邵曉曉，王偉中，馬國(guó)龍，金穎莉，史睿昕，蔣益

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）確切病因未知[1]，臨床上缺乏特異性、有效的治療藥物。UC患者病情常遷延反復(fù)，因此尋找安全有效的治療藥物迫在眉睫。研究證實(shí)核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）在UC患者體內(nèi)呈過(guò)度活化狀態(tài)，參與UC的發(fā)生和發(fā)展[2]。Toll樣受體4（Tolllike receptor 4,TLR4）通過(guò)外來(lái)刺激因子和TLR4結(jié)合之后激活固有免疫系統(tǒng)，啟動(dòng)NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生[3]。

黃芩素（分子式C15H10O5）是中藥黃芩的主要有效成分，具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等作用[4]?！秱摗氛J(rèn)為以黃芩為主藥的黃芩湯有清熱燥濕、和中止痛的作用，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，黃芩湯對(duì)治療炎癥性腸病具有較好療效，但機(jī)制不明[5]。研究還發(fā)現(xiàn)黃芩素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB的活性達(dá)到抗炎效果[6]。因此，本研究通過(guò)觀察黃芩素對(duì)葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium,DSS）誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的治療作用，研究黃芩素是否通過(guò)干預(yù)TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用，旨在為黃芩素治療UC提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：黃芩素購(gòu)自上海Aladdin公司，DSS（相對(duì)分子質(zhì)量36～50 kDa）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司，羥甲基纖維素鈉、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、二脒基苯基吲哚（DAPI）染料購(gòu)自北京Solarbio公司，RNAsimple總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司，iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。山羊抗小鼠NF-κB p65抗體購(gòu)自上海Rndsystems公司、兔抗小鼠EPCAm抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司，驢抗山羊（Alexa Fluor488標(biāo)記）熒光二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，驢抗兔（Cy3標(biāo)記）熒光二抗購(gòu)自武漢Servicebio公司。

1.1.2 動(dòng)物：6～8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22（21.7±0.16）g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，并在溫州醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2018-0017。小鼠飼養(yǎng)具體環(huán)境條件如下：溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度45%，光照和黑暗環(huán)境各12 h循環(huán)。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究獲溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)wydw2017-0019）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理：將C57BL/6品系小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即對(duì)照組、結(jié)腸炎組、黃芩素低劑量（Ba-L）治療組[10 mg/（kg·d）]、黃芩素高劑量（Ba-H）治療組[25 mg/（kg·d）]和5-氨基水楊酸（5-amino-salicylic acid,5-ASA）治療組，每組各12 只。對(duì)照組小鼠自由飲用清水，其余小鼠連續(xù)7 d自由飲用3.5% DSS溶液，構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型。藥物劑量和給藥方式參照Z(yǔ)HONG等[7]的方法：在開始飲用DSS溶液7 d前予實(shí)驗(yàn)組小鼠藥物（黃芩素或5-ASA）灌胃連續(xù)7 d，在開始飲用DSS溶液后，繼續(xù)給予藥物（黃芩素或5-ASA）灌胃7 d，每日灌胃1次，每次0.2 mL。所有藥物均溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中制成混懸液，對(duì)照組小鼠連續(xù)14 d每日灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液0.2 mL。造模后定期觀測(cè)、記錄小鼠的體質(zhì)量變化、糞便性狀和便血等情況，并評(píng)估小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index,DAI）[8]。在造模第7天，采用頸椎脫臼法處死小鼠，收集小鼠結(jié)腸組織并測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，選取距離小鼠肛門1～2 cm處的結(jié)腸組織，予以常規(guī)組織脫水、石蠟包埋。組織連續(xù)切片后予以HE染色，采用組織學(xué)活動(dòng)度評(píng)分（histology activity index,HAI）[9]對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行病理學(xué)評(píng)估炎癥程度和組織損傷。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子[γ干擾素（interferon-γ,IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β,IL-1β）]的水平，反映小鼠腸道炎癥的程度。檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）、NF-κB p65的相對(duì)表達(dá)水平，間接反映TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活程度。根據(jù)RNAsimple總RNA提取試劑盒說(shuō)明書從小鼠結(jié)腸組織中提取總RNA，采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度、純度，根據(jù)PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書制備cDNA樣品，采用iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix定量PCR檢測(cè)?？偡磻?yīng)體系10 μL，包括上下游引物各0.4 μL，SYBR Green 5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。以標(biāo)準(zhǔn)管家基因（GAPDH）為參照，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用的引物序列

1.2.3 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞NF-κB p65入核率：檢測(cè)小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中NF-κB p65的入核率，評(píng)價(jià)NF-κB信號(hào)通路的激活程度。小鼠結(jié)腸組織石蠟切片，經(jīng)過(guò)脫蠟、水化之后，枸櫞酸鈉抗原熱修復(fù)，用0.3% Triton X-100破膜15 min。PBS洗滌后，用3% BSA封閉1 h，滴加一抗（山羊抗小鼠NF-κB p65抗體和兔抗小鼠EPCAm抗體），置于濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜。次日，PBS洗滌后，滴加熒光二抗[驢抗山羊（Alexa Fluor 488 標(biāo)記）熒光二抗和驢抗兔（Cy3標(biāo)記）熒光二抗]，室溫避光孵育1 h后，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。PBS洗滌，滴加自發(fā)熒光淬滅劑，予以抗熒光淬滅封片劑封片，將切片放置于熒光顯微鏡下觀測(cè)并采集相應(yīng)圖像。采用Image Pro Plus 6.0（IPP）圖像分析軟件對(duì)所得圖像進(jìn)行定量分析。DAPI染色標(biāo)記細(xì)胞核，EPCAm抗體標(biāo)記小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞，NF-κB p65抗體標(biāo)記p65蛋白，在高倍鏡視野下，統(tǒng)計(jì)腸上皮細(xì)胞中p65的入核率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)處理軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)（方差齊）或Tamhane’s T2檢驗(yàn)（方差不齊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠結(jié)腸炎嚴(yán)重程度評(píng)估 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組小鼠無(wú)腹瀉和便血等癥狀，總體精神狀態(tài)良好，體質(zhì)量輕微上升；其余4組小鼠均在飲用3.5% DSS溶液后的第3天開始出現(xiàn)體質(zhì)量下降、腹瀉、便血等表現(xiàn)。在第7天時(shí)，結(jié)腸炎組小鼠體質(zhì)量和小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度都明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；而Ba-L治療組、Ba-H治療組以及5-ASA治療組小鼠體質(zhì)量和結(jié)腸長(zhǎng)度均明顯高于結(jié)腸炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖1。各治療組小鼠體質(zhì)量變化率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；而Ba-L治療組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著短于5-ASA治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。造模第7天時(shí)，Ba-L治療組、Ba-H治療組以及5-ASA治療組小鼠DAI均顯著低于結(jié)腸炎組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1；HAI評(píng)分均顯著低于結(jié)腸炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；光鏡下表現(xiàn)為隱窩結(jié)構(gòu)更加完整，黏膜潰瘍面積更小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更少，見圖2、圖3。

2.2 小鼠炎性細(xì)胞因子相關(guān)mRNA相對(duì)表達(dá)水平結(jié)腸炎組小鼠的結(jié)腸組織中IFN-γ、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組小鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。Ba-H治療組結(jié)腸組織中IFN-γ、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平顯著低于結(jié)腸炎組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。3個(gè)治療組間比較，這些炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

2.3 TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)mRNA相對(duì)表達(dá)水平結(jié)腸炎組小鼠結(jié)腸組織中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。Ba-L治療組、Ba-H治療組和5-ASA治療組小鼠結(jié)腸組織中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平均低于結(jié)腸炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；各治療組之間上述指標(biāo)表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 各組小鼠結(jié)腸組織mRNA相對(duì)表達(dá)量（每組n=12，）

表2 各組小鼠結(jié)腸組織mRNA相對(duì)表達(dá)量（每組n=12，）

與對(duì)照組比：aP ＜0.01；與結(jié)腸炎組比：bP ＜0.05，cP ＜0.01

2.4 免疫熒光檢測(cè)腸上皮細(xì)胞中NF-κB p65的入核率 結(jié)腸炎組腸上皮細(xì)胞中NF-κB p65的入核率顯著高于對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Ba-L治療組、Ba-H治療組以及5-ASA治療組的腸上皮細(xì)胞中NF-κB p65的入核率均顯著低于結(jié)腸炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖4。

3 討論

西醫(yī)理論認(rèn)為UC是遺傳、免疫、環(huán)境、微生物等因素綜合作用于遺傳易感者，使機(jī)體產(chǎn)生異常免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致腸組織炎癥性損傷[10]。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將UC歸屬于“赤沃”“泄瀉”“久痢”等疾病范疇[11]。目前UC仍缺乏特異性治療藥物，而祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥對(duì)于治療胃腸道慢性疾病常顯示出獨(dú)到的療效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，提取自中藥黃芩的黃芩素具有抗感染、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用，參與調(diào)節(jié)多種炎癥信號(hào)通路，兼具高效、無(wú)毒、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，有望成為治療UC的潛在藥物。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠飲用3.5%的DSS溶液后會(huì)出現(xiàn)明顯的急性結(jié)腸炎表現(xiàn)，如嚴(yán)重的腹瀉、便血、體質(zhì)量下降、結(jié)腸短縮等，這與既往的報(bào)道基本相符[8]。5-ASA作為經(jīng)典的UC治療藥物，被多項(xiàng)動(dòng)物研究用于治療DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎，并具備一定的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，口服黃芩素和5-ASA能夠顯著改善結(jié)腸炎小鼠的腸道炎癥，增加小鼠體質(zhì)量及結(jié)腸長(zhǎng)度，降低DAI和HAI評(píng)分。本研究還發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎組小鼠較對(duì)照組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)的腸道潰瘍更大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目更多、程度更深、范圍更廣，且結(jié)腸炎組小鼠的結(jié)腸組織中IFN-γ、TNF-α、IL-1β及MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組小鼠。本研究還發(fā)現(xiàn)Ba-H治療組結(jié)腸組織中IFN-γ、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平顯著低于結(jié)腸炎組小鼠，且Ba-L治療組、Ba-H治療組和5-ASA治療組小鼠結(jié)腸組織中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平亦均低于結(jié)腸炎組，但Ba-L治療組、Ba-H治療組和5-ASA治療組間上述炎性細(xì)胞因子和TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述研究結(jié)果提示黃芩素和經(jīng)典藥物5-ASA在該模型中顯示出相似的治療效果，各治療組間DAI、HAI以及結(jié)腸炎癥細(xì)胞因子水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在UC的發(fā)病過(guò)程中，腸上皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞中異常激活的TLR4/NF-κB信號(hào)是重要的炎癥啟動(dòng)因素，會(huì)導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞因子的釋放，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等，最終引起不可逆的腸道炎癥反應(yīng)[12]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)在多種炎癥性疾病中發(fā)揮作用。WANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)程，在阻塞性腎病過(guò)程中發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)，黃芩素可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路緩解小鼠腸缺血/再灌注導(dǎo)致的急性肺損傷[14]。黃芩素還可能抑制哮喘的免疫-過(guò)敏-炎癥反應(yīng)而有望成為治療哮喘的新型候選藥物[15]。此外，HE等[16]發(fā)現(xiàn)黃芩素能通過(guò)抑制NF-κB活化緩解脂多糖誘導(dǎo)的急性乳腺炎。本研究不僅發(fā)現(xiàn)各治療組小鼠結(jié)腸組織中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平均低于結(jié)腸炎組，而且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎組小鼠結(jié)腸組織中腸上皮細(xì)胞中NF-κB的入核率均高于對(duì)照組，5-ASA治療組、Ba-L治療組及Ba-H治療組的結(jié)腸組織中腸上皮細(xì)胞中NF-κB的入核率均低于結(jié)腸炎組。目前黃芩素對(duì)于結(jié)腸炎的治療作用也開始逐漸受到重視。李敏瑤等[17]研究提示黃芩湯中的黃酮類化合物可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥通路在UC治療中發(fā)揮重要作用。王繼森等[18]在研究黃芩湯對(duì)UC大鼠的作用中發(fā)現(xiàn)其有效成分通過(guò)降低細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平抑制實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠的腸道炎癥。研究還發(fā)現(xiàn)黃芩素不僅可以修復(fù)結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織黏膜屏障，還可以通過(guò)抑制NF-κB的活性，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)而達(dá)到抗炎效應(yīng)[19]。

本研究結(jié)果和上述學(xué)者的研究共同提示，黃芩素可能通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制小鼠結(jié)腸炎。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可能通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥。本研究中黃芩素在對(duì)小鼠的治療中發(fā)揮顯著的抑炎作用，并且黃芩素相較于傳統(tǒng)的5-ASA制劑具有安全、無(wú)毒等優(yōu)勢(shì)，未來(lái)可能在UC的臨床治療中發(fā)揮潛在的應(yīng)用價(jià)值。