糖不斷升高，加快糖尿病發(fā)生，可通過清除自由基改善胰島素細(xì)胞來治療糖尿病。Ⅱ型糖尿病最好的治療策略之一是通過抑制碳水化合物水解酶(如α-淀粉酶和α-葡糖苷酶)來防治餐后高血糖和緩解高胰島素血癥[22]。黃芪具有抗糖尿病、抗炎和抗氧化作用[23-24]，本研究發(fā)酵黃芪的成分和含量發(fā)生了變化，生物活性也得到了提高，這對研究發(fā)酵黃芪的代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物來尋找新型治糖尿病藥物具有重要意義。本課題組后續(xù)將對發(fā)酵黃芪應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病老鼠進(jìn)行研究來探討發(fā)酵產(chǎn)物治療糖尿病及其作用機制，以期為抗糖尿病開發(fā)新藥提供理論依據(jù)。