張倡銘，邊月紅，張 欣，曹永芝

(山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心，山東 濟(jì)南 250012)

生物樣本庫是在知情同意前提下按照標(biāo)準(zhǔn)化程序采集、保存、使用各種人體的生命支持和代謝及其衍生物組分等信息，用于臨床疾病治療和實(shí)驗(yàn)室研究的科學(xué)管理系統(tǒng)，也叫生物銀行[1]。生殖?？漆t(yī)院擁有豐富的生殖相關(guān)疾病臨床資源，建立科學(xué)、規(guī)范、高效的?？粕飿颖編欤軌?yàn)樯辰】抵虏C(jī)制的研究和診療新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，從而為臨床基礎(chǔ)研究提供強(qiáng)力支撐。本文主要介紹了生殖?？茦颖編斓慕ㄔO(shè)經(jīng)驗(yàn)。

1 生殖?？茦颖編旖ㄔO(shè)概述

1.1建立質(zhì)量控制體系

1.1.1建立規(guī)范的質(zhì)量控制文件 樣本庫需要按照中國人類遺傳資源辦公室“人類遺傳資源采集、收集、買賣、出口、出境審批”的要求申請(qǐng)?jiān)擁?xiàng)認(rèn)證。該認(rèn)證對(duì)于加強(qiáng)人類遺傳資源的規(guī)范化管理，有效保護(hù)和合理利用人類遺傳資源提供了法律依據(jù)。按照ISO20387生物樣本庫國際標(biāo)準(zhǔn)和中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)化達(dá)標(biāo)文件要求，建立符合本單位的質(zhì)量控制文件，涵蓋質(zhì)量手冊(cè)、程序性文件、標(biāo)準(zhǔn)操作程序和原始記錄[2]，涉及出入庫、運(yùn)輸、分裝、質(zhì)量控制、銷毀、安全、后勤、行政等方面[3-4]。

1.1.2完善組織構(gòu)架，實(shí)現(xiàn)專人專崗管理 樣本庫應(yīng)依托所在醫(yī)院的學(xué)術(shù)委員會(huì)、倫理委員會(huì)，并設(shè)立專門的管理委員會(huì)。樣本收集和使用前召開學(xué)術(shù)論證會(huì)，在符合國家法律要求和倫理學(xué)規(guī)范的前提下，有針對(duì)性地收集和使用樣本。樣本庫設(shè)置固定工作人員，明確每位工作人員崗位職責(zé)，設(shè)置主任、樣本管理、質(zhì)量管理、信息管理和辦公室等崗位，建立細(xì)化的工作量考核標(biāo)準(zhǔn)，樹立為科研人員服務(wù)的工作理念。

1.1.3合理設(shè)置功能分區(qū)，完善運(yùn)行設(shè)施 樣本庫應(yīng)分為樣本制備區(qū)、樣本質(zhì)控區(qū)、低溫區(qū)、超低溫區(qū)和深低溫區(qū)等功能區(qū)，其中樣本接收區(qū)主要完成樣本接收后基本信息的采集和核對(duì)，樣本處理區(qū)主要完成對(duì)樣本的多級(jí)核對(duì)和各組分離，樣本制備區(qū)主要完成樣本的分裝、核酸提取等。超低溫區(qū)和深低溫區(qū)最好設(shè)置在1樓或加固承重的樓層，具有備用電源。配備自動(dòng)化分裝、自動(dòng)核酸提取和核酸質(zhì)量檢測(cè)等設(shè)備。樣本庫設(shè)置獨(dú)立的門禁系統(tǒng)、視頻監(jiān)控系統(tǒng)、遠(yuǎn)程溫度監(jiān)控報(bào)警系統(tǒng)和獨(dú)立通風(fēng)裝置，確保樣本安全。

1.1.4加強(qiáng)運(yùn)行權(quán)限與倫理管理 樣本出入庫應(yīng)采用3級(jí)審批制度，根據(jù)不同管理級(jí)別設(shè)置不同權(quán)限。對(duì)樣本收集實(shí)行嚴(yán)格的倫理學(xué)審批，每份樣本附有《生物樣本采集知情同意書》，保證樣本的合法性，以發(fā)揮最大的科研價(jià)值[5]。

1.1.5做好信息化建設(shè) 樣本庫要在規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；喜粩嗵岣?，需要建立完備的收集、隨訪、儲(chǔ)存、信息化管理體系，實(shí)現(xiàn)臨床信息、樣本信息和科研信息的數(shù)字化管理。數(shù)據(jù)資源管理層主要由生物樣本資源數(shù)據(jù)庫、科研數(shù)據(jù)庫、臨床信息數(shù)據(jù)庫、隨訪數(shù)據(jù)庫和用戶數(shù)據(jù)庫組成，其功能包括但不限于：捐贈(zèng)者身份信息和臨床信息采集、自主調(diào)查問卷設(shè)計(jì)、病例隨訪、管理硬件設(shè)備、耗材及生物樣本采集、處理、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)?，并能夠從第三方系統(tǒng)[醫(yī)院信息系統(tǒng)(HIS)、檢驗(yàn)信息系統(tǒng)(LIS)等]中產(chǎn)生相關(guān)的捐贈(zèng)者數(shù)據(jù)庫。建議所有樣本采用二維碼標(biāo)識(shí)和全過程跟蹤，根據(jù)工作需要持續(xù)升級(jí)信息化管理系統(tǒng)，并且與醫(yī)院的HIS、LIS系統(tǒng)對(duì)接，對(duì)樣本采集、樣本轉(zhuǎn)運(yùn)、臨床診療、樣本檢驗(yàn)、樣本制備存儲(chǔ)、樣本使用、隨訪和設(shè)備使用等信息進(jìn)行全方面管理，并結(jié)合樣本使用者情況實(shí)現(xiàn)平臺(tái)信息共享和多中心信息共享[6]。研究生離校前將樣本相關(guān)科研信息全部留存樣本庫，逐步建立樣本科研信息知識(shí)庫，便于后續(xù)研究人員調(diào)閱和使用。

1.2樣本的收集與處理

1.2.1臨床資料信息管理 對(duì)臨床匯總信息、入庫信息、紙質(zhì)臨床資料、知情同意書、樣本運(yùn)輸信息、樣本出庫信息等進(jìn)行權(quán)限化分級(jí)管理，避免秩序混亂、信息泄露和樣本信息使用不暢，提高樣本出入庫效率。知情同意書的內(nèi)容和格式經(jīng)過倫理小組制定并交由院倫理委員會(huì)審查，確保捐獻(xiàn)者知情權(quán)，并充分保護(hù)捐獻(xiàn)者隱私。

1.2.2血液樣本采集與處理 采用1支抗凝血和1支自凝血(采血管無添加劑)采集血液樣本，每支5 mL。抗凝血確保血液與抗凝劑充分混合，自凝血常溫放置15 min后處理，2 530 r/min離心10 min。利用自動(dòng)化分裝設(shè)備提取血漿、血清、有核細(xì)胞層(有核細(xì)胞層分2管，血漿、血清為4管，每管0.5 mL)，將2管血漿和血清分別儲(chǔ)存于氣相液氮罐，其余儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。所有血液樣本采用分區(qū)備份儲(chǔ)存[7]。

1.2.3顆粒細(xì)胞、卵泡液樣本采集與處理 主要采集卵壁顆粒細(xì)胞樣本及其卵泡液。壁顆粒細(xì)胞處理：采集行輔助生殖取卵術(shù)后液體，2 000 r/min離心10 min，收集上清卵泡液，每管5 mL，分2管保存至-80 ℃冰箱。沉淀后加入1 mL透明質(zhì)酸酶，輕輕震蕩，放入37 ℃水浴鍋30 min，然后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，加入3.5 mL淋巴細(xì)胞分離液。將水浴的混合物移入淋巴細(xì)胞分離液上層，1 600 r/min離心10 min。用一次性吸管將中層液面漂浮的顆粒細(xì)胞吸出，均分為2份，分裝至RNA-free凍存管，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，顛倒混勻，以8 000 r/min離心3 min，棄上清液，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4組織樣本的采集與處理 采集胎盤、臍帶、卵巢、子宮內(nèi)膜、附睪穿刺物、蛻膜、絨毛等樣本，樣本取材完成后分別置于RNAlater、液氮、4%多聚甲醛中保存。為有效保證樣本質(zhì)量，組織離體到有效保存所用時(shí)間不得超過30 min[8]。

1.2.5尿液樣本的采集與處理 所收取的尿液樣本有晨尿、隨機(jī)尿、計(jì)時(shí)尿(一般為24 h)、中段尿，尿量為15 mL。采集后使用帶底部二維碼的凍存管分裝，并根據(jù)信息系統(tǒng)分配的位置凍存于-80 ℃冰箱中。部分實(shí)驗(yàn)室采取硝酸纖維膜真空抽濾的方式對(duì)尿液內(nèi)細(xì)胞和蛋白成分進(jìn)行膜上保存，具體操作如下：將尿液以3 600 r/min離心10 min，取上清液按照2∶1比例與PBS混勻,然后經(jīng)0.2 μm的磷酸纖維膜真空抽濾后吹干，于無菌袋中抽真空保存[9]。

1.2.6核酸樣本的制備 基因組DNA提取的方法有很多種，如酚-氯仿法、異硫氰酸胍法、固相吸附法、高鹽沉淀法和碘化物法等[10]。RNA提取主要為Trizol法和磁珠法[11]。檢測(cè)RNA樣本濃度、純度和完整性，以二維碼標(biāo)記后入庫。DNA樣本儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，RNA樣本保存于液氮中。在避免樣本反復(fù)凍融前提下，每半年進(jìn)行1次核酸抽樣質(zhì)檢，抽檢比例不低于1/100，并生成質(zhì)控報(bào)告。

1.3樣本的質(zhì)控 (1)血液樣本的質(zhì)控：血液樣本以核酸質(zhì)控為主，以O(shè)D260 nm/OD280 nm,OD260 nm/OD230 nm比值檢測(cè)核酸的純度，采用分光光度計(jì)定量檢測(cè)核酸的濃度，采用安捷倫4200檢測(cè)核酸的完整性。(2)組織樣本的質(zhì)控：組織樣本在冷缺血30 min內(nèi)迅速分裝和轉(zhuǎn)移至液氮中是保證樣本質(zhì)量的必要條件，其可以有效地避免RNA及其蛋白質(zhì)的降解。如后續(xù)實(shí)驗(yàn)涉及RNA分析，應(yīng)將離體組織迅速轉(zhuǎn)移到RNAlater中保存。樣本庫通過蘇木素-伊紅染色對(duì)組織樣本的形態(tài)學(xué)進(jìn)行評(píng)估。提取RNA檢測(cè)其濃度、純度和完整性，并進(jìn)行熒光定量分析。(3)尿液樣本的質(zhì)控：目前，關(guān)于尿液樣本的質(zhì)控報(bào)道較少見。多數(shù)樣本庫主要采取-80 ℃保存方法，但隨著保存時(shí)間的延長，尿液樣本的酸堿度、小分子物質(zhì)會(huì)發(fā)生改變或消失。有研究報(bào)道，在-80、-20、4、20 ℃條件下保存的樣本經(jīng)過0、4、8、24 h后，尿液樣本中不同種類的氨基酸(絲氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸)濃度會(huì)受到影響，其中-80 ℃保存效果最佳[12]。另外，反復(fù)凍融對(duì)尿液樣本代謝產(chǎn)物濃度會(huì)構(gòu)成影響，因此在尿液樣本保存過程中，應(yīng)盡量以-80 ℃保存，并減少反復(fù)凍融次數(shù)。(4)樣本信息質(zhì)控：樣本庫每季度對(duì)所存樣本信息進(jìn)行抽樣，對(duì)樣本所存位置是否準(zhǔn)確、患者信息是否完整、隨訪信息是否完整、知情同意書是否完備、條碼是否完整、虛擬位置與實(shí)體位置是否一致等信息進(jìn)行檢查。(5)樣本庫的第三方質(zhì)控：生物樣本庫應(yīng)積極開展國內(nèi)、國際第三方質(zhì)控，以保證樣本質(zhì)量。

2 生殖?？茦颖編旖ㄔO(shè)存在的問題及建議

2.1存在的問題 因患者回訪率高等因素，樣本數(shù)量持續(xù)增加，造成儲(chǔ)存空間不足。生物樣本庫建設(shè)中仍然需要從人才、資金、技術(shù)方面提供支持，需要政府和各參與方引起重視，保障其可持續(xù)發(fā)展[13]。生物樣本庫的發(fā)展需要標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，其高度依賴信息化建設(shè)，離不開多中心聯(lián)盟和資源共享，需多學(xué)科融合支撐[14]。生殖樣本收集涉及科室較多，各收集環(huán)節(jié)銜接溝通需要樣本庫執(zhí)行委員會(huì)統(tǒng)一協(xié)調(diào)。不設(shè)置婦產(chǎn)科的生殖?？漆t(yī)院，樣本收取存在非本院本地等情況。因此，采集及運(yùn)輸過程需要加強(qiáng)監(jiān)管，保證取材、處理和運(yùn)輸?shù)馁|(zhì)量，做到寧缺毋濫。

2.2建議

2.2.1科學(xué)的樣本質(zhì)量控制是關(guān)鍵 影響樣本質(zhì)量的因素非常多，而樣本質(zhì)量直接關(guān)系到科研數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，因此加強(qiáng)生物樣本庫標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)顯得至關(guān)重要。近年來，國內(nèi)和國際的樣本庫標(biāo)準(zhǔn)化組織不斷對(duì)樣本收集過程中的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行完善[15]。目前，我國尚未建立國家層面的生物樣本庫，因此應(yīng)更好地根據(jù)國情建立適應(yīng)人民需要及適應(yīng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的生物樣本庫[16]。從事樣本庫建設(shè)的工作人員應(yīng)該不斷學(xué)習(xí)，完善樣本收取流程，使樣本庫更科學(xué)、更貼近于臨床和科研需求。

2.2.2信息庫整合是樣本庫質(zhì)量控制的紐帶 信息庫建設(shè)是保證生物樣本質(zhì)量、信息注釋和樣本應(yīng)用的紐帶。生物樣本庫發(fā)展已從“以樣本為中心”轉(zhuǎn)變?yōu)椤耙詳?shù)據(jù)為中心”，最終形成綜合性生物信息資源平臺(tái)，這樣才能夠更好地為科學(xué)研究服務(wù)，便于研究人員探討生物樣本所涉及的醫(yī)學(xué)倫理、臨床溝通及社會(huì)問題[17]。未來生物樣本庫的內(nèi)涵建設(shè)更需要聚焦于樣本本身的科學(xué)研究,即樣本科學(xué)[18]。通過大樣本的關(guān)聯(lián)分析，打造生命科學(xué)研究發(fā)展和國際合作的基礎(chǔ)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)樣本庫的質(zhì)量管理、信息數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)化與標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)共享，建立臨床信息、樣本信息、隨訪信息和科研信息相關(guān)聯(lián)的信息化系統(tǒng)平臺(tái)，為預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸提供強(qiáng)力支撐。

3 小 結(jié)

生物樣本庫是為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)提供強(qiáng)力支持的新型學(xué)科。近年來，我國?？粕飿颖編彀l(fā)展迅速，但是仍然有許多瓶頸需要突破。完整、全流程的質(zhì)量控制體系，可保證樣本質(zhì)量。本文概述了生殖專科樣本庫建設(shè)過程，從生物樣本實(shí)體庫規(guī)范采集、儲(chǔ)存、質(zhì)控和出庫等環(huán)節(jié)，以及臨床信息、樣本信息、科研信息和隨訪信息等要素的整合方面進(jìn)行了討論，并探討了生殖?？茦颖編旖ㄔO(shè)中存在的問題及應(yīng)對(duì)策略，希望為該學(xué)科生物樣本庫的建設(shè)提供參考。