唐文悅， 孫欣楠， 張麗瑤*，

(1.武漢大學生命科學學院,雜交水稻國家重點實驗室，湖北武漢 430072； 2.天津大學生命科學學院，天津 300072)

1 引言

DNA甲基化，一種重要的表觀遺傳修飾，指在DNA甲基轉移酶的催化下，甲基供體(S-腺苷甲硫氨酸)的甲基基團被轉移到DNA胞嘧啶或腺嘌呤上的過程。DNA甲基化已被發(fā)現在基因表達、胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞分化和染色體穩(wěn)定性維持等關鍵生物學過程中起重要作用[1]。在原核生物中，DNA甲基化可發(fā)生在胞嘧啶或腺嘌呤上，DNA甲基化不僅參與染色質復制和修復等過程，還保護宿主自身的DNA不被自身限制性修飾系統(tǒng)中限制性內切酶切割，而同時使入侵的噬菌體DNA被切割降解[2]。在真核生物中，DNA甲基化僅僅發(fā)生在胞嘧啶的五位碳上，形成5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine，5mC)，植物中，胞嘧啶的甲基化不僅發(fā)生在CG對稱位點，也發(fā)生在CHG和CHH位點(其中H為A、T或C)，一般CG序列的甲基化概率最高，CHG序列次之，CHH序列最低，且不同植物中甲基化程度各不相同。擬南芥基因組中，約24%CG、6.7% CHG 和1.7%CHH位點被甲基化，而水稻對應的甲基化占比分別是54.7%、37.3%和12%，明顯高于擬南芥中的值[3]。在哺乳動物中，DNA甲基化幾乎只發(fā)生在對稱的CG位點，約80%的體細胞基因組DNA CG位點均發(fā)生高度甲基化[4]。DNA的甲基化主要由兩類DNA甲基轉移酶完成，即維持型甲基轉移酶(DNMT1)和從頭甲基轉移酶DNMT3a和3b?，F已發(fā)現DNMT1和DNMT3對于哺乳動物的胚胎發(fā)育是必須的[5]。在小鼠中，DNMT1單純合突變體或DNMT3a和3b雙純合突變體胚胎均不能存活，且DNMT3a和DNMT3b之間存在功能冗余[5]。甲基轉移酶對胚胎發(fā)育的重要性不局限于哺乳動物中。如擬南芥中，MET1(DNMT1同源基因)突變體中也存在胚胎致死現象[6]。已發(fā)現人類多種疾病的發(fā)生如癌癥[7.8]、心血管疾病[9]、帕金森病[10]等與DNA甲基化密切相關。如通過將整體降低小鼠基因組甲基化水平可導致T-細胞淋巴癌的發(fā)生[8]。在多種癌組織中存在異常的甲基化現象，通常表現為整體基因組的低甲基化和特異啟動子區(qū)域的高甲基化，DNA甲基化圖譜分析正成為臨床癌癥診斷的方法之一[11]。

在真核生物中，不僅存在DNA甲基化，還存在DNA去甲基化。哺乳動物中，DNA去甲基化由10/11易位(Ten-Eleven-Translocation，TET)家族蛋白完成。TET蛋白可催化5mC生成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)，5hmC再被TET蛋白催化生成5-醛基胞嘧啶(5-Formylcytosine，5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-Carboxylcytosine，5caC)，5fC和5caC被胸腺嘧啶DNA糖苷酶(Thymine DNA glycosylase，TDG)識別切除，形成無嘧啶位點，隨后該位點被堿基切除修復途徑中酶修復，生成胞嘧啶，完成DNA去甲基化過程[12,13](圖1)。5hmC是一種穩(wěn)定的DNA修飾[14]，存在于動物細胞和組織中。癌細胞基因組中存在整體的5hmC缺失，低量的5hmC已經成為癌癥治療預后差的一個標志[15]。綜上所述，建立高靈敏度和可靠的甲基化檢測方法對研究疾病發(fā)生機理，建立有效的診斷和治療策略具有重要意義。目前，DNA甲基化分析與研究技術不僅可以在特定基因水平上分析DNA甲基化，還可以分析基因組特定區(qū)域以及全基因組中的DNA甲基化變化。按照研究技術原理不同，DNA甲基化分析與研究方法可分為基于堿基分離的分析技術、基于甲基化敏感限制性內切酶處理的技術、基于亞硫酸氫鹽處理的技術、基于親和富集處理的技術等。本文根據檢測技術原理不同介紹了DNA甲基化分析和檢測方法的研究進展，為未來深入研究DNA甲基化提供參考。

圖1 DNA甲基化和去甲基化動態(tài)過程[13]Fig.1 Dynamic regulation of DNA methylation and demethylation[13]

2 DNA甲基化分析和檢測技術

2.1 基于堿基分離的分析技術

高效液相色譜法(HPLC)可將DNA水解成單個脫氧核糖核苷，分離并檢測脫氧胞苷和5-甲基脫氧胞苷從而計算出基因組中5mC含量[16]。1980年，Kuo等首次利用高效液相色譜紫外檢測法分析基因組中5mC的含量[17]。隨著質譜(MS)技術的發(fā)展，應用高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[16]和超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)[18]使得5mC檢測的選擇性和靈敏度明顯增強。由于具有高的準確度和靈敏度，HPLC-MS是檢測全基因組5mC含量的金標準方法。

2000年，Fraga等提出一種新的甲基化胞嘧啶分離檢測技術，即高效毛細管電泳法(High performance capillary electrophoresis，HPCE)[19]。與HPLC相比，HPCE具有進樣量更低、成本低、分析速度快等特點，已被用于檢測人全血中5mC的含量，12 min內完成分離與檢測[20]。但HPLC與HPCE方法均不能了解5mC的具體位置信息，即無法得知基因組序列信息。

2.2 基于甲基化敏感限制性內切酶處理的分析技術

甲基化敏感限制性內切酶(Methylation Sensitive Restriction Enzymes，MSRE)是一類對其識別位點含有甲基化堿基敏感的限制性內切酶，利用消化處理可以特異性識別甲基化序列，這類酶一般只能識別一個甲基化堿基位點。甲基化敏感性內切酶消化后擴增方法操作簡便、應用范圍廣，但只能定性或半定量的檢測目的片段的某一位點甲基化狀態(tài)，不能定量，若酶消化不完全則會影響結果。甲基化敏感性內切酶消化聯合Southern雜交技術還可以獲得染色質重復序列的甲基化狀態(tài)[21]。Southern雜交是對基因組DNA特定序列進行定位的分析方法，通過標記探針與膜上DNA進行雜交可檢測目標DNA片段中是否存在與探針同源的序列。Southern雜交不僅可用于DNA圖譜分析，轉基因的拷貝數檢測等方面，還可用于DNA甲基化分析。采用HpaⅡ或MspⅠ酶切基因組結合Southern雜交可分析擬南芥著絲粒180bp重復序列的甲基化[21]。在眾多的甲基化敏感性內切酶中，值得一提的是McrBC，一種GTP依賴的DNA內切酶，該酶作用原理和上述HpaⅡ和MspⅠ相反，對高甲基化DNA有強切割活性，而對非甲基化DNA活性低，利用McrBC消化基因組后PCR可知基因組某一片段的甲基化水平[22]。

2.3 基于亞硫酸氫鹽處理的測序技術

2.3.1 經典亞硫酸氫鹽測序亞硫酸氫鹽測序(Bisulfite sequencing，BS-seq)是目前研究DNA甲基化最重要的方法。其原理是利用亞硫酸氫鹽對非甲基胞嘧啶的高效脫氨作用，生成尿嘧啶(轉化原理和過程見圖2)，在隨后的測序中被讀成胸腺嘧啶T，而5mC和5hmC均對亞硫酸氫鹽不敏感，通過PCR產物直接測序或挑克隆測序可判斷DNA的甲基化[23,24]。該方法精確度高，可知目的片段每一個CG、CHG、CHH位點的甲基化狀態(tài)，被認為是DNA甲基化檢測的“金標準”。但缺點如下：(1)不能區(qū)分5mC和5hmC；(2)出現轉化不完全的情況；(3)耗時長；(4)通過克隆拷貝數計算甲基化程度有一定誤差。

圖2 亞硫酸氫鹽轉化胞嘧啶生成尿嘧啶的過程[24]Fig.2 The mechanism of nucleotide conversion from cytosine to uracil with bisulfite treatment [24]

2.3.2 甲基化特異性PCR甲基化特異性PCR(Methlation specific PCR，MSP)法是一種分析CpG島DNA甲基化模式的方法[25]。首先亞硫酸氫鹽對DNA轉化處理，然后PCR擴增，為了區(qū)分甲基化或非甲基化DNA，需兩對引物，一對引物對甲基化DNA有特異性，另一對引物對甲基化DNA沒有特異性。如果DNA在引物覆蓋位點內不含甲基化，則發(fā)生非甲基化引物對擴增，反之亦然。MSP可快速評估CpG島的甲基化，不需要克隆或甲基化敏感的內切酶，可對少量DNA及石蠟包埋樣本進行分析[25],該方法中引物設計是關鍵[26]。

Eads等[27]將MSP與熒光定量PCR結合，開發(fā)出甲基化定量PCR技術(命名為MethyLight)。MethyLight特異性好、敏感性強，特別適合在非甲基化DNA高背景下檢測低頻甲基化DNA區(qū)域[27]。將MethyLight與數字PCR(Digital PCR)相結合可明顯提高DNA檢測靈敏度[28]。MethyLight檢測結腸癌基因組上相關位點的甲基化可預測臨床上癌治療效果，高甲基化病人預后差于低高甲基化病人[29]。

2.3.3 亞硫酸氫鹽焦磷酸測序焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種利用酶偶聯反應和生物發(fā)光實時監(jiān)測伴隨核苷酸摻入的焦磷酸鹽釋放過程的DNA測序技術[30]。亞硫酸氫鹽焦磷酸測序是指首先亞硫酸氫鹽處理基因組，再用焦磷酸測序技術測定目標位點中C/T的比率，以此判斷目標位點的甲基化程度。該技術成本效益高，快速、且能準確定量，但最大的限制是讀取片段短，可分析的CG位點少，通過連續(xù)測序可提高分析范圍[31]。目前，亞硫酸氫鹽焦磷酸測序已被用于多種疾病標志基因的啟動子甲基化分析，如PCDH10[32]和KEAP[33]等。

2.3.4 全基因組亞硫酸氫鹽測序全基因組亞硫酸氫鹽測序(Whole-genome bisulfite sequencing，WGBS)是將亞硫酸氫鹽處理過的DNA構建文庫并與處理前的對照文庫比對測序，通過比對堿基差異判斷甲基化水平，可生成最全面、最高分辨率的DNA甲基化圖譜，適用于所有具有參考基因組的物種[34]。WGBS通常需要30×以上覆蓋范圍測序，因此對于那些具有較大甲基組的樣本而言(如人類和玉米)，價格昂貴。但由于所獲信息最全面，可靠性強，因此WGBS是目前國際上研究基因組甲基化項目的金標準[35]。當前WGBS技術已成熟，詳細的實驗步驟和最新的技術流程已被很好的總結比較[36]，并成功用于大型植物基因組(玉米和大豆)的甲基化測序[37]。

2.3.5 簡化代表性亞硫酸氫鹽測序由于WGBS費用高，2005年，Meissner等[38]提出了簡化代表性亞硫酸氫鹽測序(Reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)。該方法是首先利用特異性限制性核酸內切酶(如MspI)消化基因組DNA，電泳并回收所需要大小的片段，隨后亞硫酸氫鹽測序。相較WGBS，RRBS僅對基因組1%的區(qū)域進行測序，成本低，測序深度更大，數據利用率更高，但不能獲得完整的全基因組甲基化信息[39]。由于玉米基因組上沒有大量CG島，MspI酶切不合適，改用MseI酶切，RRBS被成功用于檢測玉米基因組的甲基化，盡管只有四分之一的基因組被覆蓋，但84%啟動子區(qū)域可被檢測[40]。通過比對測序，RRBS可用于無參考基因組的不同物種之間的甲基化比較分析，為解析DNA甲基化分子機制提供工具[41],但對無參考基因組的物種來說，RRBS具有很大局限性[42]。

2.3.6 TET酶或化學試劑輔助亞硫酸氫鹽測序經典亞硫酸氫鹽測序技術無法區(qū)分5mC和5hmC，針對于此，Booth等建立了氧化亞硫酸氫鹽測序(Oxidative bisulfite sequencing,oxBS-seq)[43,44]。該方法首先利用釕酸鉀(KRuO4)氧化基因組，將5hmC氧化成5fC，隨后亞硫酸氫鹽處理將未甲基化胞嘧啶和5fC均轉化成尿嘧啶，可特異性檢測5mC，通過對比經典亞硫酸氫鹽測序結果，還可獲得全基因組中5hmC的情況。自2012年以來，oxBS-seq技術已被廣泛應用于多種生物樣品的5mC和5hmC檢測，如癌組織和人胎盤等[45 - 47]。

TET輔助亞硫酸氫鹽測序(TET-assisted bisulfite sequencing，TAB-seq)方法是一種僅針對5hmC直接檢測的測序方法[48，49]。首先糖基化對5hmC進行保護，然后利用TET酶將5mC和5fC完全氧化為5caC，亞硫酸氫鹽處理后5caC轉化為尿嘧啶，PCR擴增和測序后5mC和5fC為胸腺嘧啶T，而5hmC為胞嘧啶信號C。通過該方法檢測人和小鼠胚胎干細胞基因組中5hmC，結果發(fā)現5hmC幾乎僅存在CG上，其豐度明顯低于5mC，5hmC和5mC均富集于末端調控元件上，而少有富集在啟動子和基因上[48]。

2.4 基于親和富集處理的測序技術

2.4.1 DNA甲基化免疫沉淀芯片檢測或測序在哺乳動物中，5mC占所有堿基的約1%，豐度較低，富集含有5mC的片段有助于后續(xù)的DNA建庫測序，通過5mC抗體或與含5mC的DNA特異性結合的蛋白質可富集甲基化DNA。2005年，Weber等[50]提出了甲基化DNA免疫沉淀富集技術，該技術利用5mC單克隆抗體富集高度甲基化單鏈DNA片段。方法的基本步驟是將基因組DNA超聲斷裂成300～600 bp，隨后95度變性，再用5mC單克隆抗體溫育及蛋白A/G標記的磁珠或瓊脂糖珠富集，提純后芯片分析或測序。由于高通量測序所獲信息遠遠高于DNA芯片，因此DNA甲基化免疫沉淀測序(Methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP-seq)技術已成為人類疾病與健康中表觀遺傳學研究最重要的技術[51，52]。MeDIP-seq無需深度測序，成本低，富集后測序，靈敏度高(即DNA用量少，可低至50 ng[53])，近年來已成功用于外周血中游離DNA的甲基化分析，為尋找新的癌癥標記物提供了良好工具[54，55]。但該方法的結果依賴于抗體質量，高特異性的單克隆抗體是必須的。

2.4.2 甲基化DNA特異性結合蛋白富集測序甲基化DNA特異性結合蛋白富集測序技術(Methyl-CpG binding domain protein-enriched genome sequencing，MBD-seq)原理與MeDIP-seq相似，都是基于特異蛋白對甲基化DNA的高親和性，將其富集。甲基化CpG結合(Methyl-CpG-binding domain，MBD)蛋白家族中的某些具有相似MBD結構域蛋白能結合甲基化的雙鏈DNA。四種MBD蛋白(MBD1,MBD2,MeCP2,MBD4)可高特異性結合甲基化雙鏈DNA，被晶體結構和核磁共振技術證實[56,57]。由于具有強親和性等優(yōu)點，MBD2常被用于MBD-seq[58,59]。甲基CpG結合域蛋白3-like-1(MBD3L1),一種MBD2結合蛋白，在實驗中常作為輔助蛋白以增加MBD2對甲基化DNA的結合力，促進甲基化DNA結合復合物的形成，提高富集效果[60，61]。同MeDIP-seq相比，MBD-seq實驗中無需將DNA變性，且傾向于富集高密度的甲基化CG島[62]。方法經濟有效，可用于大批量樣品的甲基化檢測[63]。同MeDIP-seq技術，MBD-seq具有靈敏度高，可用于檢測外周血中游離DNA的甲基化[64]。

和基于亞硫酸氫鹽處理的測序技術相比，基于親和富集處理的測序技術成本低，特異性高，靈敏度高等優(yōu)點，但其缺點是不能定量，分辨率低(通常是150 bp左右,無法達到單堿基分辨率)，難以獲得低甲基化區(qū)域信息[57]。

2.5 不依賴于亞硫酸氫鹽的DNA甲基化測序

經典的亞硫酸氫鹽處理基因組DNA會導致基因組的大量降解，限制了少量樣品的分析[65]。針對于此，2019年，Liu等[66]人建立了TET輔助吡啶硼烷測序法(TET-assisted pyridine borane sequencing，TAPS)，避免了基因組的大量降解。首先利用TET酶將5mC和5hmC氧化成5caC/5fC，隨后5caC/5fC被吡啶硼烷還原形成二氫尿嘧啶(dihydrouracil，DHU，圖3)，PCR擴增測序后被識別為胸腺嘧啶T，未甲基化胞嘧啶保留為胞嘧啶，從而可檢測基因組中5mC和5hmC(圖4)，同亞硫酸氫鹽測序相同，TAPS不能區(qū)分5mC和5hmC。若將5hmC利用糖基化進行保護，隨后TET氧化和吡啶硼烷還原，則可特異性檢測5mC，5hmC保護酶為β-糖基轉移酶(β-glucosyltransferase)，方法命名為TET輔助吡啶硼烷測序法β(TET-assisted pyridine borane sequencing withβ-glucosyltransferase，TAPSβ)[66]。若將TET酶用氧化劑釕酸鉀(KRuO4)代替，特異性氧化5hmC成5fC，再吡啶硼烷還原將5fC轉化成二氫尿嘧啶，則可特異性檢測5hmC，方法命名為化學輔助吡啶硼烷測序(chemical-assisted pyridine borane sequencing,CAPS)[66]。TAPSβ和CAPS方法已被證實可分別用于全基因組的5mC特異檢測和5hmC特異檢測[67]。TAPS方法靈敏度高，10 ng DNA(1～3 mL血漿)[68]即可分析外周血游離DNA的甲基化。

圖3 TET氧化5mC和5hmC及吡啶硼烷還原5caC生成二氫尿嘧啶的過程[66]Fig.3 The mechanism of nucleotide conversion from 5mC and 5hmC to dihydrouracil with TET and pyridine borane treatment [66]

圖4 TET輔助吡啶硼烷測序原理Fig.4 The sequencing principle for DNA methylation with TET and pyridine borane

同樣針對亞硫酸氫鹽處理的大量DNA降解問題，2021年，Sun等[69，70]建立了不依賴于亞硫酸氫鹽的酶促甲基化測序技術(Enzymatic methyl-seq，EM-seq)。該方法利用TET酶和β-糖基轉移酶氧化和保護5mC和5hmC，生成5caC或糖基化的羥甲基胞嘧啶，隨后利用胞嘧啶脫氨酶(APOBEC)催化脫氨，未甲基化的胞嘧啶脫氨轉化為尿嘧啶U，PCR測序讀為胸腺嘧啶T，而5caC或糖基化的羥甲基胞嘧啶不被脫氨，PCR測序讀為胞嘧啶C，從而可檢測基因組中的5mC和5hmC(圖5)。若利用β-糖基轉移酶保護5hmC，隨后胞嘧啶脫氨酶脫氨，可特異性檢測5hmC，即為APOBEC酶耦合的表觀測序(APOBEC-coupled epigenetic sequencing，ACE-Seq)[71]。同TAPS技術，EM-seq中DNA基本不降解，所需DNA量少(100 pg DNA即可)，基因組覆蓋度好，數據分析速度快等優(yōu)點[70]，表1總結了以上各種甲基化測序技術中胞嘧啶C、5mC和5hmC的測序結果。

圖5 酶促甲基化測序技術原理Fig.5 The sequencing principle for DNA methylation by enzymatic deamination method

表1 幾種測序方法中5mC和5hmC的測序比較Table 1 Comparison of different methods for 5mC and 5hmC sequencing

2.6 第三代測序技術

因價格便宜，實驗流程成熟可靠，短讀大規(guī)模平行測序(Short read massive parallel sequencing)，又稱為第二代測序(Next-generation sequencing,NGS)已成為檢測DNA甲基化水平的標準工具，但短讀技術有其固有的局限性，如從頭組裝、單倍體定相和結構差異檢測困難等[72]。第三代測序技術主要包括單分子實時測序技術(Single molecule real-time，SMRT)和單分子納米孔測序技術(Single-molecule nanopore DNA sequencing)。SMRT技術由太平洋生物科學公司(Pacific Biosciences，PacBio)研發(fā)而成[73,74]，測序過程無需PCR擴增，可克服二代測序中的結構差異檢測困難等缺點，具有可讀取長片段DNA或RNA序列，可直接檢測DNA的表觀遺傳修飾等優(yōu)點[72,75]。該技術是基于零模波導孔(Zero Mode Waveguide，ZMW)的單分子檢測技術發(fā)展而來的一種邊合成邊測序技術[73,74]。SMRT技術不僅可區(qū)分常規(guī)堿基，還可以檢測修飾后堿基，其檢測原理是根據不同的堿基有不同顏色的熒光以及有不同的熒光持續(xù)時間，如甲基化的腺嘌呤上的時間遠長于未甲基化的腺嘌呤[76]。目前SMRT技術已經成功用于DNA甲基化檢測[76,77]。

納米孔測序技術也是基于單分子檢測的測序技術，起源于20世紀80年代末期科學家提出了一種新型想法，即能否通過電泳將DNA通過納米小孔進行測序，隨后大量科學家進行了相關實驗，獲得了一系列技術上的突破[78]。該技術的基本原理是DNA單鏈分子通過納米孔蛋白時，由于堿基不同導致產生的電流干擾不同，通過檢測電流的變化而區(qū)分堿基[78,79]。2014年，由牛津納米孔技術公司推出第一臺商品化的納米孔測序儀(MinION),已被用于甲基化檢測以及臨床上呼吸道的細菌感染等[80 - 82]。與其他長讀測序儀一樣，納米孔測序的主要缺點是錯誤率較高(5%到20%之間)，具體取決于納米孔、文庫制備及數據處理方法，錯誤包括替換、插入和刪除[83]。相對第二代測序技術，第三代測序技術的高錯誤率和高費用限制了其應用。

3 總結與展望

DNA甲基化作為表觀遺傳最重要的一種修飾，在動物與植物中廣泛存在，在多種關鍵生命過程中起重要作用。DNA甲基化檢測技術的發(fā)展推動了生命科學領域的研究。高效液相色譜法可檢測全基因組中5mC含量，準確度高，但不能了解甲基化的位置信息；限制性酶切結合PCR或Southern雜交技術一次只能檢測單個位點或某些特異序列的甲基化；親和富集技術結合二代測序條件較溫和，靈敏度高，但不能提供單堿基分別率的DNA甲基化圖譜?；趤喠蛩釟潲}處理的測序技術存在DNA降解問題，導致比對率低。不依賴于亞硫酸氫鹽處理的測序技術需要利用重組酶，酶的效果是關鍵因素。第三代核酸測序技術，實現了不需PCR的長度測序，但準確度不夠，費用高。由于具有高準確度和低費用，亞硫酸氫鹽結合二代測序仍是目前甲基化檢測最主要的技術；改進現有技術或將不同方法結合開發(fā)新的技術，獲得靈敏度高、特異性強、易操作、高通量的檢測方法仍是未來研究的重點。