王 潔，王蓓蓓，尚方劍，蘇蘭茜，趙少官,3，洪 珊，趙青云

（1. 海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，?？?570228; 2. 海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點實驗室，海南 萬寧 517533; 3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，鄭州 450000）

香草蘭（Vanilla planifoliaAndrews）屬多年生藤本熱帶經(jīng)濟作物， 享有“香料之王”的譽稱，是制作各種高端食品和化妝品等的配香原料。香草蘭用途廣泛，附加值高，除制作香料外，還具健胃、補腎、軟化血管、促進腦功能改善等藥用價值，在國際市場上供不應(yīng)求[1]。香草蘭經(jīng)連續(xù)多年種植后，其根際土壤中病原真菌尖孢鐮刀菌相對豐度增加；其根際土壤中與枯萎病病情指數(shù)呈顯著負相關(guān)的根際促生菌（PGPR）如芽孢桿菌、木霉、慢生根瘤菌等相對豐度顯著降低[2?3]。香草蘭經(jīng)連續(xù)種植后，香草蘭植株生長受抑，土傳枯萎病高發(fā)，出現(xiàn)連作生物障礙[2?3]。根系分泌物能夠影響植物根際微生物群落組成[4]。植株根系分泌的酚酸類物質(zhì)是引起根系自毒作用的主要物質(zhì)，其中酚酸類物質(zhì)的可溶解部分和可逆吸附的組分是與自毒作用直接相關(guān)的[5?6]。在連續(xù)種植的花生[7]、甜瓜[8]、煙草[9]、黃瓜[10]的根系分泌物中均檢測到酚酸類物質(zhì)，如苯甲酸、水楊酸、對羥基苯甲酸等。酚酸類物質(zhì)對種子萌發(fā)、植株生長具有顯著的抑制作用[11]。西瓜根系分泌的酚酸類物質(zhì)香草酸、水楊酸和對羥基苯甲酸可促進尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)和菌絲生長[12]?；ㄉ捣置谖镏械谋郊姿岜粏为毺砑拥礁H土壤中時增加了花生根際細菌和真菌群落的豐度，降低了真菌與細菌的比例值，增加了病原真菌尖孢鐮刀菌的豐度，使花生的根莖腐病的發(fā)病率升高[13]。利用有益微生物降解根系分泌的自毒物質(zhì)，可降低或消除根系化感物質(zhì)對土壤及植株的不利影響[14]。劉云露[15]從黃連種植園土壤中分離到能夠降解阿魏酸的青霉菌(Penicillium daleae)，該菌株培養(yǎng)72 h后對阿魏酸的降解率達87.5%。在花生根際土壤中篩選到1株能夠降解多種酚酸的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)5 d時，對酚酸類自毒物質(zhì)如對羥基苯甲酸、肉桂酸、丁香酸、苯甲酸、阿魏酸等的降解率分別為99.85%、17.44%、90.04%、98. 69%、38.89%[16]。孫秀等[17]在黃瓜根際土壤中也篩選到了能夠降解肉桂酸的高效菌株，其中，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)在12 h內(nèi)對肉桂酸的降解率達到了99.35%；黑曲霉(Aspergillus niger)在72 h內(nèi)對肉桂酸的降解率達到了99.62%。目前，國內(nèi)外對關(guān)于自毒物質(zhì)降解菌的研究主要集中在大宗經(jīng)濟作物上，而較少關(guān)注熱帶經(jīng)濟作物，尤其在多年生熱帶香料飲料作物上鮮有研究報道。

本課題組前期研究表明，苯甲酸、水楊酸和對羥基苯甲酸是香草蘭植株根系分泌的主要自毒物質(zhì)。本研究從香草蘭連作園中篩選到了可降解這3種自毒物質(zhì)的微生物菌株，通過室內(nèi)模擬實驗研究其降解能力及其對病原菌尖孢鐮刀菌的抑制作用，并對其進行了16S rRNA及ITS分子鑒定，為在生產(chǎn)上利用有益微生物緩解香草蘭連作生物障礙提供理論基礎(chǔ)和菌種資源儲備。

1 材料與方法

1.1 供試樣品材料土壤樣品采集：選取海南省萬寧市興隆鎮(zhèn)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所香草蘭種植園植株，參考XIONG等[2]的方法，采集植株根際土壤，帶回實驗室4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

供試病原菌：香草蘭枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysporumsp. vanillae)由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所植物保護研究室提供。

標準品：苯甲酸、水楊酸、對羥基苯甲酸均購自上海源葉生物有限公司。

1.2 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂粉20 g，pH 7.0， 115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，備用。

LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

無機鹽培養(yǎng)基：NH4NO31.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；(NH4)2SO40.5 g；KH2PO40.5 g； NaCl 0.5 g；K2HPO41.5 g，蒸餾水1 000 mL；pH 7.0；121 ℃滅菌20 min，備用。

1.3 香草蘭根際土壤拮抗真菌、細菌分離純化稱取5 g香草蘭根際土壤，參照王輝等[18]的方法制備土壤懸濁液，置于28 ℃搖床振蕩30 min，靜置30 min，取土壤懸濁液上清液。對土壤懸濁液上清液進行梯度稀釋，取10?3、10?4和10?5稀釋液，分別吸取100 μL，涂布至PDA培養(yǎng)皿上；取10?4、10?5和10?6稀釋液分別吸取100 μL，涂布至LB培養(yǎng)皿上。置28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出明顯菌落后，觀察菌落形態(tài)，分別挑選不同形態(tài)、顏色的單菌落至PDA和LB培養(yǎng)皿中進行純化。連續(xù)純化5次后挑取單菌落接種至PDA、LB培養(yǎng)基斜面，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 酚酸類物質(zhì)降解率測定

1.4.1 菌懸液制備真菌菌懸液制備：取保存的真菌斜面，活化后挑取菌絲塊，接種至PDA培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3～5 d，用接種鏟刮取菌絲塊，轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的無機鹽液體培養(yǎng)基中，180 r· min?1搖床振蕩30 min，制得孢子懸液，調(diào)節(jié)孢子密度至107cfu·mL?1，備用。細菌菌懸液制備：取保存的細菌斜面，將菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，置恒溫搖床160 r·min?1振蕩培養(yǎng)18～20 h，菌液經(jīng)8 500 r·min?1離心10 min，倒掉上清液，收集菌體，用無菌水重懸，備用，

1.4.2 酚酸類物質(zhì)降解率測定取上述已制備的菌懸液2 mL，接種至100 mL含2.0 mmol· L?1酚酸無機鹽液體培養(yǎng)基中，160 r·min?130 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，分別于 0、12、24、36、48、60、72 h取真菌、細菌酚酸降解液，以無菌水為空白對照，采用紫外分光光度計法測定酚酸含量，根據(jù)標準曲線計算酚酸濃度。

標準曲線：稱取對羥基苯甲酸和苯甲酸0、25、50、75、100 mg，水 楊酸0、50、100、150、200 mg，定容至100 mL，測量OD280吸光度，并制作標準曲線，得到對羥基苯甲酸的標準曲線y=0.086 2x? 3.449 1，R2= 0.999 4；得到苯甲酸的標準曲線y= 0.300 3x? 0.586 2，R2= 0.999 2；得到水楊酸的標準曲線y= 0.224 3x? 0.592 1，R2= 0.999 4。

降解率(DR) =(Cck-Ct)/Cck×100%，

式中，Cck為對照中酚酸剩余量，Ct為處理中酚酸剩余量。

1.5 自毒物質(zhì)降解模擬實驗取100 g香草蘭連作土壤（過2 mm篩，土壤含水量20%）加入到250 mL三角瓶中。在三角瓶中按照10%的比例加入各供試降解菌的菌懸液，調(diào)整各處理最終的土壤含水量為40%。每處理設(shè)置9次重復(fù)，以無菌水為對照，用封口膜覆蓋三角瓶口，在培養(yǎng)箱中30 ℃避光培養(yǎng)7 d，分別于處理后3 、5 、7 d取樣，并測定土壤中自毒物質(zhì)含量。參考LI等[19]的方法萃取土壤中酚酸物質(zhì)，采用高效液相色譜法定量分析土壤中酚酸含量變化。

1.6 酚酸類物質(zhì)降解菌對病原菌尖孢鐮刀菌的抑制作用測定參照ZHAO等[20]的方法檢測可降解酚酸類物質(zhì)菌株對病原菌尖孢鐮刀菌的抑制能力。用接種鏟挑取病原菌尖孢鐮刀菌菌絲塊，置于PDA培養(yǎng)皿培養(yǎng)5 d，用打孔器在病原菌邊緣打取圓形菌絲塊，置于新的PDA培養(yǎng)皿中。用接種針從培養(yǎng)皿上挑取已活化的待測細菌，用打孔器打取已活化的待測真菌，分別置于距離病原菌菌絲塊2 cm處，以只接種病原菌的培養(yǎng)皿為對照，置28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3～5 d。對病原菌的抑制作用采用抑制率表示。

抑菌率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。

1.7 酚酸類自毒物質(zhì)降解菌的分子鑒定采用DNA離心柱型試劑盒（上海派森諾生物技術(shù)有限公司）提取降解菌株DNA，以總DNA為模板，以細菌特異性引物對338F（5′-AATGATACGGCGA CCACCGAG-3′）和806R（5′-GGACTACNVGGGT WTCTAAT-3′）[21]及真菌特異性引物ITS1F（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS2（5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′）[22]對DNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進行PCR擴增。反應(yīng)體系共25 μL：2.5 μL 10×反應(yīng) 緩沖 液，10 μmol·L?1每種 引物，2.5 mmol·L?1dNTP，40 ng模 板 和0.625單 位 的Takara Pyrobest（日 本Takara生 物 技 術(shù) 有 限 公司）。擴增在以下溫度范圍內(nèi)進行：在94 °C初始變性4 min，然后進行35個變性循環(huán)，94 °C持續(xù)30 s，50 ℃退火持續(xù)45 s，72 °C延伸持續(xù)1 min，最后在72 ℃延伸7 min[23]。使用PCR Purification Kit（Axygen Bio，USA）對PCR產(chǎn)物進行純化[24]。ITS和16S rRNA測序工作由上海派森諾生物技術(shù)有限公司完成。根據(jù)測序結(jié)果，利用Genbank中的BLAST軟件對獲得的ITS和16S rRNA序列進行同源性分析，用MEGA7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-joining算法和 JukesCantor模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展次數(shù)設(shè)定為1 000。

1.8 數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行方差分析；采用軟件Microsoft Excel 2010 進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚酸類自毒物質(zhì)降解菌的篩選依據(jù)菌落形態(tài)特征差異，從香草蘭種植園根際土壤中分離挑選出31株真菌、84株細菌。通過紫外分光光度法篩選出6株可降解苯甲酸、水楊酸和對羥基苯甲酸的菌株，分別是BM-5、FD-21、BD-8、ZD-4、ZH-19和ZH-20。由圖1可知在搖瓶培養(yǎng)72 h后，降解菌ZH-20、FD-21和BD-8均對對羥基苯甲酸的降解率超過89%；ZH-19、ZD-4均超過87%；而BM-5達到78.46%。由圖2可知，在搖瓶培養(yǎng)72 h后，降解菌BM-5、FD-21、ZD-4、ZH-19和ZH-20對苯甲酸的降解率超過70%。由圖3可知，在搖瓶培養(yǎng)72 h后，F(xiàn)D-21、BM-5對水楊酸的降解率超過了90%，分別為93.62%和92.56%；ZD-4、BD-8、ZH-19、ZH-20對水楊酸的降解率分別為39.06%、16.91%、6.44%、4.64%。由此可知，這6株菌均可降解酚酸類物質(zhì)苯甲酸、水楊酸和對羥基苯甲酸，其中，在搖瓶培養(yǎng)條件下ZH-20對對羥基苯甲酸的降解能力較強，F(xiàn)D-21對苯甲酸和水楊酸的降解能力均較強。

圖1 6株降解菌降解對羥基苯甲酸的能力

圖2 6株降解菌降解苯甲酸的能力

圖3 6株降解菌降解水楊酸的能力

2.2 在連作土壤條件下菌株降解酚酸類自毒物質(zhì)能力在恒溫培養(yǎng)3 d時，這6株降解菌對連作土壤中的對羥基苯甲酸、水楊酸和苯甲酸均有一定的降解能力，其中，ZH-20和ZH-19對對羥基苯甲酸的降解率超過了50%，對水楊酸的降解率超過了60%；ZH-20、ZH-19和BD-8對苯甲酸的降解率超過了20%（圖4）。在恒溫培養(yǎng)5 d時，F(xiàn)D-21、ZH-19和BD-8對對羥基苯甲酸的降解率約為20%；FD-21對水楊酸的降解率最高，達到了37.11%；ZH-19、BM-5和BD-8對水楊酸的降解率超過了20%，其中，BM-5的降解率達到了27.5%；BD-8對苯甲酸的降解率最高，達到了75.87%；ZH-20、ZH-19和BM-5的降解率超過了30%（圖5）；恒溫培養(yǎng)7 d時，ZD-4和ZH-19對對羥基苯甲酸的降解率超過了80%，其中，ZD-4對水楊酸的降解率最高，達到85.35%；BD-8、ZH-19、ZD-4對苯甲酸的降解率分別為86.52%、73.39%、69.84%（圖6）。

圖4 培養(yǎng)3 d時6株降解菌降解連作土壤中酚酸物質(zhì)能力

圖5 培養(yǎng)5 d時6株降解菌降解連作土壤中酚酸物質(zhì)能力

圖6 培養(yǎng)7 d時6株降解菌降解連作土壤中酚酸物質(zhì)能力

2.3 酚酸類物質(zhì)降解菌對尖孢鐮刀菌的抑制效果平板對峙實驗結(jié)果表明，菌株ZH-20、ZH-19、ZD-4、BM-5對香草蘭枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌都具有極顯著抑制作用，其中菌株ZH-20、ZH-19的抑菌率達到80%以上，顯著高于其他菌株（圖7）。菌株FD-21的抑菌率為46%，顯著高于BD-8，但低于3株細菌ZH-20、ZH-19、ZD-4對尖孢鐮刀菌的抑制效果。

圖7 6株菌對病原真菌尖孢鐮刀菌的抑制率

2.4 酚酸物質(zhì)降解菌分子鑒定6株降解菌經(jīng)16S rRNA和ITS序列測定后，將3株細菌16S rDNA 序列和3株真菌ITS的測序結(jié)果登錄GenBank，并用BLAST與 GenBank中16S rRNA序列和ITS序列進行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，（1）6株降解菌中的3株細菌中，ZD-4與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(MZ712061)的16S rRNA 序列同源性達到99.64% ；ZH-19與炭疽芽孢桿菌Bacillus anthracis（HQ670430）的16S rRNA 序列同源性達到95.83% ；ZH-20與解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens(KY784657)的16S rRNA序列同源性達到93.48% 。（2）6株降解菌中的3株真菌中，BM-5與黃絲曲霉屬Talaromycessp.（MK368459）的 ITS 序列同源性達到99.81% ；菌株FD-21與青霉屬Penicilliumsp.（MN701702）的ITS序列同源性達到99.45% ；菌株BD-8與桔青霉Penicillium citrinum（MT529414）的ITS序列同源性達到99.81% ?；跍y序結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹如圖8所示。

圖8 基于 16SrRNA 和ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

酚酸是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，通過莽草酸-苯丙烷途徑產(chǎn)生，是木質(zhì)素和細胞壁聚合物的分解產(chǎn)物[25]。這些化合物可以在植物-微生物和植物-植物的相互作用中發(fā)揮多功能作用[26]。本研究結(jié)果表明，從香草蘭根際土壤中篩選到的6株菌對苯甲酸、水楊酸和對羥基苯甲酸均有較強的降解能力，可作為根系酚酸類自毒物質(zhì)降解菌應(yīng)用于實際生產(chǎn)中，以消減自毒物質(zhì)對香草蘭根系生長及根際微生物群落裝配產(chǎn)生的負面影響[27]。張春楊等[16]在花生根際土壤中篩選出木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidansHJ-2) 和硝基還原假單胞菌(Pseudomonas nitroreducensHJ-3)，均能夠有效降解苯甲酸，同時這2株菌能夠降解苯乙酮、硬脂酸、 棕櫚酸、乳酸、3，5-二甲基苯甲醛和丙三醇等化感物質(zhì)。何志剛等[28]在番茄的根際土壤中篩選出芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鏈霉菌屬吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、納西桿菌屬耐堿納西桿菌(Naxibacter alkalitolerans)，對苯甲酸、對羥基苯甲酸、水楊酸、肉桂酸以及香草酸都有一定的降解作用。在本研究中FD-21青霉菌（Penicilliumsp.）在搖瓶實驗中降解對羥基苯甲酸、水楊酸和苯甲酸的能力均較好，分別達到89.85%、93.62%和78.87%，但在連作土壤中對對羥基苯甲酸、水楊酸和苯甲酸降解率分別為34.2%、67.28%和43.5%，這可能是在土壤環(huán)境條件下微生物的生存空間較復(fù)雜，受其在土壤中利用不同碳氮源能力及定殖能力影響所致[29]。

XIONG等[30]的研究結(jié)果表明，連作香草蘭根際土壤真菌多樣性和植株發(fā)病率呈顯著負相關(guān)，抑病型香草蘭園根際土壤具有較高的真菌多樣性，更易富集與植株健康密切相關(guān)的芽孢桿菌和青霉等有益微生物。本研究篩選出了對尖孢鐮刀菌有顯著抑制作用及可降解根系自毒物質(zhì)酚酸的復(fù)合型功能菌株，它們?yōu)閆D-4枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、ZH-19炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）、ZH-20解 淀 粉 芽 孢 桿 菌(Bacillus amyloliquefaciens)、BM-5黃 絲 曲 霉（Talaromycessp.）、FD-21青 霉（Penicilliumsp.）、BD-8桔 青 霉（Penicillium citrinum）。文獻[31]的研究結(jié)果表明，在改良具有連作障礙的蘋果園土壤，單施有機肥土壤中黃絲曲霉屬明顯升高，推測黃絲曲霉可能有益于蘋果植株健康生長，為連作土壤改良提供了新思路[31]。另外，黃絲曲霉屬可作為土壤高效解磷菌應(yīng)用于實際生產(chǎn)中[18]。文獻[32]的研究結(jié)果表明，在香草蘭與胡椒輪作模式中，香草蘭根際土壤中與植株密切相關(guān)的有益菌青霉的豐度顯著增加[32]。在本研究中發(fā)現(xiàn)青霉FD-21降解3種酚酸自毒物質(zhì)的能力明顯優(yōu)于其他2株真菌，且對尖孢鐮刀菌有顯著抑制作用。

近年來，我國高度重視研發(fā)農(nóng)業(yè)綠色投入品，助力為實現(xiàn)我國農(nóng)業(yè)綠色優(yōu)質(zhì)發(fā)展，更趨向重視對農(nóng)業(yè)綠色投入品的研發(fā)與應(yīng)用。隨著對高效功能型菌種資源的不斷挖掘，多種有益功能微生物應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，利用復(fù)合型高效功能微生物降解自毒物質(zhì)、抑制土傳病害，是一種緩解作物連作生物障礙行之有效的方法。本研究篩選到了對苯甲酸、水楊酸和對羥基苯甲酸有顯著降解作用且可抑制土傳病原真菌尖孢鐮刀菌的復(fù)合型功能微生物菌株枯草芽孢桿菌、黃絲曲霉等，豐富了酚酸類自毒物質(zhì)降解菌及生防菌菌種資源，對緩解香草蘭連作生物障礙提供了新的菌種資源。下一步，筆者擬基于生態(tài)功能互補及生物多樣性原理，組合高效互作菌群，并研究適宜高效菌群生長擴繁的不同營養(yǎng)載體組合（益生源），研制高效復(fù)合菌劑，為調(diào)控香草蘭連作土壤，有效阻控連作生物障礙提供支撐，同時，也為緩解其他經(jīng)濟作物連作生物障礙提供參考。