洪子璞，張文振，陳聰德

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.創(chuàng)面外科；2.小兒外科

胚胎及出生個體的生長發(fā)育是個相當復雜的過程，涉及到多個系統(tǒng)及組織。其中，內分泌系統(tǒng)的多種激素的缺欠可以導致生長發(fā)育遲滯。斑馬魚飼養(yǎng)成本低，便于大規(guī)模養(yǎng)殖，同時由于體外受精，體外發(fā)育，且其發(fā)育周期短，透明易觀察，與人類相關的84%疾病基因在斑馬魚體內均能表達[1]，正日漸成為重要的模式動物[2]。ELAVL1又名HUR，是一種可在細胞核內編碼的RNA結合蛋白，在機體內全身性表達，除了對細胞增殖、分化具有重要的作用之外[3]，近期還有研究顯示它可以影響腸神經系統(tǒng)發(fā)育[4]，也可能影響甲狀腺激素及生長激素的分泌及生理作用[5-6]，以上均提示ELAVL1的表達異常將可能引起生長發(fā)育障礙。為了探究ELAVL1對個體發(fā)育及生長的影響，本文通過運用CRISP-Cas9技術定向敲除斑馬魚5個核苷酸序列，從而提前終止蛋白翻譯來影響elavl1a蛋白的表達，來獲得斑馬魚敲除elavl1a后生長發(fā)育遲滯的模型，并為后續(xù)探究其可能的機制做前期工作。

1 材料和方法

1.1 動物及飼養(yǎng)繁育材料 野生AB型斑馬魚品系（D.rerio）從國家斑馬魚資源中心購買，參照斑馬魚手冊進行標準化養(yǎng)殖[7]。野生型和突變型胚胎在胚胎培養(yǎng)液（E3：0.5 mmol/L氯化鈉，0.17 mmol/L氯化鉀，0.33 mmol/L氯化鈣，0.33 mmol/L氯化鎂）中于28.5 ℃進行培育。按照10 L的水缸放置15條成魚的標準養(yǎng)殖，在14 h光照、10 h黑暗的周期下，每天進行循環(huán)換水。產卵前，提前1 d將魚按照雌雄1∶1的比例放入一個水槽中并用隔板分開，第2天燈亮后拔出隔板進行交配。2個月以上的斑馬魚通過剪尾鰭提取DNA進行基因型鑒定。

1.2 主要試劑與儀器 Taq DNA聚合酶、T7 RNA Polymerase-PlusTMEnzyme Mix、Nanodrop2000/2000C分光光度計購于美國Thermo Fisher公司，Pyrobest DNA Polymerase、dNTP購于日本TAKARA公司，DR274質粒與MLM3613質粒購于美國Addgene公司。所有引物合成和DNA序列測定均由上海邁浦生物科技有限公司進行。

1.3elavl1agRNA靶點設計 通過gRNA在線設計工具CHOPCHOP（http∶//chopchop.cbu.uib.no/）查找gRNA序列。同時在NCBI（https∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/）驗證相應序列，并根據靶點設計上下游引物，送上海邁浦生物科技有限公司合成。靶點序列及上下游引物見表1。

表1 斑馬魚elavl1a敲除靶點及引物

1.4 gRNA mRNA與Cas9 mRNA合成 參照DR274質粒2～4 ng，P1 引物（10 μmol/L）1 μL，P4 引物（10 μmol/L）1 μL，pryobest DNAPolymerase緩沖液6 μL，pryobest DNA Polymerase 0.5 μL，加入適量的滅菌水至60 μL，PCR反應按照95 ℃ 30 s；35×（95 ℃ 30 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s）；72 ℃ 10 min；16 ℃進行。PCR產物在1%瓊脂糖膠電泳30 min，觀察PCR結果。

苯酚-氯仿純合模板DNA后參照NTP（10 mmol/L）1 μL，10×反應緩沖液2 μL，模板DNA 0.2～1 μg，T7 RNA Polymerase-PlusTMEnzyme Mix 2 μL，RNase inhibitor 1 μL，加入DEPC水至20 μL，37 ℃反應3 h。反應完成后沉淀并純化gRNA，檢測濃度后，DECP水稀釋后分裝存于-80 ℃冰箱。

將MLM3613質粒線性化后，參照合成gRNA mRNA方法合成Cas9 mRNA，檢測濃度后，DECP水稀釋后分裝存于-80 ℃冰箱以備使用。

1.5 顯微注射 將轉錄獲得的gRNA與Cas9 mRNA按照100 ng/μL∶150 ng/μL的比例稀釋。在斑馬魚胚胎處于單細胞時期進行顯微注射，每個胚胎注射體積為2 nL。注射后使用胚胎培養(yǎng)液收集于28.5 ℃培養(yǎng)箱培育，第4天隨機挑出10個胚胎使用基因裂解液[在984 μL滅菌水中加入Tris Hcl（pH 8.0）100 μL，EDTA 40 μL，Triton 100% 20 μL混勻]裂解，使用P3與P4引物進行PCR擴增，PCR反應條件按照95 ℃ 30 s；35×（95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s）；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。2%瓊脂糖膠電泳30 min，觀察PCR結果。送上海邁浦生物科技有限公司測序，以野生AB型斑馬魚為對照組，根據測序峰圖分析gRNA工作情況與顯微注射結果，并進行相應調整。

1.6 突變體篩選 2個月大小的F0代斑馬魚通過分離魚鰭裂解基因組DNA，使用P3與P4引物進行PCR擴增后送上海邁浦生物科技有限公司測序。根據峰圖選取敲除效果較好的斑馬魚與野生型AB品系斑馬魚進行測交獲得F1 代，F1 代同樣通過測序或者使用NEBcutter查詢酶切位點（http∶//nc2.neb.com/NEBcutter2/）篩選出突變位點相同的斑馬魚進行自交獲得F2 代，F2 代同樣通過測序或者使用NEBcutter查詢酶切位點篩選出純合突變體。

1.7 Western blot 分離野生型斑馬魚與突變體斑馬魚魚鰭，加入內含0.1%磷酸酶抑制劑和0.1%蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，通過碾磨裂解蛋白，4 ℃預冷離心機15 000 r/min離心30 min后收取上清。BCA法檢測蛋白濃度，加入適量上樣緩沖液后95 ℃變性5 min，上樣進行電泳。

1.8 統(tǒng)計學處理方法 使用SPSS25.0進行統(tǒng)計學分析，ApE工具進行核苷酸序列和氨基酸對比分析。Image J工具分析Western blot結果。采用Adobe Photoshop CC 2019工具進行圖像處理。

2 結果

2.1elavl1a突變體斑馬魚gRNA的設計 通過gRNA在線設計工具CHOPCHOP輸入目標基因尋找序列，通過NCBI比對后選擇合適的目標位點及引物，最后在第2個外顯子上得到目標設計位點（見圖1）。

2.2elavl1a突變體斑馬魚繁殖鑒定 將CRISPRCas9技術構建取得的elavl1aF0代突變體斑馬魚與野生型斑馬魚雜交，得到F1代突變體斑馬魚，通過基因型測定和外送測序得到同一型F1代突變體，再通過自交，經基因鑒定和外送測序得到F2代純合子，elavl1a-/-突變體基因型鑒定沒有拖帶，測序發(fā)現elavl1a-/-I型突變體斑馬魚缺少5 個核苷酸，II型突變體斑馬魚缺少10個核苷酸（見圖2）。

2.3elavl1a-/-突變體斑馬魚的鑒定 通過APE軟件分析，以I型為例，得到的elavl1a-/-突變體斑馬魚氨基酸提前出現終止密碼，且Western blot檢測發(fā)現蛋白表達減少（見圖3）。

2.4elavl1a-/-突變體斑馬魚數量表型統(tǒng)計 統(tǒng)計分析獲得的成年F2代斑馬魚數量，發(fā)現其中野生型和雜合子與elavl1a-/-純合子數量之間不符合1∶2∶1的孟德爾遺傳規(guī)律（見表2），且對同一批產的突變體斑馬魚的進行形態(tài)觀察后發(fā)現，elavl1a-/-純合子斑馬魚存在明顯的發(fā)育遲緩（見圖4）。

表2 兩種elavl1a-/-突變體斑馬F2代數量統(tǒng)計圖

3 討論

隨著CRISPR-Cas9技術在細胞及發(fā)育生物學的應用，大量新的研究方法產生。在動物模型基因敲除突變體的構建中，CRISPR-Cas9同樣也適用于同源基因的敲入[8]和F0 代基因序列的篩查[9]。因此我們根據基因數據庫查找elavl1a的基因序列，并設計相對應的gRNA序列，通過顯微注射入斑馬魚胚胎中。最近研究顯示有其他Cas蛋白可用于編輯DNA（Cas12a）[10]和RNA（Cas13）[11]，我們所設計的gRNA通過CRISPR-Cas9能夠成功地敲除elavl1a第2個外顯子部分序列，并通過PCR跑膠和基因測序驗證所敲除基因序列的確切位置，PCR跑膠后出現兩條的說明為雜合子序列，單個基因條帶為敲除純合子或者野生型斑馬魚，再通過基因測序峰圖能清楚驗證基因敲除結果。

測序結果表明，該CRISPR-Cas9可以誘導序列的敲除，I型elavl1a-/-突變體成功敲除5 個核苷酸序列，II型elavl1a-/-突變體敲除10個核苷酸，通過與野生型斑馬魚基因組比對分析發(fā)現，所敲除核苷酸序列能使終止密碼子提前，從而減少elavl1a蛋白的表達，影響elavl1a蛋白在機體內的功能。我們通過Western blot技術驗證敲除elavl1a后蛋白的表達情況，其結果如我們前期預測的elavl1a蛋白表達量明顯降低。

ELAVL1/HuR是RNA結合蛋白ELAVL1/Hu家族的四個成員之一，其他的家族成員HuB、HuC和HuD主要在神經元中表達，上述三類基因可以誘導神經元分化，繼而促進神經元發(fā)育與成熟，且HuC和HuD的抗體可以作為神經標記物[12]。本課題組已發(fā)表的研究證明，elavl1a是斑馬魚腸神經發(fā)育過程中重要基因，通過morpholino特異性敲降elavl1a會減少斑馬魚幼魚腸神經元細胞數量[4]。腸神經系統(tǒng)通過調節(jié)胰島素、胰高血糖素、多肽等，對調節(jié)個體營養(yǎng)發(fā)育起到重要作用[13]。因此，敲除elavl1a，可能會影響斑馬魚腸神經系統(tǒng)的發(fā)育，從而影響胃腸運動或內分泌代謝與營養(yǎng)吸收，進而導致大量死亡，且少部分發(fā)育遲滯。通過培育出的elavl1a缺失的模型，可以進一步進行這一基因對腸神經系統(tǒng)的機制及影響的研究。

既往的研究表明，elavl1a可以通過調節(jié)RNA轉錄后調控網絡和發(fā)揮免疫活性蛋白等作用，對斑馬魚早期胚胎形成保護起到重要作用[14-15]。elavl1a可以通過gata1和PKC之間的調控調節(jié)斑馬魚的紅細胞生成[16-17]。本課題組前期研究表明在腫瘤細胞中敲降ELAVL1后會抑制細胞增殖[18]。既往已有多項研究提示ELAVL1在甲狀腺惡性腫瘤中高度表達，對細胞增殖存在促進作用，有研究顯示ELAVL1表達量與甲狀腺濾泡細胞增殖率呈正相關[19]，相反的，沉默ELAVL1后可導致非腫瘤的甲狀腺細胞系細胞活性減低并凋亡[5]。因此，敲除ELAVL1后，可能會影響斑馬魚甲狀腺細胞的發(fā)育，從而影響甲狀腺激素的合成及分泌，進而導致發(fā)育遲滯。有研究報道PAI2聚集能加速人類生長激素mRNA的降解，PAI2 mRNA在機體內極不穩(wěn)定，半衰期僅為1 h，ELAVL1能與PAI2-3’UTR區(qū)域AU富集區(qū)域結合，穩(wěn)定PAI2 mRNA的表達[6]，從而我們推測由于敲除了斑馬魚體內的elavl1a基因，導致PAI2在體內自身的不穩(wěn)定，會不斷合成新的PAI2 mRNA，從而能不斷促使生長激素mRNA降解，導致缺乏生長激素使得斑馬魚的生長發(fā)育受到限制。elavl1a缺失的模型可以對斑馬魚生長發(fā)育遲緩原因進行進一步研究。

綜上所述，本研究通過CRISPR-Cas9技術構建突變體斑馬魚，測序發(fā)現敲除的序列能使蛋白翻譯的終止密碼提前。通過酶切位點分析及基因序列測序分析篩查轉基因斑馬魚，并通過Western blot發(fā)現，突變體斑馬魚elavl1a蛋白明顯降低，從而成功驗證了elavl1a在斑馬魚模型中的基因及蛋白敲除。最后我們通過統(tǒng)計分析成功構建轉基因斑馬魚的數目，發(fā)現轉基因斑馬魚并未遵循孟德爾遺傳定律，純合子數目明顯偏少，這可能是因為elavl1a敲除后影響斑馬魚腸神經系統(tǒng)和胚胎發(fā)育，從而影響轉基因斑馬魚數目。通過存活斑馬魚表型分析發(fā)現，純合子敲除斑馬魚個體明顯小于雜合子個體，進一步說明elavl1a對斑馬魚發(fā)育起重要作用，且這種作用可能是通過影響包括腸神經系統(tǒng)和甲狀腺激素及生長激素在內的激素而達成，但仍需有后續(xù)的工作進一步去闡釋可能機制。綜上，此次研究為我們后續(xù)研究elavl1a在斑馬魚內機體功能研究提供了研究基礎。