劉芝妤，李增平，張 宇

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228）

大葉紫薇[Lagetstroemia speciosa（L.） Pers.]，又稱(chēng)大花紫薇，原產(chǎn)于亞洲的熱帶地區(qū)，在我國(guó)的海南、廣東、廣西、四川、云南等省均有種植。大葉紫薇具有校高的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值，其提取物具有斂瘡、解毒、涼血止血等功效，同時(shí)，園林綠化種植大葉紫薇移栽成活率極高，全年可觀花的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月[1?2]。2001年，朱愛(ài)萍等[3]對(duì)紫薇的白粉?。║ncinula austruliana）進(jìn)行了生物學(xué)特性和致病性研究。2007年，翁殊斐等[4]對(duì)大花紫薇進(jìn)行病蟲(chóng)害檢索表的編制與綜合防治，主要報(bào)道了大葉紫薇的斑點(diǎn)?。≒hyllosticta lagerstroemiae）以 及 炭 疽 病（Colletotrichum gloeosporioides）。2009年，吳建民[5]對(duì)大葉紫薇褐斑?。˙rown spot）和煤污病（Sooty mold）的癥狀、發(fā)生規(guī)律以及防治方法進(jìn)行了報(bào)道。炭疽菌引起的植物炭疽病可導(dǎo)致寄主植物出現(xiàn)葉斑、枝枯等癥狀，甚至出現(xiàn)植株枯死。嚴(yán)重的植物炭疽病還可導(dǎo)致在種植產(chǎn)業(yè)上發(fā)生重大的經(jīng)濟(jì)損失。膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是一種常見(jiàn)的引發(fā)多種植物炭疽病的病原真菌，其侵染的寄主種類(lèi)豐富，分布范圍廣，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其包含有多個(gè)復(fù)合種，炭疽病在我國(guó)雖有大量報(bào)道，但對(duì)熱帶林木炭疽病的調(diào)查以及鑒定偏少[6]。目前，只有少量的文獻(xiàn)中提及到大葉紫薇炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌，但是尚未見(jiàn)到大葉紫薇炭疽病的致病性測(cè)定、分子鑒定及生物學(xué)特性等方面的詳細(xì)報(bào)道。因此，筆者在海南發(fā)現(xiàn)的大葉紫薇炭疽病病樹(shù)上采集病葉，并進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)和致病性測(cè)定，同時(shí)采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)手段進(jìn)行病原菌的種類(lèi)鑒定及其生物學(xué)特性研究，旨在進(jìn)一步明確大葉紫薇炭疽病的病原菌種類(lèi)，為后續(xù)研究其發(fā)病規(guī)律及診斷防治等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料大葉紫薇炭疽病病葉，于2020?12?13從海南省?？谑惺兰o(jì)公園發(fā)病的大葉紫薇上采集病葉，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)鏡檢，初步鑒定后分離菌株，并制作病葉標(biāo)本保存，保存于實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基PDA[Potato Dextrose Agar(Medium)]、PSA(Potato Saccharose Agar)、OMA(Oatmeal Agar)、CA(Cellulose Acetate)、CMA(Corn Meal Agar)、Czapek(Czapek Dox Agar)[7?8]。

1.3 試劑及儀器DNA提取試劑盒OMEGA Fungal DNA Kit購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司，2×Taqplus PCR Master Mix購(gòu)自Biosharp公司。攝影生物顯微鏡為日本Olympus BX-51。

1.4 菌株的分離純化采用常規(guī)的組織分離法，將病葉從病健交界處切取5 mm左右的小塊，放入酒精中浸泡10 s后再放入0.1%升汞溶液中浸泡1 min，最后用滅菌水沖洗3次，置于空白培養(yǎng)皿風(fēng)干并放置到PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。28 ℃恒溫黑暗條件下于斜面上保存分離得到的菌株備用。待菌絲生長(zhǎng)到適宜大小，產(chǎn)孢后，再進(jìn)行單孢分離純化，從多個(gè)生長(zhǎng)相同的菌株中選擇生長(zhǎng)良好的菌株，編號(hào)備用（菌株編號(hào)為DYZWTJ001）[9]。

1.5 致病性的測(cè)定將經(jīng)28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d的DYZWTJ001菌株的PDA平板用打孔器打成直徑（d）為5 mm的菌餅。采用刺傷和無(wú)傷接種法，將菌絲面緊貼于經(jīng)表面消毒處理的健康大葉紫薇葉片傷口上。對(duì)照接無(wú)菌的PDA。DYZWTJ001菌株經(jīng)28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后，收集分生孢子，用無(wú)菌水洗脫菌落表面的分生孢子，制成分生孢子濃度為2×106個(gè)·mL?1的懸浮液；將一部分孢子懸浮液滴到經(jīng)表面消毒處理的健康大葉紫薇葉片傷口上，將另一部分孢子懸浮液噴施在無(wú)刺傷的嫩葉上，對(duì)照接無(wú)菌水[10]。將接種好的葉片保濕后放置到（28±0.5）℃的黑暗培養(yǎng)箱中，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，并定期觀察其發(fā)病情況，每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定DYZWTJ001菌株培養(yǎng)7 d后，觀察菌落的正、反面顏色及邊緣形狀。挑取培養(yǎng)物用攝影生物顯微鏡對(duì)病原菌的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行拍照、觀察和測(cè)量。觀察分生孢子盤(pán)以及分生孢子，記錄其形態(tài)特征并測(cè)量分生孢子盤(pán)以及分生孢子的大小。

1.7 病原菌的分子鑒定將DYZWTJ001菌株置于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，使用OMEGA Fungal DNA Kit提取其總DNA。采用通用引物ITS[11](ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)、ACT[12](ACT-512F:5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′:ACT-783R:5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′)、GADPH[13](GDF:5′-GCCGTCAACGACCCCTTCAT TGA-3′;GDR:5′-GGGTGGAGTCGTACTTGAGC ATGT-3′)和 CHS[12](CHS-97F:5′-TGGGGCAAGG ATGCTTGGTTGAAG-3′;CHS-354R:5′-TGGAAG AACCATCTGTGAGAGTTG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14?15]。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化、回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將所獲的序列在 NCBI 進(jìn)行Blast比對(duì)，并提交序列。用Sequence Matrix軟 件 進(jìn) 行 序 列 拼 接，使 用MEGA7.0軟件以最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[16]。

1.8DYZWTJ001菌株生物學(xué)特性的測(cè)定選用PDA、PSA、OMA、CA、CMA、Czapek培養(yǎng)基制作平板，用于測(cè)試DYZWTJ001菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)影響。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂10 g、蒸餾水1 000 mL；PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；OMA培養(yǎng)基：燕麥片30 g、蒸餾水1 000 mL、瓊脂20 g，在60 ℃下水浴1 h，雙層紗布過(guò)濾去渣，補(bǔ)足水至1 000 mL，加入瓊脂；CA培養(yǎng)基：新鮮胡蘿卜200 g切成小片，加蒸餾水500 mL，用組織搗碎機(jī)搗碎約40 s，用4層紗布過(guò)濾去渣，補(bǔ)足水至1 000 mL，加入瓊脂13 g；CMA培養(yǎng)基：玉米粉300 g、蒸餾水1 000 mL、瓊脂20 g，在60 ℃下水浴1 h，雙層紗布過(guò)濾去渣，上清液補(bǔ)足水至1 000 mL，加入瓊脂；Czapek培養(yǎng)基：七水硫酸鎂0.5 g、磷酸氫鉀1 g、氯化鉀0.5 g、硝酸鈉2 g、蔗糖30 g、七水硫酸亞鐵0.01 g、水1 000 mL。將菌株DYZWTJ001菌絲塊置于平板中央，在相同溫度（28 ℃）下培養(yǎng)5 d后，使用十字交叉法量取菌落的直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

測(cè)試不同溫度條件下DYZWTJ001菌株生長(zhǎng)的影響。在超凈工作臺(tái)里用直徑0.5 mm打孔器從菌株DYZWTJ001菌落邊緣取菌絲塊，將菌絲塊接種在PDA平板上，分別置于10、15、20、25、28、33、35 ℃共7個(gè)不同溫度條件下進(jìn)行恒溫暗培養(yǎng)，5 d后使用十字交叉法量取其菌落的直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

測(cè)試不同pH值條件下DYZWTJ001菌株生長(zhǎng)的影響。將已滅菌的PDA培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，使用1 mol·L?1的 HCl溶液和1 mol·L?1的NaOH溶液將PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 共12個(gè)梯度后倒平板上，挑取菌株DYZWTJ001菌絲塊置于平板中央，在28 ℃下培養(yǎng)，5 d后使用十字交叉法量取其菌落的直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

測(cè)試不同光照條件下DYZWTJ001菌株生長(zhǎng)的影響。將菌株DYZWTJ001菌絲塊接種于PDA平板中央，在28℃下分別置于光照24 h、黑暗24 h和光照：黑暗=12 h∶12 h條件下培養(yǎng)，5 d后使用十字交叉法量取其菌落的直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.9 數(shù)據(jù)處理利用SAS 8.1軟件和Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s multiple range test進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉紫薇炭疽病的發(fā)病癥狀在海南發(fā)現(xiàn)的大葉紫薇炭疽病主要危害下層老葉。病斑多出現(xiàn)在葉尖和葉緣，葉面上也有少量發(fā)生。發(fā)病初期，在病葉上呈現(xiàn)紅褐色小斑點(diǎn)，邊緣具明顯的亮黃色暈圈，繼而病斑擴(kuò)展為半圓形或不規(guī)則，褐色至灰白色，邊緣具2～5 mm寬的紫紅色或深褐色壞死帶，病斑的外圍出現(xiàn)明顯的亮黃色的暈圈。潮濕條件下，病斑中央輪生小黑點(diǎn)。后期部分老病斑中央組織破裂出現(xiàn)穿孔，重病葉易脫落。

2.2 致病性的測(cè)定大葉紫薇炭疽病的致病性測(cè)定結(jié)果顯示，接種3 d后，滴加分生孢子懸浮液在刺傷部分的老葉和噴施分生孢子懸浮液在無(wú)刺傷的嫩葉的處理均發(fā)?。唤臃N4 d后，使用菌餅刺傷接種的老葉發(fā)病，老葉上未刺傷部分接種菌餅部分全部未發(fā)病，對(duì)照區(qū)域也未出現(xiàn)病變。接種7 d后，觀察到葉片接種部位出現(xiàn)橘紅色分生孢子團(tuán)（圖1）。從接種發(fā)病部位再分離獲得的菌株與最初分離的DYZWTJ001菌株形態(tài)相同，證明DYZWTJ001菌株為大葉紫薇炭疽病的病原菌。

圖1 大葉紫薇炭疽病的致病性測(cè)定結(jié)果

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定病原菌在自然生長(zhǎng)5 d后的PDA培養(yǎng)基表面菌落的平均直徑為6.9 cm。觀察到其菌落上的菌絲非常的致密，表面蓬松，中心呈灰色，邊緣呈白色，背面中心呈橘紅色，邊緣呈白色。分生孢子為單胞，整體呈現(xiàn)圓柱狀，兩端無(wú)色且鈍圓，大小為（13.59～15.83）μm×（4.60～6.51）μm。分生孢子盤(pán)褐色，橢圓形，大小為（72.27～77.05）μm×（35.25～37.46）μm（圖2）。

圖2 大葉紫薇炭疽病病菌形態(tài)

2.4 病原菌的分子鑒定將測(cè)序后的各基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得序列號(hào)，獲得DYZWTJ001菌株的 rDNA-ITS、ACT 、GADPH和CHS序列長(zhǎng)度分別為550 bp（NCBI 登錄號(hào)為MZ955449） 、257 bp（NCBI 登錄號(hào)為MZ955450）、251 bp（登錄號(hào)為MZ955451）和283 bp（登錄號(hào)為OM867674）。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取 rDNA-ITS、ACT 和GADPH相關(guān)基因序列（表1），將3種序列拼接，利用MEGA 7.0軟件聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果（圖3）表明，菌株DYZWTJ001與隱秘刺盤(pán)孢的遺傳距離最小，在93%水平上聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，確定DYZWTJ001菌株為隱秘刺盤(pán)孢（Colletotrichum aenigma）。

表1 參考菌株及其GeneBank登錄號(hào)

圖3 基于 rDNA-ITS、ACT、GAPDH及CHS序列基礎(chǔ)的菌株 DYZWTJ001 與其他炭疽菌相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 生物學(xué)特性

2.5.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響DYZWTJ001菌株均能在6種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其菌絲生長(zhǎng)速度依次為PDA>PSA>CA>OMA>Czapek>CMA（表2）。培養(yǎng)基PDA和PSA下菌絲生長(zhǎng)情況差異不顯著（P<0.05）。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)DYZWTJ001菌絲生長(zhǎng)的影響

2.5.2 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響菌株DYZWTJ001在不同梯度溫度環(huán)境下培養(yǎng)5 d后，在20～32 ℃條件下均能生長(zhǎng)，而在10 、15 、35 ℃條件下不能生長(zhǎng)。20～30 ℃內(nèi)，隨溫度的升高，菌落生長(zhǎng)速度顯著加快，30 ℃時(shí)病原菌菌落生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑為6.92 cm，其次是28 ℃時(shí)病原菌菌落生長(zhǎng)速度較快，菌落直徑為6.70 cm，這兩個(gè)溫度下的菌落直徑與其他溫度下的菌落直徑存在顯著性差異（P<0.05），因此認(rèn)定30 ℃為此炭疽菌最適生長(zhǎng)溫度；從30～32 ℃，菌絲生長(zhǎng)速度隨溫度的升高而下降，到35 ℃時(shí)，病原菌完全停止生長(zhǎng)（圖4）。

圖4 不同溫度培養(yǎng)DYZWTJ001菌株的菌落直徑

2.5.3 不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響菌 株DYZWTJ001在pH值為2時(shí)菌絲不能生長(zhǎng)，在pH值3～13環(huán) 境 下 均 能 生 長(zhǎng)。其 中，pH值 為8時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑為5.86 cm，與其他pH值下的菌落直徑存在顯著性差異（P<0.05）；之后隨著pH值的升高，菌絲生長(zhǎng)速率逐漸下降（圖5），表明堿性條件比弱酸性條件更有利于菌絲的生長(zhǎng)。

圖5 不同 pH 條件下DYZWTJ001菌株的菌落直徑

2.5.4 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響菌 株DYZWTJ001在不同光照條件下均能生長(zhǎng)。在黑暗環(huán)境下，其生長(zhǎng)速率最快，菌落直徑達(dá)6.89 cm；全光處理次之，菌落直徑達(dá)3.80 cm；光∶暗=12 h∶12 h處理生長(zhǎng)最慢，菌落直徑達(dá)3.81 cm（圖6）；光∶暗=12 h∶12 h處理和全光照處理間差異不顯著（P<0.05），可見(jiàn)不同光照條件對(duì)此炭疽菌菌絲生長(zhǎng)影響不大。

圖6 不同光照下 DYZWTJ001 菌株的菌落直徑

3 討 論

本研究通過(guò)對(duì)大葉紫薇炭疽病的病原菌進(jìn)行室內(nèi)分離、純化及致病性測(cè)定。利用ITS、ACT、GAPDH和CHS多基因序列分別對(duì)代表性菌株DYZWTJ001進(jìn)行分子鑒定，確定該病原菌為隱秘刺盤(pán)孢（Colletotrichum aenigma）。進(jìn)一步明確了引起海南大葉紫薇炭疽病的病原菌為隱秘刺盤(pán)孢。已有報(bào)道隱秘刺盤(pán)孢可引發(fā)蘋(píng)果、辣椒、白木香、楊樹(shù)等多種植物的炭疽病，這類(lèi)病害主要分布在高溫濕熱的熱帶和亞熱帶地區(qū)，其寄主范圍十分廣泛[17]。大葉紫薇炭疽病菌的致病性研究結(jié)果表明，嫩葉的致病力顯著高于老葉，老葉在刺傷的情況下才會(huì)發(fā)病，且嫩葉發(fā)病早于老葉，在嫩葉上接種發(fā)病擴(kuò)散速度明顯高于老葉。在老葉上，孢子懸浮液的侵染速度明顯快于菌塊，且病葉上極易產(chǎn)生大量分生孢子堆，可能會(huì)成為大葉紫薇炭疽病害傳播的重要侵染源。因此，在大葉紫薇炭疽病防治階段可以著重觀測(cè)嫩葉上病害的發(fā)病情況，同時(shí)對(duì)于發(fā)病樹(shù)葉以及病殘?bào)w進(jìn)行及時(shí)的清理，從而較好地防治大葉紫薇炭疽病。

顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察其分生孢子無(wú)色，中間有油滴，單胞，呈長(zhǎng)橢圓形狀，這與前人研究結(jié)果基本一致[18]。通過(guò)對(duì)DYZWTJ001生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，該菌株在20～32 ℃條件下均能生長(zhǎng)，最適宜溫度為30 ℃，這與前人研究炭疽菌結(jié)果基本一致[19]。DYZWTJ001在pH值3～13環(huán)境下均能生長(zhǎng)，說(shuō)明該菌株對(duì)于酸堿度的適應(yīng)范圍很廣，對(duì)于強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境也具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，其中最適宜的pH為8。培養(yǎng)基PDA與PSA的培養(yǎng)效果較好，這與前人的研究報(bào)道存在一定差異[20]，可能是由于寄主植物不同，分離所獲得的熱帶炭疽菌存在小種或生物型差異，而適宜該菌株的光照培養(yǎng)條件為24 h全黑暗，光照對(duì)其菌絲生長(zhǎng)有抑制作用。因此，海南全年暖熱，陰雨多濕，往往會(huì)引起大葉紫薇炭疽病發(fā)病擴(kuò)散，對(duì)于高溫多雨季節(jié)，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)防控，避免病害進(jìn)一步加重以及擴(kuò)散。