蔡 猛,樊根濤,黃劍浩綜述,周光新審校

0 引 言

作為兒童和青少年中第二大常見的骨與軟組織腫瘤，尤文肉瘤是一種惡性小圓細(xì)胞性腫瘤[1]，常由染色體異位引起，該異位導(dǎo)致FET家族(FUS、EWSR1和TAF15)和ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員融合，其中EWSR1-FLI1基因融合是最常見的[2]。目前尤文肉瘤的治療以手術(shù)、化療和放射治療為主。盡管隨著化療方案、外科手術(shù)和放射療法的進(jìn)展，局限性腫瘤患者的5年生存率已提高至65%～75%，但晚期患者和轉(zhuǎn)移患者的5年生存率仍普遍低于30%，預(yù)后較差[3-4]。

MicroRNAs(MiRNAs)是一種內(nèi)源性的非編碼小RNA分子，約19～22個(gè)核苷酸大小，其廣泛存在于動(dòng)植物以及部分病毒中，通過與特定的基因序列結(jié)合來改變蛋白質(zhì)編碼基因在mRNA水平的表達(dá)[5]。miRNAs在包括尤文肉瘤在內(nèi)的多個(gè)腫瘤中參與了廣泛的生物學(xué)過程，如增殖、侵襲、分化和凋亡等[6-7]。miRNAs主要通過改變靶基因在mRNA水平的表達(dá)來發(fā)揮其作為原癌基因或抑癌基因的作用[8-10]。

1 miRNAs在尤文肉瘤中的差異化表達(dá)

已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了在尤文肉瘤組織與正常組織、尤文肉瘤細(xì)胞和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA。Mosakhani等[11]對(duì)尤文肉瘤異種移植和對(duì)照組織的微矩陣分析顯示，miR-106b、miR-93、miR-181b、miR-101、miR-30b在異種移植組織中高表達(dá)，而miR-145、miR-193a-3p、miR-100、miR-22、miR-21、miR-574-3p則低表達(dá)。隨后Liu等[12]在A673和RD-ES等4個(gè)細(xì)胞系中證實(shí)了miR-21的低表達(dá)，而De等[13]對(duì)細(xì)胞系微陣列分析顯示let-7a低表達(dá)。Karnuth等[14]檢測(cè)并比較了40例尤文肉瘤組織、6個(gè)細(xì)胞系、6例健康人來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)，19個(gè)miRNA顯著上調(diào)，包括miR-126, miR-146b-5p, miR-501-5p等，16個(gè)miRNA顯著下調(diào)，包括miR-31, miR-137, miR-138等。Li等[15]發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p在尤文肉瘤細(xì)胞系(A673/TC252)中顯著低表達(dá)。Kawano等[16]對(duì)5個(gè)尤文肉瘤細(xì)胞系和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用miRNA微矩陣分析，let-7a、miR-16、miR-29b、miR-138、miR-301a等在尤文肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)顯著下調(diào)，而miR-181c顯著上調(diào)。Parafioriti等[17]通過微矩陣分析比較了20例尤文肉瘤患者石蠟包埋腫瘤組織和正常人人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，58個(gè)mIRNA存在顯著差異，其中miR-181b、miR-1915和miR-1275的失調(diào)控得到了RT-qPCR的驗(yàn)證。

除了基因表達(dá)譜分析，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)也被廣泛的應(yīng)用于探索尤文肉瘤中差異表達(dá)的miRNAs。如miR-107和miR-638，研究表明其在尤文肉瘤細(xì)胞系中存在顯著的低表達(dá)[18-19]。在組織中，Roberto等[20-21]通過RT-qPCR比較19例腫瘤組織和12例正常組織中miRNAs的表達(dá)水平，先后發(fā)現(xiàn)miR-708-5p，miR-124-3p, miR-139-5p和miR-335-3p在尤文肉瘤中顯著低表達(dá)。相比于51例尤文肉瘤轉(zhuǎn)移組織，miR-199a-3p在62例局部的未處理原發(fā)腫瘤中具有較高的表達(dá)水平[22]。在Kawano和Parafioriti等的微矩陣分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，最近的研究進(jìn)一步證實(shí)了miR-146b-5p在ES組織和細(xì)胞中顯著高表達(dá)[23]。這些研究揭示了多個(gè)在尤文肉瘤中差異表達(dá)的miRNAs，它們往往參與了對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)亡、和侵襲等的調(diào)控，進(jìn)而影響尤文肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。

2 miRNAs對(duì)尤文肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

多個(gè)miRNAs在尤文肉瘤中受EWS-FLl-1調(diào)控進(jìn)而發(fā)揮促癌或抑癌的生物學(xué)功能。如miRs(100, 125b, 22, 221/222, 27a，29a)在尤文肉瘤中的表達(dá)受EWS/FLl1抑制，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)IGF通路，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[24]。作為一個(gè)在尤文肉瘤細(xì)胞系中低表達(dá)的miRNAs，let-7a同樣受EWS-FLl-1直接靶向影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。通過皮下注射過表達(dá)let-7a的尤文肉瘤細(xì)胞(A673 和 TC252)，可見小鼠腫瘤重量顯著下降，腫瘤的生長(zhǎng)被抑制[13]。此外，EWS/FLl1通過抑制miR-708表達(dá)來介導(dǎo)EYA3的上調(diào)，也可發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡功能[20]。

除了受EWS-FLl-1的直接靶向而發(fā)揮功能調(diào)控作用，多個(gè)失調(diào)控的miRNAs作為促癌基因或抑癌基因參與了尤文肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的調(diào)控。以往的研究證實(shí)，通過誘導(dǎo)MiR-34a、miRNA-30a-5p、miR-22的過表達(dá)可顯著降低ES細(xì)胞的增殖能力[25-27]。此外，CCK8試驗(yàn)和凋亡試驗(yàn)顯示，在A673、SK-ES-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染let-7a類似物來上調(diào)let-7a的表達(dá)水平可減少細(xì)胞的增殖，并加快凋亡進(jìn)程[28]。而與之相似的是，在A673轉(zhuǎn)染miR-125b類似物，同樣可引起細(xì)胞增殖的下降和誘導(dǎo)凋亡。且后續(xù)的劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，miR-125b的表達(dá)上調(diào)可抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[29]。在腫瘤細(xì)胞系中瞬轉(zhuǎn)miR-31類似物或miR-31前體，TC-71和WE-68細(xì)胞數(shù)目明顯減少，隨后通過AnnexinV/PI染色和PI染色分析細(xì)胞的凋亡情況，并進(jìn)行流式分析，結(jié)果顯示TC-71中miR-31高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。與HMSCs相比，miR-20b在ES細(xì)胞系中相對(duì)表達(dá)量較高，轉(zhuǎn)染抗miR-20b可抑制ES細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程[30]。Kawano等[31]基于miRNA微矩陣分析進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)抗miR-181c可延緩ES細(xì)胞的生長(zhǎng)和周期進(jìn)程，促進(jìn)ES細(xì)胞凋亡。而隨后的小鼠異種移植模型也證實(shí)miR-20b的抑制導(dǎo)致體內(nèi)ES腫瘤生長(zhǎng)的抑制。Guzel等[32]發(fā)現(xiàn)在TC71和TC106細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-145可抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡和抑制侵襲。而過表達(dá)miR-193b、miR-30d、miR-34b可抑制ES細(xì)胞的增殖和侵襲能力[33-35]。部分miRNAs則作為促癌基因參與尤文肉瘤的生物學(xué)進(jìn)程。研究顯示，在ES細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-301a[36]類似物會(huì)促進(jìn)ES細(xì)胞的增殖，而轉(zhuǎn)染let-7a、miR-16、miR-29a的siRNA則會(huì)抑制SKES1細(xì)胞的增殖(16)?？偟膩碚f，這些研究證實(shí)了miRNAs在尤文肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。除上述的miRNAs,考慮可能存在更廣泛的miRNAs參與腫瘤細(xì)胞增殖和調(diào)亡的調(diào)控，這尚需后續(xù)更多的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

3 化療耐受性

目前，阿霉素、長(zhǎng)春新堿、依托泊苷和培美曲塞等藥物是臨床上化療的主要用藥。Robin等[37]研究顯示miR-708表達(dá)上升可增強(qiáng)A673細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性。Iida等[38]比較耐受阿霉素的VH-64/ADR細(xì)胞和親代VH-64細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)共有46個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中miR-125b在耐受阿霉素的VH-64/ADR和WE-68/ADR細(xì)胞顯著高表達(dá)。而通過抗miR-125b下調(diào)miR-125b表達(dá)可增強(qiáng)EWS細(xì)胞(VH-64，WE-68，RD-ES, SK-ES, TC-71)對(duì)阿霉素的敏感性。在Sciandra等[39]的研究中，miR-34a穩(wěn)定過表達(dá)可增強(qiáng)A673細(xì)胞對(duì)阿霉素和長(zhǎng)春新堿的敏感性。此外，Qu等[23]發(fā)現(xiàn)培美曲塞治療劑量依賴性地抑制miR-146b-5p的表達(dá)進(jìn)而抑制RD-ES細(xì)胞的增殖，這表明培美曲塞在RD-ES細(xì)胞中的抗癌作用可通過調(diào)節(jié)miR-146b-5p的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

4 神經(jīng)分化

此外，部分miRNAs參與了尤文肉瘤細(xì)胞神經(jīng)分化的誘導(dǎo)過程。Ventura等[40]發(fā)現(xiàn)miR-34a在沉默CD99的EWS細(xì)胞系中顯著高表達(dá)，且通過轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物可顯著誘導(dǎo)IOR/CAR細(xì)胞的神經(jīng)分化。隨后De等[22]對(duì)TC-71細(xì)胞來源的沉默CD99的外泌體和表達(dá)CD99的外泌體進(jìn)行微陣列分析，確定了56個(gè)差異化表達(dá)的miRNA，其中miR-199a-3p顯著富集。而轉(zhuǎn)染miR-199a-3p的模擬物同樣可誘導(dǎo)TC-71細(xì)胞的神經(jīng)分化。盡管未對(duì)其他差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)一步研究，但De[22]等認(rèn)為其中可能存在其他miRNA同樣可誘導(dǎo)EWS 細(xì)胞的神經(jīng)分化。這尚需后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的驗(yàn)證。

5 診斷與預(yù)后

miR-34a是EWS診斷與預(yù)后的一個(gè)重要預(yù)測(cè)指標(biāo)。Sciandra等[39]對(duì)20例原發(fā)患者和11例轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行分析，原發(fā)患者血漿中miR-34a的表達(dá)水樣遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)移患者，且循環(huán)miR-34a水平與患者腫瘤大小負(fù)相關(guān)。ROC曲線分析顯示，對(duì)患者血漿miR-34a水平的評(píng)估或許對(duì)于鑒別患者低危和高危是有價(jià)值的。而Nakatani等[25]對(duì)34例原發(fā)EWS患者和21例早期復(fù)發(fā)EWS患者的預(yù)后分析顯示，miR-34a和miR-490-3p的表達(dá)水平與患者的預(yù)后狀況是有緊密聯(lián)系的。無論是EFS還是OS指標(biāo)，miR-34a高表達(dá)都與患者較好的預(yù)后相關(guān)；而miR-490-3p只與OS相關(guān)。而Marino等[41]對(duì)109例非轉(zhuǎn)移患者和17例轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行研究，原發(fā)腫瘤中miR-34a高表達(dá)組患者，有較好的5年無病生存率(74%)、總生存率(83%)。而多因素分析顯示，miR-34a低表達(dá)是腫瘤預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

同樣的，Kosela-Paterczyk等[44]對(duì)8例晚期尤文肉瘤患者和30例健康人的血漿分析進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)存在42個(gè)差異表達(dá)的循環(huán)miRNA，而ROC曲線和AUC分析結(jié)果顯示miR-96-5p,miR-4746-5p,miR-424-5p,miR-323a-3等具有診斷價(jià)值。

Roberto等[22]的研究中發(fā)現(xiàn)，在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、死亡等腫瘤進(jìn)展信號(hào)的患者中，miR-139-5p和miR-584-5p的表達(dá)較低。低表達(dá)的miR-139-5p與尤文肉瘤的疾病進(jìn)程、復(fù)發(fā)和無病生存期的長(zhǎng)短相關(guān)。同樣的，miR-124-3低表達(dá)患者的無病生存期更短。Robin等[37]的研究提示，相比于miR-708高表達(dá)患者，低表達(dá)患者的3年無復(fù)發(fā)生存率較差。但在Robert等[21]近期的研究中，miR-708在組織、細(xì)胞中低表達(dá)，但其與尤文肉瘤患者的預(yù)后因素，如轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和生存率等，未見明顯的相關(guān)性，miR-708對(duì)預(yù)后的影響尚需進(jìn)一步研究。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

綜上所述，miRNA在尤文肉瘤中起到了重要的生物學(xué)作用，不僅對(duì)尤文肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡發(fā)揮功能，還影響著腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。此外，尤文肉瘤對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的分化同樣也發(fā)揮著功能。

盡管局限性腫瘤患者的預(yù)后得到了顯著地改善，但部分患者，尤其是晚期和轉(zhuǎn)移患者的5年生存率至今仍無顯著改善，預(yù)后相對(duì)較差。近年來隨著人們對(duì)miRNA在尤文肉瘤中的研究不斷深入，我們對(duì)其發(fā)病機(jī)理的分子機(jī)制取得了一定的了解，這對(duì)我們尋求更有效的治療方案是極其重要的，但仍需更多的研究去探究miRNA的生物學(xué)作用，并尋找miRNA的潛在臨床應(yīng)用。有理由相信，隨著人們對(duì)miRNA在尤文肉瘤中研究的不斷進(jìn)展，以miRNA作為尤文肉瘤的靶向藥物必將成為未來的趨勢(shì)之一。