徐曉美，李 穎，衡 周，徐小萬，李 濤，王恒明

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

0 引言

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，因含有保守的WRKY結(jié)構(gòu)域而得名，該結(jié)構(gòu)域由約60個(gè)氨基酸組成，靠近氨基(N)末端的7個(gè)保守氨基酸殘基WRKYGQK是該結(jié)構(gòu)域的核心序列[1]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物花粉發(fā)育[2]、種子成熟和萌發(fā)[3]、植株葉片衰老[4]等生理過程，還在植物抗病、抗逆防御反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[5]。

盡管，最早在甘薯中鑒定的植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因SPF1的生物學(xué)功能是調(diào)控糖信號途徑的建立[6]，然而，隨后的大量研究工作證實(shí)眾多WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白主要參與了植物從基礎(chǔ)免疫到獲得性抗性的多種抗病反應(yīng)之中，通過調(diào)控多通路多層次的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響植物對病原物的生理反應(yīng)，在植物與病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲以及昆蟲的相互作用過程中發(fā)揮重要作用[7]。DONG等[8]對72個(gè)擬南芥WRKY基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中有49個(gè)基因受含無毒基因的病原菌或SA的誘導(dǎo)。在水稻中，45個(gè)被檢測的WRKY基因中有15個(gè)受稻瘟菌誘導(dǎo)后顯著表達(dá)上調(diào)，并且其中12個(gè)同時(shí)受白葉枯病菌不同程度誘導(dǎo)表達(dá)，信號通路檢測發(fā)現(xiàn)，OsWRKY45和OsWRKY62受SA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)；OsWRKY10、OsWRKY82和OsWRKY85受JA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)；OsWRKY30和OsWRKY83同時(shí)響應(yīng)SA和JA上調(diào)表達(dá)[9]。除擬南芥和水稻等模式植物外，隨后的研究發(fā)現(xiàn)在棉花[10]、油菜[11]、大麥[12]等大宗作物和辣椒[13]、大白菜[14]等蔬菜作物中均有發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)病原菌誘導(dǎo)反應(yīng)。

辣椒是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。目前，已公布的辣椒參考基因組有兩個(gè)，分別為“遵辣1號”[15]和墨西哥地方品種CM334[16]。基于這2個(gè)參考基因組，刁衛(wèi)平等[17]利用生物信息學(xué)方法鑒定出71個(gè)CaWRKY基因?？紤]到兩個(gè)不同辣椒材料自身基因組序列的不同以及各自測序可能帶來的拼裝錯(cuò)誤等因素，兩個(gè)不同辣椒基因組中的CaWRKY基因并非一一線性對應(yīng)關(guān)系，因此，兩個(gè)不同基因組中的CaWRKY基因放在一起進(jìn)行命名及染色體定位作圖會帶來諸多困擾?；凇白窭?號”參考基因組，ZHENG等[18]鑒定出62個(gè)CaWRKY基因，目前還沒有基于CM334參考基因組全面鑒定CaWRKY基因的報(bào)道。CM334是一個(gè)高抗辣椒疫病材料，對目前已報(bào)道的所有辣椒疫霉菌生理小種均具有抗性[19]。本研究基于CM334參考基因組及其RNA-seq數(shù)據(jù)，全基因組鑒定CaWRKY基因并分析其在辣椒疫霉菌處理下的基因表達(dá)情況，篩選出關(guān)鍵CaWRKY基因并對其可能參與的抗病相關(guān)信號通路進(jìn)行檢測和分析，為后續(xù)探究CaWRKY基因參與抗病防御反應(yīng)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 CaWRKY基因的鑒定

從辣椒基因組網(wǎng)站(http://peppergenome.snu.ac.kr/)下載參考基因組和基因模型注釋文件，而后利用HISAT軟件[20]構(gòu)建參考基因組索引，結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)并使用HISAT將配對末端clean reads與參照基因組比對，基于基因模型注釋文件生成拼接連接的數(shù)據(jù)庫，獲取基因信息（如基因id/名稱、所在染色體、基因位置和注釋信息等），從中挑選出全部WRKY基因。以“Novel”開頭的基因ID為StringTie軟件[21]預(yù)測得到的新基因。

1.2 材料種植及處理

抗病材料CM334和感病對照材料NMCA10399均受贈于美國墨西哥大學(xué)Paul W.Bosland教授[19]。試驗(yàn)材料均在育苗杯中種植，每杯播種5粒種子，于植物培養(yǎng)室育苗。育苗條件為：26±2℃的溫度下光照14 h，黑暗10 h交替進(jìn)行，濕度為70%。幼苗生長至6片真葉時(shí)分別進(jìn)行接菌處理和噴灑激素處理。

接菌處理詳見文獻(xiàn)報(bào)道[22]。在6片真葉期分別以5 mmol/L的SA和100 μmol/L的MeJA溶液（均溶解于10%的乙醇溶液中）噴灑抗病材料CM334幼苗葉片，分別在噴灑后0、6、12、24、48 h取植株根部以上部分固定于液氮中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 接菌后的CaWRKY基因表達(dá)分析

接種辣椒疫霉菌后的RNA-seq及其數(shù)據(jù)處理詳見文章[22]，基因相對表達(dá)量以FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced)值體現(xiàn)，在此基礎(chǔ)上，調(diào)出全部已鑒定WRKY基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用Microsoft Office Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。當(dāng)任意兩個(gè)基因的相對表達(dá)量差異達(dá)到 2倍以上，即log2FoldChange≥1或log2FoldChange≤-1則被認(rèn)為是顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)基因。

1.4 RNA提取及qRT-PCR

Total RNA提取采用Ambion公司生產(chǎn)的TRI Reagent Solution(TR118)RNA分離試劑并按照說明書進(jìn)行操作，通過濃度和完整性檢測后用于逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA采用Vazyme公司生產(chǎn)的HiScript QRT SuperMix for qPCR試劑盒。

根據(jù)基因ID在辣椒參考基因組數(shù)據(jù)庫(http://peppergenome.snu.ac.kr/)下載目標(biāo)基因的CDS序列，按照qRT-PCR引物設(shè)計(jì)要求，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier6.0設(shè)計(jì)引物并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物經(jīng)過檢測合格后用于后續(xù)qRT-PCR反應(yīng)，所用引物見表1。

表1 qRT-PCR所用引物信息

qRT-PCR所用試劑盒ChamQ SYBR qPCR Master Mix 為 Vazyme公司生產(chǎn)，反應(yīng)體系20 μL：2×qPCRmix 10 μL，上游和下游引物（濃度10 pmol/uL）各0.5 μL，cDNA 模板 2.0 μL，無菌水 7.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃ 10 s，60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；熔點(diǎn)曲線程序：95℃ 5 s，60℃ 5 s，95℃ 5 s。以辣椒IF4G基因?yàn)閮?nèi)參基因[22]，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，每個(gè)樣本含有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，qRT-PCR反應(yīng)均在StepOnePlusTM Real-Time System（ABI，美國）熒光定量PCR儀上進(jìn)行?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用2-ΔΔCt法[23]進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 WRKY基因鑒定及染色體定位

基于辣椒參考基因組信息及RNA-seq數(shù)據(jù)并利用HISAT軟件，共鑒定出69個(gè)CaWRKY基因，分別分布于12條染色體上，從第1號染色體上的第一個(gè)CaWRKY基因開始，依次命名為CaWRKY1-CaWRKY69（表2）。其中位于第2、4、6和10號染色體上 的CaWRKY12、CaWRKY27、CaWRKY35和CaWRKY57為新注釋的CaWRKY基因，在本研究參考的辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(http://peppergenome.snu.ac.kr/)中未被預(yù)測到。根據(jù)刁衛(wèi)平等[17]的報(bào)道及NCBI數(shù)據(jù)庫上比對驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)位于第9號染色體上的3個(gè)連續(xù)基因ID(CA09g11930、CA09g11940、CA09g11950)編碼的是同一個(gè)CaWRKY基因的不同片段，本研究依次將其命名為CaWRKY52。

表2 辣椒全基因組WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 辣椒疫霉菌侵染后的基因表達(dá)分析

在接種辣椒疫霉菌0、12、36 h后，對抗病材料CM334和感病材料NMCA10399的根莖部進(jìn)行RNA-seq，通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及相關(guān)系數(shù)分析表明，RNA-seq數(shù)據(jù)是可靠的[22]，可用于后續(xù)分析。對69個(gè)CaWRKY基因的RNA-seq數(shù)據(jù)分析表明，有11個(gè)基因（CaWRKY23、CaWRKY24、CaWRKY30、CaWRKY32、CaWRKY 35、CaWRKY 46、CaWRKY 54、CaWRKY 66、CaWRKY 67、CaWRKY 68和CaWRKY 69）在各時(shí)間點(diǎn)的FPKM值均小于1，即為超低量表達(dá)基因，不予進(jìn)行后續(xù)分析。剩下的58個(gè)CaWRKY基因，在抗、感病材料接種辣椒疫霉菌0、12、36 h后的基因相對表達(dá)情況見圖1。

圖1 辣椒疫霉菌侵染后CaWRKYs基因表達(dá)分析

深入分析表明，在接菌后12 h，抗病材料CM334中有4個(gè)基因（CaWRKY19、CaWRKY45、CaWRKY49和CaWRKY65）顯著上調(diào)表達(dá)，3個(gè)基因（CaWRKY50、CaWRKY59和CaWRKY60）顯著下調(diào)表達(dá)；感病材料NMCA10399中有3個(gè)基因(CaWRKY27、CaWRKY45、CaWRKY49)顯著上調(diào)表達(dá)，無顯著下調(diào)表達(dá)基因（表3），即在接菌后12 h，抗病親本中有更多的基因表現(xiàn)出差異表達(dá)。在接菌后36 h，抗病親本中有11個(gè)基因（CaWRKY10、CaWRKY19、CaWRKY21、CaWRKY25、CaWRKY27、CaWRKY31、CaWRKY45、CaWRKY49、CaWRKY52、CaWRKY63和CaWRKY65）顯著上調(diào)表達(dá)，2個(gè)基因（CaWRKY60和CaWRKY64）顯著下調(diào)表達(dá)，而在感病親本中，顯著上調(diào)表達(dá)的基因多達(dá)18個(gè)（CaWRKY1、CaWRKY4、CaWRKY5、CaWRKY9、CaWRKY10、CaWRKY16、CaWRKY19、CaWRKY21、CaWRKY22、CaWRKY27、CaWRKY29、CaWRKY31、CaWRKY45、CaWRKY49、CaWRKY52、CaWRKY57、CaWRKY63和CaWRKY65），同時(shí)也有 4個(gè)基因（CaWRKY43、CaWRKY59、CaWRKY60和CaWRKY64）顯著下調(diào)表達(dá)（表3），即在接菌后36 h，感病親本中顯著差異表達(dá)的基因比抗病親本多。另外，縱觀接菌后12 h和36 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在抗病親本CM334中有2個(gè)（CaWRKY25和CaWRKY50）特有的顯著差異表達(dá)基因，而在感病親本NMCA10399中，特有的顯著差異表達(dá)基因有 9個(gè)（CaWRKY1、CaWRKY4、CaWRKY5、CaWRKY9、CaWRKY16、CaWRKY22、CaWRKY29、CaWRKY43和CaWRKY57）（表3）。

表3 顯著差異表達(dá)基因分析

2.3 SA和MeJA處理后關(guān)鍵基因表達(dá)分析

如上所述，在抗病親本CM334接菌后12 h，有7個(gè)CaWRKY基因（CaWRKY19、CaWRKY45、CaWRKY49、CaWRKY50、CaWRKY59、CaWRKY60、CaWRKY65）快速應(yīng)答，表現(xiàn)出顯著差異表達(dá)。另外，在CM334中還有2個(gè)特有的差異表達(dá)基因CaWRKY25和CaWRKY50（表3），推測這8個(gè)CaWRKY基因（9個(gè)基因中有一個(gè)是重復(fù)的）是辣椒抗疫病反應(yīng)過程中的關(guān)鍵基因。為檢測其抗病相關(guān)信號通路，筆者對CM334幼苗葉片進(jìn)行了SA和MeJA噴灑處理，并對8個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析。研究表明，CaWRKY19和CaWRKY65受SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，均在SA處理6 h后極顯著上調(diào)表達(dá)(P＜0.0001)，并在處理12 h后達(dá)到最高，隨后開始下調(diào)；CaWRKY50受MeJA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在MeJA處理6 h后極顯著上調(diào)表達(dá)(P＝0.004)，隨后開始下調(diào)并在處理12 h后降到最低；CaWRKY25受SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在SA處理6 h后略微上調(diào)表達(dá)，并12 h后達(dá)到顯著上調(diào)表達(dá)(P＝0.015)，隨后表達(dá)量持續(xù)下調(diào)到最低，CaWRKY25同時(shí)受到MeJA抑制下調(diào)表達(dá)，在MeJA處理6 h后開始持續(xù)下調(diào)表達(dá)，在處理后48 h后達(dá)到極顯著下調(diào)表達(dá)(P＝0.002)；而CaWRKY49同時(shí)受到SA和MeJA抑制下調(diào)表達(dá)，在SA和MeJA處理6 h后均表達(dá)極顯著下調(diào)（P＝0.0002和P＝0.002），并在隨后表達(dá)量均開始回調(diào)，處理后24 h均回調(diào)到無顯著差異水平。其他3個(gè)基因均不受SA或MeJA誘導(dǎo)或抑制（圖2）。

圖2 關(guān)鍵CaWRKY在SA和MeJA處理下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

辣椒基因組測序工作完成于2014年，分別測得貴州朝天椒“遵辣1號”(http：//peppersequence.genomics.cn)[15]和墨西哥地方品種CM334(http://peppergenome.snu.ac.kr/)[16]的基因組序列，這給辣椒組學(xué)相關(guān)研究帶來了極大便利。刁衛(wèi)平等[17]對兩個(gè)參考基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，鑒定出71個(gè)CaWRKY基因?；凇白窭?號”參考基因組，ZHENG等[18]鑒定出62個(gè)CaWRKY基因，其中57個(gè)CaWRKY基因分布于辣椒12條染色體上，還有5個(gè)基因未能定位。本研究基于CM334參考基因組及其RNA-seq數(shù)據(jù)挖掘到69個(gè)CaWRKY基因，這和刁衛(wèi)平等[17]鑒定的基因個(gè)數(shù)相當(dāng)，僅相差2個(gè)，但和ZHENG等[18]鑒定出的基因個(gè)數(shù)相差較大，相差7個(gè)，推測這和參考基因組質(zhì)量及鑒定時(shí)所設(shè)置的搜索參數(shù)有關(guān)。另外，由于兩個(gè)已測序辣椒材料自身基因組序列差異以及各自測序可能帶來的拼裝錯(cuò)誤等因素，兩個(gè)不同辣椒參考基因組中的CaWRKY基因并非一一線性對應(yīng)關(guān)系，不同參考基因組中的CaWRKY基因放在一起進(jìn)行命名以及染色體定位作圖將給讀者及后續(xù)研究帶來困擾，因此，基于不同參考基因組獨(dú)自對CaWRKY基因進(jìn)行研究會更合適。

本研究中，辣椒幼苗接種辣椒疫霉菌后0、12、36 h的CaWRKY基因表達(dá)結(jié)果顯示：接菌后12 h，抗病材料CM334和感病材料NMCA10399中分別鑒定出7個(gè)和3個(gè)顯著差異表達(dá)CaWRKY基因；接菌后36小時(shí)，抗、感材料中分別鑒定出13和22個(gè)顯著差異表達(dá)CaWRKY基因。該研究結(jié)果可以看出，在病原菌進(jìn)行攻擊后，抗、感材料均能做出持續(xù)反應(yīng)，而在發(fā)病早期，抗病材料能夠調(diào)動更多的CaWRKY基因參與到防御反應(yīng)中來，這與LI等[22]的研究結(jié)果一致。類似的研究結(jié)果在番茄中也有報(bào)道：接種青枯病菌后24 h，在抗病材料中檢測出的差異表達(dá)基因是感病材料中檢出的2倍多，分別為1986和972個(gè)，而接種青枯菌后48 h，感病材料中檢出的差異表達(dá)基因略多于抗病材料，分別為2887和2684個(gè)[24]。從以上研究結(jié)果推測，抗病材料對于病原菌刺激的反應(yīng)快于感病材料，能夠在發(fā)病早期快速調(diào)動更多的抗病相關(guān)基因進(jìn)行應(yīng)答，這可能對植株抗病防御反應(yīng)至關(guān)重要。

SA和JA信號途徑是與抗病相關(guān)的常見信號通路。DANG等[25]研究發(fā)現(xiàn)CaWRKY27在抗青枯病菌辣椒品種中受青枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，同時(shí)，CaWRKY27受SA、MeJA和ET誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，在煙草中過量表達(dá)CaWRKY27后提高了對青枯病菌的抗性，且病程相關(guān)基因和SA、JA和ET相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，表明CaWRKY27在抗病防御中通過SA、JA和ET介導(dǎo)的信號途徑起正調(diào)控作用?；蛐蛄?CDS)比對發(fā)現(xiàn)，上述研究中的CaWRKY27與本研究中的CaWRKY15相似性最高（相似度達(dá)99.67%），不同的是，本研究中CaWRKY15未受辣椒疫霉菌顯著誘導(dǎo)。另一報(bào)道中表明CaWRKY40通過SA、JA和ET信號通路在辣椒和煙草中協(xié)同調(diào)控植株應(yīng)對青枯病菌攻擊和熱應(yīng)激反應(yīng)[13]，同樣經(jīng)過基因序列(CDS)比對發(fā)現(xiàn)，該報(bào)道中的CaWRKY40與本研究中的CaWRKY25高度相似（相似度達(dá)99.72%）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種辣椒疫霉菌后，CaWRKY25在抗病材料CM334中特有顯著差異表達(dá)（表3），且受SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)同時(shí)受到MeJA抑制下調(diào)表達(dá)，推測該基因可能通過SA和JA信號通路協(xié)同調(diào)控辣椒植株應(yīng)對辣椒疫霉菌防御反應(yīng)，與前人報(bào)道的研究結(jié)果一致。

本研究基于辣椒(CM334)基因組全面鑒定了69個(gè)CaWRKY基因，在辣椒疫霉菌侵染后（包含12和36小時(shí)），抗、感材料中分別有15和22個(gè)差異表達(dá)CaWRKY基因，表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。另外，從表3可以看出，相比感病材料，抗病材料對疫霉菌的應(yīng)激反應(yīng)更快速。信號通路分析表明，8個(gè)關(guān)鍵CaWRKY基因中有5個(gè)基因受SA（或MeJA）誘導(dǎo)（或抑制）表達(dá)，從而可以推測SA和JA信號途徑是CaWRKY基因參與辣椒抗病防御反應(yīng)的主要途徑。本研究是在基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平對CaWRKY基因的功能進(jìn)行鑒定，因基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)后還要經(jīng)歷翻譯、修飾等過程才能行使功能，因此，轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上對基因功能的鑒定具有一定的局限性，要想進(jìn)一步明確CaWRKY基因功能及其參與抗病防御反應(yīng)的分子機(jī)制，還有望做基因沉默、過表達(dá)等進(jìn)一步深入研究才可能實(shí)現(xiàn)。