趙 靜， 郭自國(guó)， 周天明， 高 進(jìn)*， 余 靜， 王 偉， 唐 澈， 王 倩

(1.湖北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，湖北武漢 430070； 2.湖北省農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境保護(hù)站，湖北武漢 430070)

桿菌肽(Bacitracin)、多粘菌素B(Polymyxin B)和硫酸粘菌素(Colistin sulfate)屬于多肽類(lèi)抗生素，它們不僅可預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，還可以促生長(zhǎng)，但濫用或不按照休藥期使用也會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)累積，通過(guò)食物鏈損壞人體神經(jīng)系統(tǒng)和帶來(lái)腎毒性等，甚至造成人體對(duì)細(xì)菌的耐藥性。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 31650-2019)《食品中獸藥最大殘留限量》[1]中規(guī)定了牛、豬、家禽類(lèi)組織、奶、蛋中桿菌肽限量為500 μg/kg；粘菌素在牛羊豬雞的肌肉和肝中限量為150 μg/kg，腎臟中200 μg/kg，蛋中300 μg/kg，奶中50μg/kg。多肽類(lèi)物質(zhì)通常是大分子化合物，易被吸附，在提取過(guò)程中因樣品的蛋白析出而基質(zhì)效應(yīng)明顯，檢測(cè)靈敏度低，一般前處理提取過(guò)程多要用到凈化小柱、多倍濃縮再檢測(cè)。發(fā)布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了豬肉、豬腎[2,3]、牛奶、奶粉[4]、飼料[5]的檢測(cè)方法，其中桿菌肽在豬肉、豬腎的檢出限為50 μg/kg，牛奶中為50 μg/kg，奶粉中為250 μg/kg，飼料中為50 μg/kg，粘菌素在豬肉組織檢出限為10 μg/kg，檢測(cè)的方法主要有快檢法、液相色譜法或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。

目前標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)中關(guān)于魚(yú)類(lèi)樣品中多肽類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)的報(bào)道很少。我國(guó)是水產(chǎn)品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，養(yǎng)殖過(guò)程中是否存在違規(guī)使用現(xiàn)象，需建立高效可靠的檢測(cè)方法來(lái)評(píng)估，這對(duì)監(jiān)管工作具有重要意義。本研究主要針對(duì)常規(guī)方法中靈敏度低，前處理復(fù)雜的難點(diǎn)，采用高分辨液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[6,7]，利用精確質(zhì)量數(shù)定性定量。該方法將樣品簡(jiǎn)單提取后直接上機(jī)檢測(cè)，不用過(guò)柱凈化和濃縮，操作方便，數(shù)據(jù)可靠，極大提高了篩查效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

UPLC-Q/Exactive超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；WH-3微型渦旋振蕩器(上海楚定分析儀器有限公司)；CF16RN臺(tái)式高速離心機(jī)(日立Hitachi公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：桿菌肽(純度>84.8%)、多粘菌素B(純度>88.1%)、硫酸粘菌素(純度>95.1%)(德國(guó)Dr.E公司)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用0.2%甲酸水溶液配制成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置棕色容量瓶避光4 ℃避光保存。甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，美國(guó)J.T.Baker公司)；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 色譜/質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：hypersil gold C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，A相90%保持不變；1～3 min，A相由90%線性變化至60%；3～5 min，A由60%線性變化至20%；5～7 min，A相20%保持不變；7～7.1 min，20%線性變化至90%；7.1～10 min，A相保持90%。柱溫：30 ℃；流速：300 μL/min；運(yùn)行時(shí)間：10.0 min。進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)；正離子采集；離子源溫度：300 ℃；毛細(xì)管溫度：350 ℃；干燥氣：氮?dú)猓磺蕷鈮毫Γ?.27 MPa；輔助氣壓力：0.07 MPa；噴霧電壓：3 200 V；監(jiān)測(cè)模式：SIM-dd-MS2;質(zhì)譜掃描(一級(jí))分辨率：R=70000;AGC target：5e4；最大注入時(shí)間：200 ms；隔離窗口：m/z2.0；(二級(jí))分辨率：R=17 500；NEC為40 eV(50%)。3種多肽類(lèi)化合物信息見(jiàn)表1。

表1 3種多肽類(lèi)化合物的保留時(shí)間和精確質(zhì)量數(shù)Table 1 Retention times and accurate masses of the 3 polypeptide compounds

1.3 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品(±0.01g)，置于50 mL聚丙烯離心管，加入10 mL 1%甲酸化乙腈-水(體積比7∶3)，渦旋提取10 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm尼龍濾膜于PVC進(jìn)樣瓶，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

一般以乙腈作為提取溶劑可以沉淀蛋白和降低基質(zhì)效應(yīng)。多肽類(lèi)抗生素極性強(qiáng)，酸性條件下穩(wěn)定，所以選擇酸化乙腈水溶液作為提取液，研究中發(fā)現(xiàn)隨著提取液中水相比例增加，提取液乳化程度加重，如果乳化嚴(yán)重過(guò)膜難度增大，儀器易污染，應(yīng)在保證提取效果下盡量減少水相比例。本實(shí)驗(yàn)考察了1%甲酸化乙腈和1%甲酸化乙腈-水溶液體積比分別為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5和4∶6的提取效果。粘菌素類(lèi)提取效率隨著水相比例增加而呈增加趨勢(shì)，在8∶2的提取效率可以達(dá)到80%左右，7∶3的提取效率可達(dá)到90%左右，但在6∶4、5∶5和4∶6的提取液中隨水相比例增加，提取液乳化程度增加，提取效率又會(huì)下降。桿菌肽提取效率在8∶2、7∶3、6∶4的體系中均有較好的提取效率，因此選用乙腈-水體積比為7∶3。

實(shí)驗(yàn)考察了體積比為7∶3的乙腈-水在不同酸度(0，0.5%，1%，2%，3%)的提取效果，桿菌肽提取沒(méi)有顯著區(qū)別，粘菌素類(lèi)酸度在0，0.5%時(shí)提取率較低40%以下，在1%，2%，3%的提取效率接近,可達(dá)80以上，所以選用1%甲酸化乙腈-水(7∶3，體積比)作為提取液。

同時(shí)，研究中發(fā)現(xiàn)用普通玻璃進(jìn)樣瓶和選擇水系濾膜時(shí)目標(biāo)物被吸附，上機(jī)測(cè)定檢不出目標(biāo)物，進(jìn)樣瓶應(yīng)選用PVC材質(zhì)，濾膜應(yīng)選用尼龍膜，不影響目標(biāo)物的測(cè)定。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

多肽類(lèi)大分子化合物，分子量均超過(guò)1 000，在正離子模式下，易生成單電荷、雙電荷和三電荷多種帶電荷分子離子。利用標(biāo)準(zhǔn)溶液在全掃描模式下得到待測(cè)物穩(wěn)定并有較強(qiáng)的分子離子峰，桿菌肽([M+3H]3+)、多粘菌素([M-H2SO4+3H]3+)、硫酸粘菌素([M-H2SO4+3H]3+)強(qiáng)度最大，可選用一級(jí)SIM模式全掃，提取準(zhǔn)分子離子理論精確質(zhì)量數(shù)色譜圖。理論精確質(zhì)量數(shù)如表1所示,目標(biāo)物相對(duì)質(zhì)量偏差小于5.0×10-6。

2.3 色譜條件的選擇

選用0.1%的甲酸水溶液分別和甲醇、乙腈作為流動(dòng)相梯度洗脫測(cè)定目標(biāo)物，如同其他文獻(xiàn)中報(bào)道的，用甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，多粘菌素B和硫酸粘菌素峰型拖尾并且變形成多峰，用乙腈3種多肽類(lèi)化合物都可獲得對(duì)稱的峰形，水相的酸度比較了0.1%和1%的結(jié)果，差異不大，可選擇0.1%的甲酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相洗脫。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

選用5種不同種類(lèi)的魚(yú)，按照“1.3”樣品前處理方法分別制得5種空白基質(zhì)溶液，再用空白基質(zhì)溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制5組混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機(jī)測(cè)定。每種魚(yú)中3種多肽類(lèi)化合物的工作曲線濃度范圍均為2.0～100.0 μg/L?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如表2。當(dāng)基質(zhì)工作曲線與溶劑工作曲線的斜率比η超出80%～120%范圍時(shí)[6，8]說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)明顯，小于20%說(shuō)明基質(zhì)抑制較弱，大于50%說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)，均會(huì)影響結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明，粘菌素類(lèi)沒(méi)有顯著基質(zhì)效應(yīng)，但桿菌肽基質(zhì)效應(yīng)明顯，所以為保證測(cè)定結(jié)果的可靠，出現(xiàn)陽(yáng)性樣品時(shí)，應(yīng)采用對(duì)應(yīng)品種空白樣品溶液配制基質(zhì)工作曲線進(jìn)行定量。

表2 3種多肽類(lèi)化合物一級(jí)母離子定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of the 3 polypeptide compounds with molecular ions

2.5 線性范圍與檢出限

用1%甲酸乙腈-水溶液(體積比，7∶3)作為提取液，用空白樣品溶液分別配制2.0、5.0、10.0、20.0、50.0，100.0 μg/L的多肽類(lèi)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，用一級(jí)母離子色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用向空白樣品中逐級(jí)降低加標(biāo)濃度進(jìn)行儀器測(cè)定的最低加標(biāo)濃度為定量限。3種組分在2.0～100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，R2不低于0.995(表2)，定量限為10 μg/kg。

2.6 方法回收率和精密度

選用5類(lèi)常食用的空白魚(yú)樣，分別添加10.0、20.0、50.0μg/kg 3個(gè)濃度水平的桿菌肽、多粘菌素B、硫酸粘菌素，每個(gè)添加濃度水平6次平行，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表3。3個(gè)目標(biāo)物的平均回收率為61.3%～113.9%，RSD為2.1%～14.3%。

表3 3種多肽類(lèi)化合物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries(Re) and relative standard deviations(RSD)of the 3 polypeptide compounds(n=6)

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)市場(chǎng)抽檢20份魚(yú)類(lèi)樣品中3種多肽類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果未檢出陽(yáng)性樣品。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨質(zhì)譜快速篩查魚(yú)類(lèi)樣品三種多肽類(lèi)物質(zhì)的分析方法。該方法快速簡(jiǎn)單易操作，數(shù)據(jù)可靠，可用于魚(yú)類(lèi)樣品的快速定性篩查和定量分析，為水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。