李婷婷，陳 紅

（貴州大學(xué)/國家林業(yè)和草原局刺梨工程技術(shù)研究中心，貴陽 550025）

0 引言

刺梨(Rosa roxburghiiTratt)是中國特有的果樹資源，具有很高的營養(yǎng)保健價(jià)值。近年來，刺梨已作為貴州重要的特色果樹產(chǎn)業(yè)被大力發(fā)展，但現(xiàn)有品種主要是通過野生馴化而來，且品種比較單一，遠(yuǎn)不能滿足廣大消費(fèi)者的多元化需求，因此，開展資源創(chuàng)新及新品種培育勢在必行。而植物細(xì)胞工程作為資源創(chuàng)新的有效手段，已在月季[1]、桑樹[2]、柑橘[3]、火龍果[4]等很多園藝植物上被廣泛應(yīng)用并獲得了變異植株。此外通過完善的離體再生體系已成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株[5-6]。

目前在刺梨上通過植物細(xì)胞工程手段創(chuàng)建新材料的研究鮮見報(bào)道，其主要原因是刺梨離體再生體系建立極為困難。僅張綠萍等對(duì)刺梨花藥[7]、未受精胚珠[8]愈傷組織誘導(dǎo)等進(jìn)行了研究，并分化出少量的類原球莖，但最終未能萌發(fā)成植株。由于刺梨含有大量的酚類物質(zhì)[9-11]，容易導(dǎo)致葉片愈傷組織褐化死亡，也限制了刺梨葉片再生體系的建立。基于此，本研究以4種基因型刺梨葉片為試材，研究Vc浸泡處理、取樣時(shí)間、植物生長調(diào)節(jié)劑及抗褐化劑對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)及抑制褐化的影響，以建立和優(yōu)化刺梨葉片愈傷組織誘導(dǎo)體系，并降低褐化率，為后續(xù)刺梨葉片再生體系的建立以及資源創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地‘貴農(nóng)1號(hào)’、‘貴農(nóng)2號(hào)’、‘貴農(nóng)5號(hào)’、‘貴農(nóng)7號(hào)’刺梨新梢幼嫩葉片為材料，于2020年1月—2021年12月進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Vc浸泡濃度及時(shí)間的篩選 將消毒處理后的葉片分別置于50、100 mg/L的Vc中浸泡8 h、12 h，以不經(jīng)Vc浸泡為對(duì)照處理，具體配比見表1。觀察愈傷組織發(fā)生時(shí)間，培養(yǎng)21天后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率以及褐化情況，篩選出最適宜愈傷組織誘導(dǎo)的Vc浸泡濃度和時(shí)間。

1.2.2 取樣時(shí)間的篩選 分別在春、夏、秋、冬季采集新梢幼嫩葉片，培養(yǎng)21天后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率以及褐化情況，篩選出最適宜愈傷組織誘導(dǎo)的最佳采樣時(shí)間。

1.2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的篩選 將葉片接種在含有不同濃度的6-BA、NAA、TDZ培養(yǎng)基中，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)L9(34)，具體濃度見表2，培養(yǎng)21天后觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長情況。

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比

1.2.4 不同抗褐化劑的篩選 選取不同濃度的檸檬酸、PVP、AgNO3附加到增殖培養(yǎng)基中，具體抗褐化劑種類及濃度配比見表3，將長勢良好的愈傷組織分別接種于不同抗褐化劑培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織增殖及褐化情況。

表3 不同抗褐化劑配比

1.3 培養(yǎng)條件

若無特別說明，培養(yǎng)基pH 5.8；葉片大小為0.5 cm×1 cm左右的長條；每個(gè)處理接種120個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次；光照強(qiáng)度為1500～2000 lx。光照時(shí)間為12 h/天，溫度為25±0.5℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用IBM SPSS STATISTIC 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率見式(1)和褐化率見式(2)。將愈傷組織的褐化程度采用目視法分為5級(jí)，用“+”表示，“+”越多表示褐化程度越高。

2 結(jié)果分析

2.1 Vc浸泡預(yù)處理對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)及褐化的影響

由表4可得，不同基因型葉片愈傷組織誘導(dǎo)率均隨著Vc浸泡濃度及時(shí)間的增加而升高，褐化率隨著Vc浸泡濃度及時(shí)間的增加而降低，處理組合為M4時(shí)，‘貴農(nóng)1號(hào)’、‘貴農(nóng)2號(hào)’、‘貴農(nóng)5號(hào)’、‘貴農(nóng)7號(hào)’誘導(dǎo)率均達(dá)到最高值，并且褐化率最低，誘導(dǎo)率分別為97.44%、89.37%、92.16%、94.00%，褐化率分別為1.46%、2.41%、1.13%、3.53%，愈傷組織狀態(tài)如圖1所示，與對(duì)照M0相比，顯著高于未經(jīng)Vc浸泡的葉片愈傷組織誘導(dǎo)率，并對(duì)愈傷組織的褐化有顯著抑制作用。綜合誘導(dǎo)率和褐化率分析，M4是4個(gè)基因型葉片最適宜的浸泡預(yù)處理組合。

表4 Vc浸泡對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)及降低褐化率的影響

圖1 Vc浸泡后不同基因型葉片愈傷組織生長情況

2.2 不同取樣時(shí)間對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)及褐化的影響

不同取樣時(shí)間對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)及褐化的影響如表5可見，雖然均采取新鮮幼嫩葉片，但隨著時(shí)間的推遲，葉片愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸下降，褐化率逐漸上升。在春季取材，各個(gè)基因型葉片誘導(dǎo)率均在90%以上，顯著高于夏、秋、冬三個(gè)季節(jié)的誘導(dǎo)率，且褐化率顯著低于夏、秋、冬三個(gè)季節(jié)的褐化率。3月，‘貴農(nóng)1號(hào)’、‘貴農(nóng)2號(hào)’、‘貴農(nóng)5號(hào)’、‘貴農(nóng)7號(hào)’誘導(dǎo)率均達(dá)到最高值，誘導(dǎo)率分別為95.8%、90.71%、91.99%、91.40%，與4、5月不存在顯著差異。3月褐化率最低，‘貴農(nóng)1號(hào)’、‘貴農(nóng)2號(hào)’、‘貴農(nóng)5號(hào)’、‘貴農(nóng)7號(hào)’褐化率分別為2.24%、5.68%、3.33%、8.45%，而夏季取樣，愈傷組織誘導(dǎo)率最低，褐化率也較高，誘導(dǎo)率在65.33%～75.47%之間。因此，綜合誘導(dǎo)率和褐化率分析，4個(gè)基因型刺梨葉片最佳取樣時(shí)間均為春季，3—5月。

表5 不同取樣時(shí)間對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)及褐化的影響

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)刺梨葉片愈傷組織的影響如表6可見，各處理均可誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷組織生長狀態(tài)略有差異。當(dāng)處理組合為5時(shí)，‘貴農(nóng)1號(hào)’和‘貴農(nóng)2號(hào)’愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最大值，分別為90.22%和92.34%，均呈嫩綠色致密顆粒狀，而‘貴農(nóng)5號(hào)’和‘貴農(nóng)7號(hào)’則在處理6誘導(dǎo)率最高，分別為96.46%和94.78%。經(jīng)極差分析發(fā)現(xiàn)，6-BA、NAA、TDZ在‘貴農(nóng)1號(hào)’和‘貴農(nóng)2號(hào)’試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響大小為6-BA＞NAA＞TDZ，在‘貴農(nóng)5號(hào)’試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響大小為6-BA＞TDZ＞NAA，在‘貴農(nóng)7號(hào)’試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響大小為NAA＞6-BA＞TDZ。以6-BA作為單個(gè)因子統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，隨著6-BA濃度的增加誘導(dǎo)率先升高后下降，以NAA作為單個(gè)因子統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，隨著NAA濃度的增加誘導(dǎo)率呈先升高后下降，而添加TDZ對(duì)‘貴農(nóng)5號(hào)’和‘貴農(nóng)7號(hào)’利于愈傷組織轉(zhuǎn)綠，未添加TDZ的愈傷組織呈黃白色。綜上所述，‘貴農(nóng)1號(hào)’和‘貴農(nóng)2號(hào)’最適宜的生長調(diào)節(jié)劑為1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA，‘貴農(nóng)5號(hào)’和‘貴農(nóng)7號(hào)’最適宜的生長調(diào)節(jié)劑為1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/LNAA+1.0 mg/LTDZ。

表6 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

續(xù)表6

2.4 抗褐化劑對(duì)葉片愈傷組織增殖及褐化的影響

2.4.1 抗褐化劑對(duì)刺梨葉片增殖的影響 由表7可見，在不添加抗褐化劑的增殖培養(yǎng)基中，愈傷組織褐化情況較為嚴(yán)重，不同基因型刺梨葉片愈傷組織增殖系數(shù)較低，生長較為緩慢。添加了檸檬酸和AgNO3后，基本隨著抗褐化劑濃度的增加褐化程度呈下降趨勢，增殖倍數(shù)也有所提高，愈傷組織生長較快?！F農(nóng)1號(hào)’刺梨，檸檬酸含量為1.0 g/L時(shí)，增長倍數(shù)最高，為3.01倍，褐化程度也較輕，與1.5 g/L不存在顯著差異，AgNO3為0.4 g/L時(shí)，增長倍數(shù)為8.49倍，與其他處理存在顯著差異；對(duì)于‘貴農(nóng)2號(hào)’、‘貴農(nóng)5號(hào)’、‘貴農(nóng)7號(hào)’刺梨愈傷組織增殖培養(yǎng)來講，檸檬酸最適濃度為1.0 g/L，同時(shí)褐化程度最低，增殖倍數(shù)分別為2.67、3.63、3.28倍，AgNO3最適濃度均為0.4 g/L，增殖倍數(shù)分別為8.67、9.37、9.89倍。添加PVP的愈傷組織褐化程度與對(duì)照相比，無明顯降低，但增殖倍數(shù)卻逐漸降低，綜上所述，愈傷組織的褐化情況是抑制增長的重要因素。上述3種抗褐化劑對(duì)4種基因型刺梨葉片愈傷組織增殖培養(yǎng)的效果大小為AgNO3＞檸檬酸＞PVP。

表7 不同抗褐化劑對(duì)刺梨葉片愈傷組織增殖及褐化的影響

續(xù)表7

2.4.2 3種抗褐化劑對(duì)4個(gè)基因型愈傷組織褐化率的影響 由表8、9可得，添加檸檬酸、AgNO3與對(duì)照相比均可顯著降低4個(gè)基因型刺梨愈傷組織的褐化率，未添加檸檬酸、AgNO3時(shí)，‘貴農(nóng)5號(hào)’的愈傷組織褐化率最低，與其他3個(gè)基因型愈傷組織存在顯著差異。隨著檸檬酸、AgNO3濃度的增加，4個(gè)基因型愈傷組織褐化率逐漸下降，在本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，檸檬酸濃度為2.0 g/L、AgNO3濃度為0.4 g/L時(shí)，4個(gè)基因型愈傷組織褐化率均達(dá)到最低值，以‘貴農(nóng)5號(hào)’愈傷組織褐化率最低，添加檸檬酸愈傷組織褐化率為2.38%，添加AgNO3愈傷組織褐化率為1.29%，顯著低于其他3個(gè)基因型愈傷組織褐化率，‘貴農(nóng)7號(hào)’愈傷組織褐化率最高，添加檸檬酸愈傷組織褐化率為11.13%，添加AgNO3愈傷組織褐化率為10.14%。綜上所述，在這4個(gè)基因型中，無論是否添加抗褐化劑，均為‘貴農(nóng)5號(hào)’的褐化率最低。添加抗褐化劑與未添加抗褐化劑愈傷組織對(duì)比圖如圖2所見。

表8 不同濃度檸檬酸對(duì)4個(gè)基因型刺梨葉片愈傷組織褐化率的影響

表9 不同濃度AgNO3對(duì)4個(gè)基因型刺梨葉片愈傷組織褐化率的影響

圖2 添加抗褐化劑與未添加抗褐化劑愈傷組織對(duì)比圖

由表10可得，添加PVP對(duì)4個(gè)基因型愈傷組織的褐化率并無明顯抑制作用，甚至還存在褐化率升高的現(xiàn)象，由此可見，PVP對(duì)4個(gè)基因型刺梨愈傷組織的褐化率并無顯著抑制作用。

表10 不同濃度PVP對(duì)4個(gè)基因型刺梨葉片愈傷組織褐化率的影響

3 結(jié)論

100 mg/LVc浸泡12 h后4種基因型刺梨葉片愈傷組織誘導(dǎo)率最高，褐化率最低；春季（3—5月）為不同基因型葉片最佳取材時(shí)間；‘貴農(nóng)1號(hào)’和‘貴農(nóng)2號(hào)’葉片愈傷組織誘導(dǎo)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA，‘貴農(nóng)5號(hào)’和‘貴農(nóng)7號(hào)’葉片愈傷組織誘導(dǎo)最適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/LNAA+1.0 mg/LTDZ；3種抗褐化劑對(duì)4種基因型刺梨葉片愈傷組織增殖培養(yǎng)的效果大小為AgNO3＞檸檬酸＞PVP；添加2.0 g/L檸檬酸或0.4 g/LAgNO34個(gè)基因型葉片愈傷組織褐化率最低，PVP對(duì)愈傷組織褐化率并無顯著抑制，甚至褐化率還會(huì)上升。

4 討論

不同基因型刺梨葉片對(duì)6-BA、NAA、TDZ敏感程度不同，對(duì)‘貴農(nóng)1號(hào)’和‘貴農(nóng)2號(hào)’葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響大小為6-BA＞NAA＞TDZ，而‘貴農(nóng)5號(hào)’和‘貴農(nóng)7號(hào)’添加TDZ有利于葉片愈傷組織轉(zhuǎn)綠且生長狀態(tài)良好，可用于增殖及分化培養(yǎng)，與前人研究一致[12-15]，雖然TDZ化學(xué)結(jié)構(gòu)與一般的生長素和細(xì)胞分裂素不同，但具有兩者的生物活性[16-17]，并對(duì)類原球莖分化成類原球莖束有重要作用[18]，也利于月季葉片直接再生[19]。但使用在某些基因型植株上易引起玻璃化現(xiàn)象[20]，在后續(xù)的試驗(yàn)中，可著重研究TDZ濃度、與其他生長調(diào)節(jié)劑互作對(duì)刺梨葉片愈傷組織的誘導(dǎo)及分化的影響。

刺梨酚類物質(zhì)含量較高，極易出現(xiàn)褐化，其再生體系尚未建立，可能與褐化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)通過100 mg/LVc浸泡12 h、添加適當(dāng)濃度的檸檬酸、AgNO3可有效降低褐化率，PVP對(duì)刺梨愈傷組織褐化并無明顯抑制作用，與張綠萍等研究一致[21-23]，但與陳夢(mèng)倩[24]研究結(jié)果略有不同，可能與外植體、樹種差異性不同等有關(guān)。4個(gè)基因型葉片最佳取材時(shí)間均為春季，誘導(dǎo)率在90%以上，而在3月份其誘導(dǎo)率均達(dá)到最大值，褐化率最低，可能是正處于春梢生長期，生長代謝較為旺盛且新生葉與外界接觸時(shí)間較短，葉片體內(nèi)的酚類物質(zhì)匯聚較少，但與蒲艷等[25]、陳豆豆等[26]研究有所差異，可能與外植體不同、生物學(xué)特性不同等有關(guān)。雖然通過上述因素可以有效降低褐化率，但若想從根本上解決褐化現(xiàn)象，可能需要從遺傳學(xué)、分子等多方面進(jìn)行更深入的研究。

刺梨再生體系至今尚未建立，主要是因?yàn)榉只浅＠щy。本研究主要是針對(duì)提高刺梨葉片愈傷組織誘導(dǎo)率和降低褐化率進(jìn)行研究，其他因素對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)及抑制褐化是否有影響，如何影響應(yīng)進(jìn)一步研究，同時(shí)愈傷組織正常誘導(dǎo)的情況下，篩選出分化培養(yǎng)的關(guān)鍵影響因子，以早日建立刺梨葉片離體再生體系。