趙林松， 江美芳， 王丹丹， 韋亞芳， 高 崎*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203；2.上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海 201703)

銀杏酮酯為我國自主研發(fā)的一種新型銀杏葉提取物，是銀杏葉主要有效成分(銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮)高度富集的提取物，具有擴(kuò)張冠狀動脈、抑制血小板聚集的作用，主要用于治療血瘀誘發(fā)的胸痹及血瘀引起的眩暈，還對冠心病、心絞痛有一定療效[1]。在工業(yè)生產(chǎn)中，需要利用柱層析技術(shù)來富集銀杏葉提取液中藥效成分，同時去除雜質(zhì)和致敏成分(銀杏酸)[2]，這也是關(guān)鍵工段。

目前，藥品質(zhì)量控制僅依賴于對成品的檢驗，往往忽視了生產(chǎn)過程中有效成分的變化情況，但傳統(tǒng)檢測技術(shù)一般需要復(fù)雜的樣品處理，并且耗時較長，難以滿足洗脫過程的動態(tài)檢測[3-4]。同時，在工廠中判斷洗脫的結(jié)束主要來自工人主觀經(jīng)驗，沒有科學(xué)的數(shù)據(jù)支持，造成產(chǎn)品均一性較差、資源浪費等問題。

近紅外光譜具有無需樣品預(yù)處理、無損耗、檢測速度快等特點，已作為一種成熟的快速分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品、材料等領(lǐng)域[5-8]。因此，本實驗采用該技術(shù)構(gòu)建銀杏酮酯生產(chǎn)工藝洗脫工段大孔樹脂的洗脫1過程和聚酰胺樹脂的洗脫2過程(圖1)中總萜類內(nèi)酯定量獨立模型,并且在此基礎(chǔ)上建立了這2個工段的通用模型，以期實現(xiàn)整體洗脫工段總萜類內(nèi)酯的快速定量分析，提升檢測效率[9]，為銀杏酮酯洗脫過程提供快速無損的檢測方法，同時為洗脫終點判定提供數(shù)據(jù)支持，從而實現(xiàn)生產(chǎn)過程質(zhì)量控制，保證產(chǎn)品質(zhì)量[10]。

1 材料

MPA-II近紅外光譜儀(德國布魯克光譜儀器公司)，Waters Xevo G2-XS Q-TOF·ESI 液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters公司)；OPUS7.8、MATLAB R2017a化學(xué)計量學(xué)軟件；Oringin2018繪圖軟件。洗脫液收集自上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司提取車間的大孔樹脂柱和聚酰胺柱，取樣方式為洗脫開始前15 min每隔3 min取樣1次，15 min后至洗脫60 min每隔5 min取樣1次，最后每隔10 min取樣1次直至洗脫結(jié)束，得7批大孔樹脂柱洗脫1，批號分別為201012、201022、201104、201105、201118、201119、201128，共132份樣品；7批聚酰胺柱洗脫2，批號分別為201012、201022、201104、201105、201118、201119、201128，共124份樣品。

2 方法

2.1 近紅外光譜 空白背景為空氣；分辨率8 cm-1；樣品池為2 mm石英比色皿；每個樣品圖譜掃描32次；波數(shù)12 000～4 000 cm-1，原始光譜見圖2。

2.2 UPLC-MS法測定總萜類內(nèi)酯含量

2.2.1 分析條件

2.2.1.1 色譜 Waters Acquity UPLC/Xevo G2-XS Q-TOF超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；Waters Acquity UPLC BEH C181.7 μm色譜柱 (100 mm×2.1 mm)；流動相水(含0.1%甲酸)(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%～25%B；5～17 min，25%B；17～22 min，25%～35%B；22～35 min，35%～40%B；35～40 min，40%～65%B；40～50 min，65%～85%B；50～60 min，85%～98%B)；體積流量0.2 mL/min；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.2.1.2 質(zhì)譜 負(fù)離子模式，Sensitivity模式(分辨率30 000)；毛細(xì)管電壓-2.5 kV；樣品錐孔電壓40 V；源偏移電壓80 V；源溫120 ℃；脫溶劑溫度450 ℃；錐孔氣體積流量50 L/h；脫溶劑氣體積流量800 L/h；霧化氣壓力6.0 bar(1 bar=100 kPa)；m/z50～100 0；校正溶液0.5 mmol/L甲酸鈉溶液，體積流量20 μL/min；實時校正lock spray為1 ng/μL亮氨酸腦啡肽溶液，m/z554.261 5。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯對照品適量，二甲基亞砜制成各成分質(zhì)量濃度約為1 mg/mL的溶液，50%乙醇稀釋，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 將每個批次收集的0～10、10～30、30 min至洗脫結(jié)束的樣品分別用50%的乙醇稀釋500、250、50倍，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液適量，50%乙醇稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.2.1”項條件下各進(jìn)樣1 μL測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo) (Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.2.1”項條件下進(jìn)樣測定6次，測得各成分峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取洗脫液適量，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得各成分峰面積RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取洗脫液適量，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h在“2.2.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得各成分峰面積RSD均小于3%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取各成分含量已知的洗脫液1 ml，加入低、中、高質(zhì)量濃度對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項條件下進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=3)

2.3 近紅外光譜模型建立 采用偏最小二乘回歸(PLSR)，通過留一交互驗證法對光譜數(shù)據(jù)和實測化學(xué)值進(jìn)行擬合建模。基于間隔偏最小二乘法(iPLS)、協(xié)同間隔偏最小二乘(SiPLS)、競爭自適應(yīng)加權(quán)采樣法(CARS)等變量篩選方法選擇波段變量，以交互驗證誤差均方根(RMSECV)、相關(guān)系數(shù)(R)為評價指標(biāo)確定最佳波段選擇方法，以性能偏差比(RPD)、驗證集預(yù)測誤差均方根(RMSEP)、預(yù)測相對偏差(RSEP)為評價指標(biāo)確定最佳光譜預(yù)處理方法。其中，R越接近1，表示模型預(yù)測值與標(biāo)準(zhǔn)對照方法分析值之間的相關(guān)性越好；RPD越大，表明模型性能越好，其數(shù)值>3時表明模型具有較高的預(yù)測精度[11]；RMSEP與樣品化學(xué)值相關(guān)，其數(shù)值越小，結(jié)果越準(zhǔn)確；RSEP表示驗證集的預(yù)測值與真實值之間整體誤差，其數(shù)值越小，模型預(yù)測的準(zhǔn)確度越高，但上述參數(shù)不能單獨作為參考，需綜合應(yīng)用來考察模型性能。在中藥研究體系中，當(dāng)RPD>3、RSEP<15%時，模型性能和準(zhǔn)確度能滿足實際應(yīng)用[12]。

3 結(jié)果

3.1 樣品劃分 采用Kennard-Stone選擇方法，將2種樣本以7∶3的比例劃分為校正集和驗證集，驗證集作為獨立的樣本，僅用于模型驗證；通用模型的校正集則為兩種洗脫液校正集的總和，驗證集為兩種洗脫液的驗證集總和，結(jié)果見表3。由此可知，各模型驗證集濃度范圍均在校正集濃度范圍內(nèi)。

表3 樣品劃分結(jié)果

3.2 特征變量篩選

3.2.1 iPLS法 iPLS法是一種波段區(qū)間選擇方法。本實驗將整個光譜等分成10個等寬子區(qū)間，每個子區(qū)間上進(jìn)行PLS回歸，找出最小的RMSECV對應(yīng)區(qū)間，再以其為中心單向或雙向消減(或擴(kuò)充)波段變量，得到最佳單個子區(qū)間[13]。

3.2.2 SiPLS法 SiPLS是基于iPLS算法發(fā)展而來的波段選擇方法，將全波段劃分為若干個區(qū)間，將不同波段區(qū)間個數(shù)的任意組合。本實驗將整個光譜等分成10個等寬的子區(qū)間并任意組合，通過增加與去掉子區(qū)域來尋找到R最大、RMSECV最小的波段區(qū)間組合，作為最佳波段變量[14]。

3.2.3 CARS法 CARS是一種利用回歸系數(shù)進(jìn)行變量篩選的方法，基于“適者生存”原則，剔除無關(guān)變量，減少共線變量的影響。本實驗通過自適應(yīng)加權(quán)采樣技術(shù)篩選出PLS模型中回歸系數(shù)絕對值大的波段點，去掉權(quán)重較小者，利用交互驗證選出模型的RMSECV至最低的子集[15]，篩選過程見圖3。

3.2.4 波段篩選 表4顯示，洗脫1、洗脫2、通用模型的最佳波段選擇方法分別為iPLS、SiPLS、SiPLS。圖4顯示，上述3種模型分別在6 100～5 772 cm-1，8 252～7 500、6 100～5 448 cm-1，9 400～7 500 cm-1波數(shù)處有最大R、RPD和最小的RMSECV。銀杏內(nèi)酯屬于萜類化合物，在近紅外光譜中最重要的吸收峰來自C-H和O-H，但洗脫液中溶劑主要為水和乙醇的混合物，故本實驗波段避開了5 180、6 900 cm-1附近水(H2O)的干擾[16]，主要來自6 020～5 550、8700～7 040 cm-1處的CH2、CH3倍頻合頻吸收，其中通用模型可最大程度保留有效波段區(qū)間，與成分結(jié)構(gòu)之間具有較高的相關(guān)性，并且排除了近紅外光譜冗余信息，盡量保留了有效變量。

表4 特征波段選擇方法

3.3 光譜預(yù)處理 在波段篩選的基礎(chǔ)上，本實驗考察了二階導(dǎo)數(shù)、減去1條直線、矢量歸一化(SNV)、一階導(dǎo)數(shù)及與多種預(yù)處理方法的聯(lián)合應(yīng)用，并以RMSEP、RPD、RSEP為參考值進(jìn)行篩選，結(jié)果見表5。

表5 光譜預(yù)處理方法

由此可知，當(dāng)洗脫1、洗脫2、通用模型的最佳光譜預(yù)處理方法分別為一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合減去1條直線、二階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)時，各模型RPD、RMSEP、RSEP最理想。另外，經(jīng)光譜預(yù)處理后波段所建立模型的性能和準(zhǔn)確度都得到一定提升，可有效過濾近紅外光譜中噪聲信息，提高模型穩(wěn)健性。

3.4 定量預(yù)測模型建立 模型見表6，預(yù)測值與實測值的相關(guān)性分析見圖5。

表6 各模型參數(shù)

3.5 模型驗證 將洗脫1、洗脫2、通用模型的實測值和預(yù)測值進(jìn)行t檢驗，測得P值分別為0.867、0.943、0.823，表明兩者之間無顯著差異，并且三者R均大于0.95，RPD均大于3，RSEP均小于15%，表明其相關(guān)性良好，性能優(yōu)異，準(zhǔn)確性較高，可滿足實際應(yīng)用。洗脫1、2過程中總萜類內(nèi)酯含量分別為0.021～2.952、0.084～4.102 mg/mL，表明上述2個過程中有一部分樣本存在重疊，故通用模型具有更大的總萜內(nèi)酯的濃度覆蓋范圍。

再計算通用模型中洗脫1、2驗證集各自的RSEP，與獨立模型進(jìn)行比較，結(jié)果見表7。由此可知，在洗脫1過程中通用模型提高了預(yù)測準(zhǔn)確度，而在洗脫2過程中預(yù)測準(zhǔn)確度雖然略低，但整體上仍在可接受范圍內(nèi)。因此，基于相同成分的光譜變量所建立的通用模型能適用于2個洗脫過程，在增加樣本量的同時擴(kuò)大了模型應(yīng)用范圍，從而大幅度提高了模型對總萜類內(nèi)酯的檢測效率。

4 討論與結(jié)論

本實驗收集銀杏酮酯工業(yè)生產(chǎn)2個洗脫過程中的樣品，采用LC-MS法檢測洗脫液中萜類內(nèi)酯含量，結(jié)合NIRs技術(shù)建立了洗脫1、洗脫2及2個過程的通用定量預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)三者均有較高的性能和準(zhǔn)確性，能滿足定量分析，可用于快速檢測。

表7 獨立模型與通用模型的比較

同時，2個獨立的洗脫過程模型檢測指標(biāo)一致，但處于不同的過程，有一定差異，故通用模型擴(kuò)大了建模樣本的數(shù)量和濃度范圍，增加了模型可靠性和魯棒性，同時相比于洗脫1模型，它具有更好的性能和準(zhǔn)確性；相比于獨立模型，它可顯著提高模型預(yù)測效率。

綜上所述，本實驗證明了通用模型在銀杏內(nèi)酯類成分洗脫過程定量分析中的可行性。今后，可通過模型傳遞將通用模型應(yīng)用到近紅外的在線設(shè)備上，同時在考察工廠產(chǎn)能的基礎(chǔ)上確定洗脫終點的最佳范圍，實現(xiàn)對洗脫過程的在線監(jiān)控和自動化，最終達(dá)到中間品的快速放行和提升產(chǎn)品的均一性。