張小燕 高靜賢 那成龍 趙鵬程

1 江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （江蘇 南京 210019）

2 南京世和醫(yī)療器械有限公司 （江蘇 南京 210012）

內(nèi)容提要： 目的：對4種新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的性能包括敏感性與特異性、最低檢出限、精密度和分析特異性進(jìn)行評價(jià)，為實(shí)驗(yàn)室選擇新冠病毒核酸檢測試劑盒提供參考，促進(jìn)新冠肺炎病毒核酸檢測技術(shù)的創(chuàng)新改進(jìn)。方法：以20例新冠病毒確診陽性和10例確診陰性的咽拭子作為研究樣本，經(jīng)提取得到RNA后根據(jù)4種新冠病毒核酸檢測試劑盒說明書對其進(jìn)行檢測，分析擴(kuò)增結(jié)果，評估各試劑盒的差異。結(jié)果：檢測結(jié)果顯示4種試劑盒對30例研究樣本的陰陽性判定情況不盡相同，其中a試劑盒的敏感性和特異性最高，均達(dá)到100%；3例陽性樣本稀釋到100倍時(shí)，c試劑盒只能檢出其中的1例，而其他三種試劑盒能檢出其中的2例，表明c試劑盒的檢測敏感性低于其他三種；4種試劑盒在精密度實(shí)驗(yàn)中檢測樣本得到的Ct值的CV值都較接近，且都＜10%；加入了8種常見的高濃度干擾物質(zhì)的臨界陽性樣本經(jīng)4種試劑盒檢測，結(jié)果依然為弱陽性，說明無干擾；4種試劑盒檢測5例含非目標(biāo)病毒的臨床樣本，檢測結(jié)果為陰性，即未發(fā)生交叉反應(yīng)。結(jié)論：新冠病毒核酸檢測試劑盒對低濃度核酸樣本的檢測能力有所差異，各試劑盒不同的檢出限也造成了總體上的敏感性和特異性的差異，實(shí)驗(yàn)室在選擇新冠病毒核酸檢測試劑盒時(shí)可以對其進(jìn)行性能驗(yàn)證，以保證選到最合適的試劑盒。

嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV-2）為新型冠狀病毒肺炎疫情的病原體，該病毒主要通過口鼻分泌物傳播，包括咳嗽、打噴嚏和說話產(chǎn)生的呼吸道飛沫，感染該病毒者常見的癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、疲勞、呼吸急促、味嗅覺喪失[1-3]。SARS-CoV-2是一種具有包膜的、不分節(jié)段的正鏈單股RNA病毒，顆粒呈圓形或橢圓形，直徑約80～120nm，包含有核酸及核衣殼蛋白，有三種主要蛋白：包膜蛋白（E蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和刺突蛋白（S蛋白）[4,5]。經(jīng)研究，SARS-CoV-2感染機(jī)制是：在接觸宿主細(xì)胞時(shí)，病毒的S蛋白會經(jīng)歷特定的構(gòu)象變化，使之RBD區(qū)域暴露后與hACE2相結(jié)合，接著通過促進(jìn)S2蛋白介導(dǎo)與細(xì)胞的膜融合完成感染的全過程[6-8]。

在國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》中規(guī)定，實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-Time PCR，RT-PCR）方法與基因組測序、新冠病毒特異性抗體檢測同被作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。而以RT-PCR方法作為檢測技術(shù)的試劑盒是目前獲得醫(yī)療器械注冊證最多的新冠病毒檢測產(chǎn)品，作為主流檢測技術(shù)，RT-PCR相較于常規(guī)的抗原和抗體檢測，具有靈敏度和特異度高、不存在窗口期且不易被干擾的優(yōu)點(diǎn)；相較于宏基因組測序，具有操作簡單、耗時(shí)短和花費(fèi)低的優(yōu)點(diǎn)。RT-PCR檢測新冠病毒核酸試劑盒針對的位點(diǎn)是其基因組的3端保守基因序列，及RdRp基因（位于ORF1ab）、N基因和E基因?！缎滦凸跔畈《靖腥镜姆窝讓?shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南（第四版）》推薦對ORF1ab和N基因設(shè)計(jì)引物和探針進(jìn)行檢測。本文從產(chǎn)品的敏感性與特異性、最低檢出限和精密度三個(gè)方面對市場份額占比較大的4種熒光定量PCR法核酸檢測試劑盒進(jìn)行分析與評價(jià)，以期為各實(shí)驗(yàn)室選擇SARS-CoV-2檢測試劑盒時(shí)提供參考。

1.資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)起止時(shí)間：2022年1月～2022年2月。

樣本：收集20例新型冠狀病毒確診陽性患者（樣本編號為YS-1至YS-20）與10例確診陰性健康人的咽拭子（樣本編號為YS-21至YS-30）作為本次研究的樣本。

檢測試劑：提取試劑選用QIAGEN生產(chǎn)的QIAamp Viral RNA Mini Kit（52904），嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行提取。本研究中用到的4種試劑盒的信息見表1。

表1. 4種新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒基本信息

檢測儀器：ABI 7500熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

嚴(yán)格按照QIAamp Viral RNA Mini Kit的說明書對30例咽拭子提取后，使用Qubit 4.0測量核酸濃度，使用NanoDrop One紫外/可見分光光度計(jì)測量A260/A280比值。

1.2.2 敏感性與特異性

敏感性和特異性是在醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)里評定一個(gè)診斷指標(biāo)時(shí)最基本的兩個(gè)特征，敏感性即在金標(biāo)準(zhǔn)判斷陽性人群中，檢測出陽性的概率，是代表真陽性率，敏感性越高意味著此種檢測方法的漏檢率越低；特異性即在金標(biāo)準(zhǔn)判斷陰性人群中，檢測出陰性的概率，是代表真陰性率，特異性越高意味著此種檢測方法的誤診率越低。嚴(yán)格按照4種試劑盒的說明書對20例新型冠狀病毒確診陽性患者與10例確診陰性健康人的咽拭子提取的RNA進(jìn)行檢測，記錄各個(gè)樣本的Ct值，從而進(jìn)行敏感性與特異性的計(jì)算。

1.2.3 最低檢測限

最低檢出限是指某一分析方法在給定的可靠程度內(nèi)可以從樣品中檢測待測物質(zhì)的最小濃度或最小量，代表著此種方法的靈敏度。根據(jù)檢測的Ct值，選取3例不同陽性水平的樣本，分別進(jìn)行5倍、10倍、50倍和100倍稀釋（樣本編號1-5代表1號樣本稀釋5倍，以此類推），再用各個(gè)試劑盒對其進(jìn)行檢測，記錄結(jié)果比較各試劑盒的最低檢出限。

1.2.4 精密度

精密度用來表示檢測的再現(xiàn)性，可用來衡量體外診斷試劑批內(nèi)與批間、日內(nèi)與日間、室內(nèi)與室間等的變異程度。根據(jù)檢出限研究的檢測結(jié)果，使用健康人提取的RNA與新冠病毒確診陽性的患者RNA混合配制成中陽性水平樣品1例[編號為M（1）～M（16）]，弱陽性水平樣品[編號為L（1）～L（16）]1例，再將幾例陰性RNA混合成陰性樣品[編號為N（1）～N（16）]1例，用三批試劑進(jìn)行批內(nèi)、批間、日間、人間、室間的精密度比較研究。安排兩個(gè)實(shí)驗(yàn)員使用三批次試劑在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室完成，每例樣本總共重復(fù)16次。

1.2.5 干擾研究

根據(jù)這些試劑盒所檢測樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源性和外源性干擾物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，具體干擾物質(zhì)及其濃度見表2。本實(shí)驗(yàn)采用弱陽性水平樣本[樣本編號為L（1）～L（8）]，將每種干擾物質(zhì)添加到樣本中使其成為潛在最大濃度，然后在此條件下進(jìn)行評價(jià)，見表2。

表2. 干擾物質(zhì)列表

1.2.6 交叉反應(yīng)

搜集含非目標(biāo)病毒但不含甲型流感病毒的臨床樣本，使用4種試劑盒進(jìn)行檢測，考察目標(biāo)病毒（新型冠狀病毒）的檢測結(jié)果是否符合預(yù)期?？偣彩占?例樣本，各樣本所含病毒信息見表3。

表3. 交叉反應(yīng)用樣本信息表

2.結(jié)果

2.1 敏感性、特異性

由表4可見，各試劑盒分別能檢出陽性樣本例數(shù)18～20例不等，導(dǎo)致敏感性為90%～100%不等，可見各試劑盒的敏感性差異不大，且均在90%以上。

表4. 用4種試劑盒檢測的20例咽拭子陽性樣本敏感性結(jié)果

由表5可見，在總共10例陰性樣本中，各試劑盒檢出陰性個(gè)數(shù)均為10例，特異性都較好。

表5. 用4種試劑盒檢測的10例咽拭子陰性樣本特異性結(jié)果

2.2 檢出限

將3例不同陽性水平的樣本分別稀釋后，用4種試劑盒進(jìn)行檢測得到結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示a試劑盒的檢出限最低，靈敏度最高，反之，c試劑盒的檢出限最高，靈敏度最低。

圖1. 用4種試劑盒檢測不同陽性水平樣本的結(jié)果（Ct值）

2.3 精密度

為了比較這4種試劑盒在批內(nèi)與批間、日內(nèi)與日間、人間、室間的精密度，安排了2名實(shí)驗(yàn)員對3例樣本，每例樣本共計(jì)16次的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2、表6。可見不同試劑盒在6個(gè)方面的重復(fù)性的變異系數(shù)（CV%）有較大差異。

圖2. 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6. 變異系數(shù)-陰性樣本(CV%)

2.4 干擾研究

采用總共2種內(nèi)源性和6種常見外源性干擾物質(zhì)對弱陽性水平臨床樣本進(jìn)行干擾研究，結(jié)果（圖3）顯示，這8種干擾物質(zhì)在較高濃度下對4種試劑盒的檢測結(jié)果均無干擾。

圖3. 干擾研究結(jié)果

2.5 交叉反應(yīng)

4種試劑盒檢測5例含非目標(biāo)病毒但不含SARS-CoV-2的臨床樣本，結(jié)果均為陰性（-）。交叉反應(yīng)結(jié)果見表7。

表7. 交叉反應(yīng)結(jié)果

3.討論

由SARS-CoV-2引起的新冠肺炎仍在全球流行，快速準(zhǔn)確地診斷新冠病毒感染是這場疫情防控的關(guān)鍵。核酸檢測是SARS-CoV-2診斷的最主要方法，發(fā)揮著難以取代的作用，而實(shí)時(shí)熒光（RT-PCR）方法檢測新冠病毒的試劑盒是目前市場上最主流的產(chǎn)品，不同試劑盒之間的性能存在差異，決定了對樣本的檢出率和漏檢率的不同，因此性能驗(yàn)證對實(shí)驗(yàn)室選擇試劑盒顯得尤為重要。

在本研究中，對臨床上使用最多的熒光定量PCR法SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行了性能比較，包含了敏感性與特異性、精密度、最低檢出限和分析特異性4個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。4種試劑盒的敏感性從90%～100%不等，結(jié)合最低檢出限驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以得出造成敏感性不同的主要原因就是各試劑盒對低病毒載量樣本的檢測能力不同?？傮w來看，這4種試劑盒的檢出結(jié)果與臨床診斷結(jié)果接近，可以滿足臨床的使用需求，具有較高的臨床適應(yīng)性。