云 莉，倪雅麗

（海南省第二人民醫(yī)院 藥學(xué)部，海南 五指山市 572299）

齲齒是一種慢性進(jìn)行性破壞性疾病，是由于口腔內(nèi)共生菌和病原菌之間的生態(tài)失調(diào)而引起的。牙齒形成生物被膜（牙菌斑）后，牙齒殘留的碳水化合物和糖經(jīng)生物被膜內(nèi)的細(xì)菌分解產(chǎn)生酸，導(dǎo)致牙齒表面的牙釉質(zhì)脫落。生物被膜是由微生物群落在牙齒表面形成的生態(tài)環(huán)境，由細(xì)菌進(jìn)行代謝產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、多糖和核酸組成的胞外聚合物（EPS）基質(zhì)構(gòu)成[1?2]。 變異鏈球菌(Streptococcus mutans)是口腔中常見(jiàn)的一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，能引起口腔內(nèi)微生物共生生態(tài)系統(tǒng)的失調(diào)。因此，變異鏈球菌也被認(rèn)為是口腔內(nèi)微生物形成生物被膜緊密相關(guān)的細(xì)菌之一[3]。變異鏈球菌通過(guò)復(fù)雜的生命活動(dòng)定植于牙齒表面并形成生物被膜[4?5]。變異鏈球菌可以攝取口腔內(nèi)殘存的各種碳水化合物進(jìn)行代謝活動(dòng)，產(chǎn)生有機(jī)酸不斷腐蝕口腔牙齒，導(dǎo)致齲齒的形成。變異鏈球菌代謝產(chǎn)酸是形成生物被膜中主要的毒力因素之一[6?7]。生物被膜表型在生理和功能上與浮游細(xì)菌有很大不同，生物被膜中的細(xì)菌表現(xiàn)出較低的代謝活性和生理機(jī)能，生物被膜結(jié)構(gòu)可以作為細(xì)菌的物理屏障，限制抗生素滲透到生物被膜的深層。因此，在生物被膜中生長(zhǎng)的細(xì)菌會(huì)增加其對(duì)抗生素的耐受性[8?9]。由于抗生素的濫用，導(dǎo)致常規(guī)療法下細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性迅速增加，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新型抗菌劑以抑制生物被膜的形成和降解成熟生物被膜。

近年來(lái)，使用天然植物產(chǎn)品治療口腔疾病日益受到關(guān)注并被廣泛研究[10]。茴香醛（p-methoxybezaldehyde）是廣泛存在的一類天然產(chǎn)物，主要是從茴香、小茴香和大蒜中分離得到，目前已被廣泛用于制藥行業(yè)的抗菌藥物生產(chǎn)[11?12]?！侗静輩R言》中記載，小茴香乃溫中快氣之藥。最近研究結(jié)果表明，小茴香中主要成分之一茴香醛對(duì)許多微生物表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌活性，包括金黃色葡萄球菌、念珠菌和釀酒酵母[13?15]，在化妝品和藥物的制備中也發(fā)揮著重要的作用。張冠楠等[16]的研究結(jié)果表明，茴香醛能改變金黃色葡萄球菌的菌體形態(tài)、細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性；CHE等[17]的研究結(jié)果表明，茴香醛能改變細(xì)菌細(xì)胞壁完整性和細(xì)胞膜通透性發(fā)揮抑菌效果。然而，關(guān)于茴香醛對(duì)口腔致病菌中的變異鏈球菌抗菌活性尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討茴香醛對(duì)口腔致病菌變異鏈球菌的抗菌效果及潛在的作用機(jī)制，以期將茴香醛開(kāi)發(fā)為抗齲齒的天然藥物。

1 材料與方法

1.1 菌種和試劑變異鏈球菌(S. mutans,ATCC25175)購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心；茴香醛（貨號(hào)A108958-5ml，阿拉?。┵?gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司；變異鏈球菌在腦心浸液肉湯(BHI,中國(guó)北京陸橋技術(shù)有限公司）培養(yǎng)基中培養(yǎng)；Live/Dead BacLight Kit試 劑 盒（ThermoFisher，L7012）。

1.2 最低抑制濃度檢測(cè)采用GRENIER等[18]的二倍稀釋法，將128 g·L?1茴香醛溶液和2.56 g·L?1洗必泰溶液稀釋成系列溶液，測(cè)定茴香醛和洗必泰對(duì)變異鏈球菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度 (MBC)。變異鏈球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，無(wú)菌BHI 液體培養(yǎng)基稀釋至2×105cfu·mL?1，取100 μL稀釋菌液加至含有不同濃度茴香醛的96孔板中，使孔中總體積為200 μL，細(xì)菌終濃度1×105cfu·mL?1。菌液+PBS為陰性對(duì)照組，BHI液體培養(yǎng)基+PBS為空白對(duì)照組，洗必泰處理孔為陽(yáng)性對(duì)照組。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察不到混濁度的孔為茴香醛對(duì)變異鏈球菌的最低抑制濃度。

1.3 最小殺菌濃度測(cè)定將1.2實(shí)驗(yàn)組中未出現(xiàn)渾濁度的孔取100 μL涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察平板菌落生長(zhǎng)情況，平板上無(wú)菌落形成視為茴香醛對(duì)變異鏈球菌完全殺滅，此濃度為最低殺菌濃度。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.4 時(shí)間殺菌曲線實(shí)驗(yàn)根據(jù)CHEN等[13]的殺菌動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法，變異鏈球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，無(wú)菌BHI液體培養(yǎng)基稀釋為2×106cfu·mL?1的菌懸液。稀釋菌懸液與不同濃度的茴香醛（終濃度為0.5×MIC，1×MIC和2×MIC）等體積混勻，置于37 ℃恒溫水浴0、10 、20 、30 、40 、60、90 、120、180 min。0.2%洗必泰（CHX）為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌PBS+菌液作為陰性對(duì)照。孵育至指定時(shí)間后，4 ℃下6 000 r·min?1離心10 min，棄上清液，使用無(wú)菌BHI重懸，根據(jù)需要稀釋10倍，取50 μL涂布于無(wú)菌BHI固體培養(yǎng)基上，在37 ℃ 溫育24 h后計(jì)算細(xì)菌菌落。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并取平均值。

1.5 細(xì)胞膜完整性實(shí)驗(yàn)

1.5.1 DNA 和 RNA泄露檢測(cè)參考WANG等[19]的方法，通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌核酸的釋放量判斷細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。將變異鏈球菌在37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，無(wú)菌PBS稀釋至2×108cfu·mL?1，分別以終濃度1 ×，2×和4× MIC的茴香醛處理，細(xì)菌終濃度為1×108cfu·mL?1?？瞻讓?duì)照組以PBS處理。37 ℃下孵育0、1、2和4 h后, 4 ℃下6 000 r·min?1離心10 min。取上清液，OD260下測(cè)定吸光值。在進(jìn)行DNA和RNA實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，采用平板涂布法檢測(cè)活細(xì)菌數(shù)目，方法同“1.4 時(shí)間殺菌曲線實(shí)驗(yàn)”平板涂布部分，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并取平均值。

1.5.2 對(duì)細(xì)菌可溶性蛋白質(zhì)泄露的影響細(xì)胞完整性可以通過(guò)測(cè)定上清液中細(xì)菌蛋白質(zhì)的釋放量來(lái)確定，上清液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定參考BRADFORD等[19]實(shí)驗(yàn)方法。變異鏈球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（濃 度 為1× 108cfu·mL?1）用 茴 香 醛（1×MIC和2×MIC）處理。以PBS處理為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組和處理組均在37 ℃下孵育0、1、2和4 h，4 ℃下2 500 r·min?1離心5 min，取上清液，OD595下測(cè)定吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并取平均值。

1.5.3 激光共聚焦掃描顯微鏡實(shí)驗(yàn)參考鐘亨任等[20]的方法，通過(guò)Live/Dead BacLight Kit試劑盒檢測(cè)變異鏈球菌細(xì)胞膜的完整性。將變異鏈球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)PBS稀釋至2×108cfu·mL?1。用500 μL的茴香醛（終濃度為1×MIC，2×MIC或4×MIC）與等體積的稀釋菌液在室溫下共同孵育60 min。等體積的異丙醇和無(wú)菌0.9%NaCl處理稀釋菌液分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。離心收集變異鏈球菌，并與Live/Dead BacLight Kit試劑盒在避光條件下孵育15 min。孵育后離心去除殘余熒光試劑，通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM，Leica，TCS-Sp8）觀察細(xì)菌。通過(guò)BioFilmAnalyzer v.1.0軟件計(jì)算細(xì)胞活力。

1.6 茴香醛抑制變異鏈球菌的生物被膜活性測(cè)定參考HE等[21]測(cè)定茴香醛抑制變異鏈球菌形成生物被膜的活性。將變異鏈球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，含3%蔗糖的無(wú)菌BHI 液體培養(yǎng)基稀釋至2×106cfu·mL?1備用。將變異鏈球菌稀釋液接種到96孔板上，茴香醛的終濃度分別為0.5×MIC，1×MIC和 2×MIC，37℃下培養(yǎng)24 h。以PBS (pH 7.2) 作為空白對(duì)照。變異鏈球菌形成生物被膜通過(guò)結(jié)晶紫測(cè)定。最小生物被膜抑制濃度（MBIC50）定義為至少抑制細(xì)菌50%生物被膜形成時(shí)的最低茴香醛濃度。

1.7 生物被膜清除活性測(cè)定將變異鏈球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，含 3% 蔗糖的無(wú)菌BHI稀釋至1×106cfu·mL?1備用。將200 μL稀釋菌液接種至96孔板中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，輕輕將上清液去除，并取200 μL無(wú)菌液體培養(yǎng)基稀釋的茴香醛（終濃度0.5×MIC，1×MIC和 2× MIC）加至各實(shí)驗(yàn)孔中。在37 ℃ 下孵育24 h，無(wú)菌 PBS (pH7.2) 用作空白對(duì)照，采用結(jié)晶紫法定量方法測(cè)定生物被膜的清除活性。

1.8 細(xì)菌表面疏水性測(cè)定變異鏈球菌表面疏水性變化采用微生物粘著碳烴化合物法進(jìn)行測(cè)定。在37 ℃有氧條件下用相同濃度茴香醛（0.5×MIC，1MIC×和 2× MIC）分別孵育變異鏈球菌0或30 min后離心，均用無(wú)菌PBS洗滌2次，并重懸于相同的緩沖液中。在550 nm處測(cè)量吸光度（記錄為OD1），加入 20% (v/v) 二甲苯后劇烈搖動(dòng)試管，將混合物靜置直至水相與有機(jī)相分離，在550 nm處測(cè)量水相的吸光度(記錄為OD2)。疏水性百分比由下式計(jì)算：H= (OD1?OD2)/OD2×100%。使用0 min (H1)和30 min (H2)值之間的差異確定最終疏水性。

1.9RNA提取和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)采用RT-qPCR方法評(píng)估茴香醛對(duì)變異鏈球菌毒力基因表達(dá)的影響。在37 ℃下將變異鏈球菌用不同濃度的茴香醛(0.25×MIC和0.5×MIC)孵育8 h，收集后按照Trizol?試劑(Invitrogen, CA, USA)說(shuō)明進(jìn)行總RNA 提取。將純化的 RNA 溶解于20 μL DEPC水中，并在?80 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。cDNA合成試劑盒（NOVA, CA,中國(guó)）用于合成 cDNA，茴香醛對(duì)變異鏈球菌gtf基因 (gtfB,gtfC和gtfD) 表達(dá)的影響通過(guò)qRT-PCR測(cè)定，引物如表1所示。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 茴香醛對(duì)變異鏈球菌的抑菌活性茴香醛的對(duì)變異鏈球菌的抑菌活性通過(guò)測(cè)定MIC值進(jìn)行定性和定量評(píng)估，洗必泰用作陽(yáng)性對(duì)照，以確定茴香醛的抑菌作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茴香醛對(duì)變異鏈球菌的MIC為4 g·L?1，MBC為8 g·L?1, 洗必泰對(duì)變異鏈球菌的MIC為0.005 g·L?1，MBC為0.01 g·L?1。說(shuō)明茴香醛對(duì)變異鏈球菌具有較好的抑菌活性。

2.2 茴香醛對(duì)變異鏈球菌的時(shí)間殺菌曲線0.5×MIC、1×MIC和2×MIC的茴香醛對(duì)變異鏈球菌的時(shí)間殺菌曲線如圖1所示。0.2%洗必泰（CHX）在處理10 min后可完全殺死細(xì)菌，空白對(duì)照組中顯示細(xì)菌數(shù)目快速增加，而經(jīng)不同濃度的茴香醛干預(yù)后，作用0～10 min后能有效抑制細(xì)菌，在2×MIC濃度下作用30 min后可快速殺死細(xì)菌，即使在0.5×MIC的濃度下仍然能夠抑制細(xì)菌的增長(zhǎng)，呈現(xiàn)出濃度依賴性和時(shí)間依賴性的殺菌作用。

圖1 茴香醛對(duì)變異鏈球菌的時(shí)間殺菌曲線

2.3 細(xì)胞膜完整性檢測(cè)

2.3.1 DNA和 RNA泄露檢測(cè)通過(guò)測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液中細(xì)菌的核酸泄漏量，研究茴香醛能否靶向作用于變異鏈球菌的細(xì)胞膜。通常情況下，大分子物質(zhì)（包括DNA和RNA）不能透過(guò)細(xì)菌完整的細(xì)胞膜。然而，一旦細(xì)菌細(xì)菌膜的完整性遭到破壞，大分子物質(zhì)就會(huì)泄漏到細(xì)菌外環(huán)境中。圖2結(jié)果表明，當(dāng)變異鏈球菌用茴香醛處理時(shí)，隨著茴香醛濃度的增加，細(xì)菌培養(yǎng)液在260 nm處的吸光值逐漸增加，表明細(xì)胞膜損傷程度和細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)菌的DNA和RNA不斷泄漏。相比之下，空白對(duì)照組的吸光度隨著孵育時(shí)間的增加而略有變化，這是細(xì)菌進(jìn)行生命活動(dòng)而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明，隨著茴香醛濃度的增加，對(duì)變異鏈球菌的細(xì)胞膜造成損傷的程度和細(xì)胞膜通透性也在加大，導(dǎo)致大分子（DNA和RNA）外流。

2.3.2 細(xì)菌蛋白質(zhì)泄露檢測(cè)如圖2-B所示，與空白對(duì)照組相比，以不同濃度的茴香醛處理變異鏈球菌后，菌液中可溶性蛋白質(zhì)含量顯著增加。2×MIC和4×MIC的茴香醛干預(yù)細(xì)菌1 h后，胞外可溶性蛋白質(zhì)含量急劇增加，作用于3 h后胞外可溶性蛋白質(zhì)含量整體趨于平穩(wěn)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與2.3.1中茴香醛對(duì)變異鏈球菌胞外核酸泄漏的影響結(jié)果相似，進(jìn)一步表明茴香醛可以改變細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，隨著茴香醛濃度的增加細(xì)菌細(xì)胞膜完整性損傷程度也在加大，引起細(xì)菌內(nèi)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)泄漏至細(xì)胞外。細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性遭受損傷，干擾了細(xì)菌的正常生理活動(dòng)，進(jìn)而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，甚至引起細(xì)菌死亡。

圖2 茴香醛對(duì)變異鏈球菌核酸（A）、可溶性蛋白質(zhì)泄漏（B）和活菌數(shù)目（C）的影響

2.3.3 激光共聚焦掃描顯微鏡實(shí)驗(yàn)茴香醛對(duì)變異鏈球菌細(xì)胞膜完整性的影響通過(guò)使用LIVE/DEADBacLight試劑盒檢測(cè)（圖3）。與陰性對(duì)照（圖3-A）和陽(yáng)性對(duì)照（圖3-B）相比，不同濃度的茴香醛均能誘導(dǎo)變異鏈球菌的細(xì)胞膜完整性發(fā)生變化。用1×MIC茴香醛處理變異鏈球菌時(shí)（圖3-C），細(xì)菌被染成橙色，表明茴香醛在該濃度下處理細(xì)菌后完整的細(xì)胞膜已經(jīng)開(kāi)始發(fā)生變化。當(dāng)茴香醛濃度增加至2×MIC和4×MIC時(shí)（圖3-D，E），細(xì)菌均變成紅色，表明細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)嚴(yán)重破壞。通過(guò) BioFilmAnalyzer 計(jì)算細(xì)菌活力（圖3-F）,當(dāng)變異鏈球菌在1×108cfu·mL?1的數(shù)量下，2×MIC茴香醛的濃度處理時(shí)，大部分的細(xì)菌均能被有效抑制。

圖3 茴香醛對(duì)變異鏈球菌細(xì)胞膜完整性的影響

2.3.4 抑制生物被膜活性通過(guò)結(jié)晶紫法測(cè)定茴香醛對(duì)變異鏈球菌形成生物被膜的抑制活性和形成生物被膜后的清除活性。如圖4-A中所示，茴香醛在0.5×MIC，1×MIC和2×MIC濃度下均可有效抑制變異鏈球菌的形成和清除成熟生物被膜。如圖4-B所示，茴香醛在0.5×MIC 濃度下對(duì)變異鏈球菌形成生物被膜初始附著量為45%～55%。與空白對(duì)照相比，變異鏈球菌預(yù)先鋪板培養(yǎng)24 h后，茴香醛在1× MIC下對(duì)變異鏈球菌生物被膜降解至75%～80%，在 2×MIC 時(shí)生物被膜降解至60%～70%。結(jié)果表明，茴香醛能有效抑制變異鏈球菌形成生物被膜，也能有效降解成熟生物被膜。

圖4 茴香醛對(duì)變異鏈球菌生物被膜的影響

2.3.5 細(xì)菌表面疏水性的影響通過(guò)檢測(cè)變異鏈球菌與碳?xì)浠衔锏恼掣桨俜直却_定細(xì)菌表面的疏水性。圖5結(jié)果表明，茴香醛增加了變異鏈球菌的表面疏水性。不同濃度茴香醛(0.5×MIC，1×MIC和2×MIC)處理后的變異鏈球菌表面疏水率分別為（12.35±0.52)%、(14.68±0.44)%和(17.26±0.31)%，顯著高于對(duì)照組（6.37±0.13）%。

圖5 茴香醛對(duì)變異鏈球菌表面疏水性的影響

2.3.6 茴香醛對(duì)變異鏈球菌基因表達(dá)的影響茴香醛對(duì)變異鏈球菌生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)的影響如圖6所示，結(jié)果表明，茴香醛在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)影響變異鏈球菌生物被膜形成。gtfB和gtfC基因是合成細(xì)菌胞外多糖中的非水溶性胞外多糖的基因，而gtfD是合成水溶性的細(xì)胞外多糖的基因。不同濃度的茴香醛處理變異鏈球菌后gtfB、gtfC和gtfD顯著下調(diào)（P< 0.05），當(dāng)0.5×MIC的茴香醛處理變異鏈球菌時(shí)，gtfB、gtfC和gtfD表達(dá)水平均低于0.8，表明亞濃度的茴香醛能顯著下調(diào)gtfs的表達(dá)，抑制細(xì)菌胞外多糖的產(chǎn)生，干擾細(xì)菌生物被膜的形成。

圖6 茴香醛對(duì)變異鏈球菌基因表達(dá)的影響

3 討 論

口腔疾病一直都是主要的健康問(wèn)題之一，其中齲齒和牙周病是危害口腔健康的重要疾病。雖然目前醫(yī)藥市場(chǎng)上已有甲硝唑、替硝唑和奧硝唑等幾種厭氧菌拮抗劑，但由于口腔環(huán)境下活性較低、劑量的使用和各種副作用導(dǎo)致此類藥物的使用范圍受到限制[14]。因此，急需尋找替代性和功能性更強(qiáng)的抗齲齒藥物，天然植物來(lái)源藥物由于具有強(qiáng)效抗菌特性和較小的副作用而成為一個(gè)重要的研究方向[22]。

茴香醛主要從茴香中分離出來(lái)，對(duì)許多酵母菌和霉菌菌株也表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗真菌活性[23?24]。SHREAZ 等[11]研究結(jié)果表明茴香醛對(duì)念珠菌的MIC 值為 250 ～ 600 μg·mL?1。YU等[15]發(fā)現(xiàn)茴香醛對(duì)釀酒酵母和金黃色葡萄球菌的 MIC分別為256 μg·mL?1和 2～4 g·L?1。在本研究中，筆者觀察到茴香醛對(duì)變異鏈球菌具有很強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)變異鏈球菌的MIC 和 MBC 值分別為4 、8 g·L?1。茴香醛在2×MIC 濃度下30 min左右即可殺死所有細(xì)菌，即使在0.5×MIC 的濃度下仍然能夠抑制細(xì)菌的增長(zhǎng)。

細(xì)菌細(xì)胞膜在保護(hù)細(xì)菌內(nèi)大分子物質(zhì)和維持細(xì)胞活力方面起著至關(guān)重要的作用，細(xì)菌細(xì)胞膜完整性缺失將導(dǎo)致細(xì)菌死亡[16,21]。許多研究表明，從棕櫚樹(shù)、茴香、大蒜、茶樹(shù)、百里香和八角中的提取物可以通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜完整性，抑制微生物的生長(zhǎng)[25?28]。1×MIC的茴香醛處理變異鏈球菌60 min后，細(xì)菌的細(xì)胞膜完整性發(fā)生了很大變化，細(xì)胞膜內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)均發(fā)生不同程度的泄漏，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

細(xì)菌生物被膜的形成可以分為幾個(gè)過(guò)程，包括最初粘附在固體表面上，可逆附著在固體表面，產(chǎn)生胞外聚合物（EPS），不可逆附著，最終發(fā)展為復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)晶紫法測(cè)定表明，隨著茴香醛濃度的增加，茴香醛在初始粘附階段和成熟階段更有效地減弱了變異鏈球菌生物被膜的形成，在高濃度下亦能降解成熟生物被膜。EPS由葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (GTF) 合成，在細(xì)菌形成生物被膜方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中g(shù)tfB、gtfC催化蔗糖合成α-1,3和α-1,6鍵連接的非水溶性多糖，這有助于變異鏈球菌產(chǎn)生EPS基質(zhì)并促進(jìn)細(xì)菌聚集在穩(wěn)定的生物被膜中，是斑塊形成和細(xì)菌生物被膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要物質(zhì)。gtfD催化合成含有α-1,6鍵連接的水溶性多糖,促進(jìn)細(xì)菌生物被膜表面與唾液蛋白相結(jié)合[28,29]。石榴皮原花青素能有效抑制變異鏈球菌生物被膜的形成和其毒力基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)[29]。在生物被膜形成過(guò)程中，茴香醛在亞濃度范圍內(nèi)能有效下調(diào)gtfB、gtfC和gtfD的表達(dá)。gtfs基因在變異鏈球菌生物被膜中的表達(dá)受到抑制，可能會(huì)減少生物被膜中葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的數(shù)量，從而減少 EPSs 的產(chǎn)生，抑制生物被膜的形成。變異鏈球菌的產(chǎn)酸能力是變異鏈球菌的關(guān)鍵生理因素，作用于牙齒表面的脫礦質(zhì)促進(jìn)齲齒形成。積雪草酸和茶黃素對(duì)已形成的變異鏈球菌的生物被膜具有顯著的抑制活性以及殺菌作用，并能降低其產(chǎn)酸和產(chǎn)EPS等致齲毒力[30?31]。本研究結(jié)果表明，隨著茴香醛濃度的增加，pH下降的初始速率逐漸降低，茴香醛抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸并防止牙齒脫礦，這可能是由于抑制了用于產(chǎn)酸的糖酵解酶。

4 結(jié) 論

茴香醛對(duì)變異鏈球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，茴香醛抑制變異鏈球菌的機(jī)制之一可能與細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的破壞有關(guān)，可能通過(guò)抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (GTF) 合成進(jìn)而抑制變異鏈球菌形成生物被膜。鑒于目前茴香醛在藥物合成、化妝品、食品添加劑等領(lǐng)域的成熟應(yīng)用，以及本研究中茴香醛對(duì)變異鏈球菌的抑菌活性和抑制生物被膜活性，未來(lái)有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為抗齲齒藥物或口腔保健品。