祝坤赟， 周成美， 任 鑫， 李芳潔， 胡晶紅,2*， 張永清,2*， 劉 謙,2

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省質(zhì)量控制與中藥全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250355)

蟾皮別名蟾皮、蛤蟆皮，為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanosticusSchneider的干燥全皮[1]，最早記載于《本經(jīng)逢原》，臨床上被廣泛用于治療惡性腫瘤、毒瘡、腸頭挺出等疾病，具有抗腫瘤[2]、抗炎[3]、免疫調(diào)節(jié)、抗菌與抗病毒、強(qiáng)心等藥理作用[4-5]，以華蟾素為代表的相關(guān)中藥制劑在臨床抗腫瘤治療中有著突出療效，正引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。但2020年版《中國(guó)藥典》未收錄蟾皮，地方中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也只有廣西壯族自治區(qū)、江蘇省、遼寧省、河南省、陜西省收錄，而且定性部分較多，定量部分缺少或模糊，整體質(zhì)量控制水平不高。目前，學(xué)者普遍認(rèn)為華蟾素制劑主要抗腫瘤成分為蟾皮中的蟾毒內(nèi)酯[6-7]，故該類(lèi)成分含量測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)蟾皮及其提取物中藥制劑質(zhì)量至關(guān)重要。

一測(cè)多評(píng)法利用中藥材有效成分的比例和函數(shù)關(guān)系，通過(guò)單一內(nèi)標(biāo)來(lái)建立對(duì)多組分的同步定量的品質(zhì)評(píng)價(jià)模型，近年來(lái)在中藥材多指標(biāo)成分含量測(cè)定中廣泛應(yīng)用[8-9]，但目前蟾皮中蟾毒內(nèi)酯的的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定蟾皮中華蟾酥毒基、日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、酯蟾毒配基、遠(yuǎn)華蟾蜍精、偽異沙蟾毒精的含量，以期為控制該藥材質(zhì)量及相關(guān)資源開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Waters Xbridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ME-204電子天平[萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Sorvall ST 8R離心機(jī)(熱電實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 奧斯特羅德分公司)。

1.2 試劑與藥物 華蟾酥毒基(批號(hào)W27M10Z84297，純度≥98%)、酯蟾毒配基(批號(hào)C30S8G45143，純度≥98%)、日蟾毒它靈(批號(hào)P17O9F72594，純度≥98%)、遠(yuǎn)華蟾蜍精(批號(hào)Y13A9Y67875，純度≥98%)、蟾毒靈(批號(hào)P27F10F81703，純度≥98%)、蟾毒它靈(批號(hào)P28M10F84299，純度≥98%)、偽異沙蟾毒精(批號(hào)Y18O9Y72597，純度≥98%)對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]。

1.3 藥材 蟾皮購(gòu)自山東日照，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor的干燥全皮，置于65 ℃烘箱中烘干至恒重，剪成約4 mm的方形小塊，放入貼好標(biāo)簽的離心管中備用。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)；梯度洗脫(0～5 min，20%～28%A；15～30 min，28%～29%A；30～35 min，29%～36.5%A；35～45 min，36.5%～38%A；45～46 min，38%～100%A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm；進(jìn)樣量20 μL。HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取偽異沙蟾毒精、日蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾蜍精、蟾毒它靈、蟾毒靈、酯蟾毒配基、華蟾酥毒基對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度均為0.05 mg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取置于離心管中的烘干蟾皮1.0 g，放到燒瓶中，加入甲醇50 mL，加熱回流提取60 min，水浴加熱濃縮，甲醇定容至5 mL量瓶中，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密移取對(duì)照品溶液，稀釋后在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各蟾毒內(nèi)酯線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得偽異沙蟾毒精、日蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾蜍精、蟾毒它靈、蟾毒靈、酯蟾毒配基、華蟾酥毒基峰面積RSD分別為0.99%、1.97%、2.41%、1.33%、1.00%、0.88%、1.31%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、10、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得偽異沙蟾毒精、日蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾蜍精、蟾毒它靈、蟾毒靈、酯蟾毒配基、華蟾酥毒基峰面積RSD為1.96%、1.00%、0.64%、1.00%、1.17%、2.29%、1.16%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次蟾皮，平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得偽異沙蟾毒精、日蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾蜍精、蟾毒它靈、蟾毒靈、酯蟾毒配基、華蟾酥毒基含量RSD分別為1.83%、1.73%、2.05%、1.00%、1.52%、2.40%、1.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次蟾皮6份，每份約0.5 g，加入100%水平對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得偽異沙蟾毒精、日蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、酯蟾毒配基、華蟾酥毒基平均加樣回收率分別為99.63%、97.76%、99.12%、100.83%、98.67%、99.39%、97.61%，RSD分別為1.95%、1.58%、1.15%、1.78%、1.92%、2.14%、2.69%。

2.9 相對(duì)校正因子計(jì)算 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣1、2 、5、8 、10、20 μL測(cè)定，平行2次，以華蟾酥毒基為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他6種蟾毒內(nèi)酯的相對(duì)校正因子fk/s，公式為fk/s=fk/fs=(WkAs)/(WsAk)(Wk為其他成分質(zhì)量濃度，Ak為其他成分峰面積，Ws為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度，As為內(nèi)標(biāo)峰面積)[7]，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 各因素對(duì)相對(duì)校正因子的影響 測(cè)定不同體積流量(0.8、0.9、1.0 mL/min)、柱溫(30、35、40 ℃)、儀器(Agilent 1260、Waters e2695)、色譜柱(Agilent 1260、Waters e2695、Agilent ZORBAXSB-C18、Waters Xbridge C18、Diamonsil C18)對(duì)各蟾毒內(nèi)酯相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表3～5，可知均無(wú)明顯影響(RSD<3%)。

2.11 色譜峰定位 各蟾毒內(nèi)酯在不同色譜儀、色譜柱上相對(duì)保留時(shí)間的差異較小，RSD均小于2.28%，見(jiàn)表6。

表3 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響

表4 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響

表5 不同儀器與色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

表6 相對(duì)校正因子保留時(shí)間

2.12 樣品含量測(cè)定 取6批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，再采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表7，可知2種方法所得結(jié)果接近。

3 討論

3.1 色譜柱選擇 蟾皮中蟾毒內(nèi)酯含量較低，為了提高檢測(cè)準(zhǔn)確度，需要較大的進(jìn)樣體積。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(3.0 mm×150 mm, 2.7 μm)(短柱)下各蟾毒內(nèi)酯色譜峰出現(xiàn)前延，可能是其載樣量較小所致，而在Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)(長(zhǎng)柱)下未出現(xiàn)上述現(xiàn)象，峰形良好，故選擇其開(kāi)展后續(xù)研究。

3.2 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)以乙腈[10]為有機(jī)相，對(duì)甲酸[11]、乙酸[12]、磷酸二氫鉀[13-14]、磷酸[15]、純水[16]等無(wú)機(jī)相進(jìn)行了考察。結(jié)果，以乙腈-0.1%甲酸洗脫時(shí)各蟾毒內(nèi)酯色譜峰峰形良好，均在40 min前即出峰，效率高，分離度理想。

3.3 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)以各蟾毒內(nèi)酯提取率為考察指標(biāo)，固定甲醇為提取溶液，考察了不同提取方法(加熱回流、超聲[17-18])、料液比(1∶20、1∶50、1∶100)、提取時(shí)間(30、60、90 min[19-20])。最終，選擇料液比1∶50，加熱回流提取60 min后濃縮作為供試品溶液制備方法。

表7 各蟾毒內(nèi)酯含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n=2)

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定蟾皮中華蟾酥毒基、日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、酯蟾毒配基、遠(yuǎn)華蟾蜍精、偽異沙蟾毒精7種蟾毒內(nèi)酯的含量，通過(guò)精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)，以及相對(duì)校正因子在不同柱溫、體積流量、儀器、色譜柱下的耐用性，驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性和可行性，可為確保該藥材質(zhì)量穩(wěn)定提供依據(jù)。