劉帥嘉, 李 程, 穆玉理, 郭艷敏, 劉 彥

(河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,河北石家莊 050017)

美洛昔康(MEL)、吡羅昔康(PIR)、吲哚美辛(IND)和雙氯芬酸鈉(DIC)是常見的非甾體抗炎藥(NSAIDs)，因其解熱鎮(zhèn)痛、抗炎作用而被廣泛應(yīng)用于臨床[1]。該類藥物經(jīng)人體代謝后約10%～30%原型藥物通過糞便和尿液進(jìn)入環(huán)境中，但仍具有生物活性，容易造成污染，甚至導(dǎo)致人類和動物產(chǎn)生耐藥性。所以，環(huán)境中NSAIDs殘留監(jiān)測備受關(guān)注。

目前，大多數(shù)NSAIDs的檢測常采用高效液相色譜[2,3]、毛細(xì)管電泳[4]、液相色譜/質(zhì)譜[5,6]和超高效液相色譜-質(zhì)譜[7]等方法。然而，環(huán)境樣品中NSAIDs濃度低，基質(zhì)復(fù)雜，需經(jīng)富集、純化等步驟，因此，樣品前處理方法的選擇十分關(guān)鍵。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了固相萃取(SPE)[8 - 10]、液相微萃取(LPME)[11]、攪拌棒吸附萃取(SBSE)[12]和電膜提取(EME)[13]用于分析環(huán)境樣品中NSAIDs。其中，SPE應(yīng)用較為廣泛。氧化石墨烯(GO)作為SPE的吸附劑已成功用于復(fù)雜基質(zhì)樣品如環(huán)境水、尿液、血樣中待測物的萃取[14 - 17]。中空纖維(HF)是具有一定截留分子量的膜材，廣泛用于LPME[15,18]。近年來，將碳納米材料與HF相結(jié)合建立了多種液/固相微萃取，例如：碳納米管增強(qiáng)HF的固相微萃取法檢測水樣中的吡羅昔康和雙氯芬酸鈉[19]，它通過溶膠-凝膠技術(shù)將碳納米管結(jié)合到HF的孔中，包含兩次萃取過程，操作復(fù)雜。

本文建立的GO-HF-SPME已成功用于分析環(huán)境水樣中尼美舒利和塞來昔布的殘留[20]。本實(shí)驗(yàn)中MEL、PIR、IND和DIC的理化性質(zhì)與上述化合物相比具有明顯差異，使得萃取過程中關(guān)鍵影響因素需作出針對性優(yōu)化，之后在最佳萃取條件下，用于分析環(huán)境水中4種NSAIDs的殘留，方法具有較高的選擇性和靈敏度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1200高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)；FTIR-8400傅里葉變換紅外光譜儀(日本，島津公司)；S-3500N掃描電鏡(日本，日立公司)；TG16-WS臺式高速離心機(jī)(湖南湘儀)。

美洛昔康(MEL)、吡羅昔康(PIR)、吲哚美辛(IND)和雙氯芬酸鈉(DIC)對照品購自中國食品藥品檢定研究院。精密稱取PIR、IND和DIC對照品約10 mg，MEL對照品5 mg分別置于10 mL容量瓶，加甲醇溶解后定容，得到各待測物質(zhì)的對照品儲備液，待用。鱗片石墨購于青島金日來公司；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。甲醇、乙腈均為色譜純；H3PO4、KMnO4、HCl、H2SO4等均為分析純。

自來水水樣采集自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境水樣取自河北石家莊民新河，所有樣品于玻璃瓶中4 ℃保存。

1.2 氧化石墨烯-中空纖維固相微萃取

1.2.1 氧化石墨烯的合成按照Hummers法[21]制備氧化石墨烯，步驟如下：將K2S2O4、P2O5置于燒瓶后緩慢加入適量H2SO4，攪拌均勻，加鱗片石墨，繼續(xù)攪拌30 min，然后在80 ℃條件下反應(yīng)4 h，所得固體低溫烘干即為預(yù)氧化產(chǎn)物。稱取適量預(yù)氧化產(chǎn)物置圓底燒瓶中，加適量H2SO4、KMnO4，攪拌30 min，在35 ℃條件下反應(yīng)8 h，待反應(yīng)結(jié)束后加重蒸水、H2O2，攪拌30 min轉(zhuǎn)移至離心管，以4 000 r/min的速度離心20 min，棄去上清，洗滌沉淀至中性，干燥，即得氧化石墨烯(GO)。實(shí)驗(yàn)前，采用紅外光譜儀和掃描電鏡對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.2.2 SPE裝置的制備精密稱取5.0 mg GO，填充至長度1 cm HF中，兩端熱封，即為GO-HF-SPME裝置。實(shí)驗(yàn)前，采用甲醇-水(體積比為1∶1)清洗，活化GO-HF-SPME裝置。

1.2.3 GO-HF-SPME將GO-HF-SPME裝置置于20 mL樣品溶液(pH=3.0)中，在轉(zhuǎn)速500 r/min條件下攪拌30 min，然后將GO-HF-SPME裝置轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入1 mL甲醇(含0.5%三乙胺)，在轉(zhuǎn)速8 000 r/min的條件下離心15 min，重復(fù)3次，收集洗脫液濃縮蒸干后，殘?jiān)?0 μL流動相復(fù)溶，渦旋、混勻，即得供試品溶液。

1.3 色譜條件

采用Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水(含0.2%三乙胺，用H3PO4將pH值調(diào)至3.5)=33∶67(體積比)為流動相，在柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，波長254 nm條件下進(jìn)行色譜分析，進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 GO結(jié)構(gòu)表征

由圖1紅外光譜圖可知在1 735 cm-1,1 050 cm-1and 3 475 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，分別與C=O、C-O和O-H相關(guān)，而1 640 cm-1處峰是由O-H彎曲振動以及環(huán)氧基、羧基和骨架環(huán)振動引起的，因此，上述結(jié)果表明GO表面存在豐富的含氧官能團(tuán)，石墨烯成功被氧化。通過掃描電鏡觀察GO的固體粉末的形態(tài)，可見典型的片狀結(jié)構(gòu)，且表面較為光滑、平整。

2.2 GO-HF-SPME條件優(yōu)化

基于HF 10 kDa截留分子量特性以及GO的強(qiáng)吸附能力，本實(shí)驗(yàn)建立了GO-HF-SPME方法，分別優(yōu)化了GO質(zhì)量、HF長度、樣品溶液pH值、攪拌速度、萃取時間和解吸條件等參數(shù)，所用模擬樣品溶液所含4種待測物的濃度均為500 ng/mL。

2.2.1 GO質(zhì)量及HF長度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每1 cm的HF可包裹5 mg的GO，制備長度為1 cm的GO-HF-SPME裝置，分別考察其數(shù)量為1、2、3、4時的萃取效率。結(jié)果表明：GO質(zhì)量為15 mg時，萃取效率達(dá)到最大值，之后不再明顯增加。因此，選擇的GO質(zhì)量為15 mg。

確定GO的質(zhì)量為15 mg后，比較不同長度(1 cm×3和3 cm×1)HF的萃取能力。結(jié)果表明：HF長度為1 cm時，GO-HF-SPME裝置對待測物的萃取效率更佳。所以，最終樣品前處理過程使用3個長度為1 cm的GO-HF-SPME裝置。

2.2.2 樣品溶液pH值的影響樣品溶液的pH值會影響待測物的電離形式發(fā)生變化，且與萃取效率相關(guān)。MEL、PIR、IND和DIC的pKa分別為4.08、6.3、4.5、4.0，因此考察了樣品溶液pH值分別為1、3、5、7時的萃取效率。由圖2結(jié)果可知樣品溶液的最佳pH值為3.0。

圖2 pH對萃取效率的影響(n=3)Fig.2 The effect of pH on the extraction efficiency (n=3)

2.2.3 萃取時間實(shí)驗(yàn)考察了不同萃取時間(10、20、30、40 min)對萃取效率的影響，結(jié)果表明：當(dāng)時間大于或等于30 min時，萃取效率不再增加。因此，萃取時間選為30 min。

2.2.4 攪拌速度考察了不同攪拌速率300、400、500、600 r/min對GO-HF-SPME萃取效率的影響。結(jié)果表明：在攪拌速率為500 r/min條件下，待測物的萃取效率最高，而當(dāng)攪拌速率為600 r/min時，萃取效率降低，這可能是由于攪拌力大于待測物與GO之間的吸附力，導(dǎo)致待測物被吸附量降低。因此，選擇500 r/min為最佳攪拌速度。

2.2.5 解吸條件的考察本實(shí)驗(yàn)中4種待測物均為酸性化合物，分別考察以不同濃度三乙胺(0.2%、0.5%、1.0%)-甲醇作為洗脫劑的影響。當(dāng)三乙胺濃度為0.2%時，萃取效率最低；三乙胺濃度為1.0%時，萃取效率最高。然而，HF在強(qiáng)堿性樣品溶液中易變性，導(dǎo)致GO-HF-SPME重復(fù)使用性較差。因此，以1 mL含0.5%三乙胺的甲醇作為洗脫劑。

在解吸過程中，洗脫循環(huán)次數(shù)是獲得待測物良好回收率的重要參數(shù)?？疾炝瞬煌南疵摯螖?shù)(1、2、3、4)，結(jié)果表明當(dāng)洗脫次數(shù)為3時，待測物的量不再明顯增加。

2.2.6 GO-HF-SPME重復(fù)利用次數(shù)按照上述已優(yōu)化的最佳萃取條件，采用同一GO-HF-SPME裝置反復(fù)萃取5次，HPLC進(jìn)樣分析后，RSD為9.7%，倘若反復(fù)使用6次，其RSD大于15%。因此，GO-HF-SPME裝置反復(fù)利用次數(shù)盡量控制在5次范圍內(nèi)。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證及樣品含量測定

2.3.1 線性關(guān)系及重復(fù)性配制成PIR、IND、DIC和MEL濃度分別為10、50、100、500、1 000 ng/mL的水溶液樣品，按照“1.2.3”條件處理并進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，與其濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明：四種待測物在10～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各待測物的定量限(S/N=10)和檢測限(S/N=3)分別在0.8～2.5 ng/mL、0.2～0.8 ng/mL范圍內(nèi)(表1)。

表1 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果Table 1 The results of analytical method validation

以4種待測物濃度均為100 ng/mL的加標(biāo)樣品溶液作為分析對象，按照“1.2.3”條件重復(fù)萃取6次，考察該方法的重復(fù)性，結(jié)果顯示RSD均不高于5.6%，表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法重復(fù)性良好。

2.3.2 回收率及樣品測定配制高中低三個濃度的加標(biāo)樣品溶液(MEL、PIR、IND和DIC濃度：10、100、500 ng/mL)進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)。所有樣品均按照“1.2.3”條件萃取后進(jìn)行HPLC分析，實(shí)際樣品未檢出MEL、PIR、IND和DIC，加樣回收率在95.4%～102.5%范圍內(nèi)，RSD%<7.5(表2)。上述結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)所建立的GO-HF-SPME聯(lián)用HPLC法準(zhǔn)確、可靠。

表2 4種非甾體抗炎藥的加樣回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Relative recoveries and relative standard deviations(RSD5) of target analytes

2.3.3 GO-HF-SPME的富集作用測定4種待測物混合對照品樣品溶液(1 000 ng/mL)，環(huán)境水水樣以及加標(biāo)樣品溶液(100 ng/mL)，經(jīng)“1.2.3”處理后進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，PIR、MEL、IND和DIC的富集倍數(shù)分別為20、55、50和103倍。所以，GO-HF-SPME對PIR、MEL、IND和DIC有較強(qiáng)的富集作用，可顯著提高分析靈敏度。

2.4 與其他方法比較

本文所建立的GO-HF-SPME方法與以往類似的報(bào)道進(jìn)行比較(表1)，其純化、富集效果佳，且準(zhǔn)確、可靠，靈敏度與LC-MS[22]檢測水平相當(dāng)。

表3 本研究與已有文獻(xiàn)的對比Table 3 Comparison of the current work with other previous methods for analysis of NSAIDs

3 結(jié)論

本研究建立了一種GO-HF-SPME聯(lián)用HPLC的方法用于分析環(huán)境水樣中痕量MEL、PIR、IND和DIC。該方法將HF與GO相結(jié)合，并根據(jù)待測物的pKa值選擇最佳的洗脫劑，在最佳萃取條件下獲得MEL、PIR、IND和DIC的富集倍數(shù)在20～103范圍內(nèi)，加樣回收率介于95.4%～102.5%間，因此，本研究所建立的GO-HF-SPME聯(lián)用HPLC方法靈敏度高、且準(zhǔn)確可靠，適用于分析環(huán)境水中4種非甾體抗炎藥的殘留。