楊小妹,馬康康,高俊茶

【提要】 高脂血癥性胰腺炎在近十年中越來越受到人們的關(guān)注，與其他病因胰腺炎相比，高脂血癥性胰腺炎重癥化比例高，并發(fā)癥更多，預(yù)后更差，具有復(fù)雜的病理生理過程。雖然最新的很多研究揭示了高脂血癥性胰腺炎的發(fā)病機制，但是對于高脂血癥性胰腺炎的分子機制仍然知之甚少，因此，迫切需要對該病的病理生理機制進行進一步研究。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌素/kexin9型是前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族中的一種，由血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞分泌，主要通過調(diào)節(jié)肝臟低密度脂蛋白受體的表達和分泌活性來發(fā)揮作用，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、參與炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)細胞凋亡等作用。有研究發(fā)現(xiàn)，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌素/kexin9型可作為胰腺炎新的診斷分子，參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程，對整體預(yù)后的預(yù)測有一定的作用。遺憾的是，目前，相關(guān)報道尚不多，具體分子作用機制尚不明確，因此，本文將前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌素/kexin9型與高脂血癥性胰腺炎的關(guān)系做一綜述。

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種典型的無菌性內(nèi)源性胰腺損傷形式，表現(xiàn)為局部或胰腺周圍炎癥，甚至為全身性炎癥反應(yīng)綜合征和遠處多臟器損傷。盡管當前臨床上AP的診治水平有所提高，但該病的死亡率仍保持在5%左右[1]。已知在所有病因中，高脂血癥性急性胰腺炎(hypertriglyceridemia acute pancreatitis，HLAP)的癥狀和并發(fā)癥更為嚴重，且易反復(fù)發(fā)作[2]，此外，HLAP病理分級也更為嚴重，更容易迅速進展為壞死性胰腺炎，導(dǎo)致重癥胰腺炎[3]。已有大量研究證實，炎癥介質(zhì)及細胞因子激活并發(fā)級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)在HLAP的發(fā)病機制中發(fā)揮重要地位[4]，在急性反應(yīng)期持續(xù)的全身炎癥反應(yīng)更容易發(fā)展為重癥化。因此，只有充分了解HLAP的病理生理機制，才能識別潛在的重癥急性胰腺炎患者，并使其盡快得到重癥監(jiān)護和恰當治療[5]。

目前游離脂肪酸及炎癥反應(yīng)已成為當前研究的熱點。游離脂肪酸可通過激發(fā)炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)、進而導(dǎo)致細胞膜受體活性改變及細胞器破壞，造成胰腺腺泡細胞損傷進而引發(fā)HLAP。其中由核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)引發(fā)的炎癥變化是造成AP病情加重的原因之一。已知在前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌素/kexin9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type9，PCSK9)介導(dǎo)的炎癥研究中，Toll樣受體4(toll-likereceptor-4，TLR4)/NF-κB通路是影響炎癥的主要信號通路，可以激活NF-κB上調(diào)炎性細胞因子的表達，引起炎癥反應(yīng)[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)，攜帶PCSK9功能減弱基因的患者血漿促炎癥因子IL-6、IL-8及TNF-α水平顯著低于攜帶PCSK9功能增強基因的患者[7]，與全身和血管炎癥之間存在密切關(guān)系[8]。有研究報道，在AP發(fā)病過程中，由于內(nèi)毒素血癥，導(dǎo)致脂多糖升高，刺激肝細胞合成和分泌PCSK9 增加[9]，進一步導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的持續(xù)，引起局部并發(fā)癥的發(fā)生，最終表現(xiàn)為預(yù)后不良，臨床病程反復(fù)[10]。并且有研究提出PCSK9與甘油三酯水平存在正相關(guān)關(guān)系[11]，而甘油三酯水平升高與HLAP密切相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)提示PCSK9可能在HLAP炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因此，明確PCSK9在HLAP的中病理生理機制勢在必行。

1 PCSK9結(jié)構(gòu)

PCSK9是一個74 kDa的酶原，由12個外顯子組成，全長22 kb，編碼692個氨基酸。由4個結(jié)構(gòu)域組成，即N端前結(jié)構(gòu)域、信號肽、催化結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。在后者中，又包含M1、M2和M3三個模塊。含組氨酸最豐富的模塊是M2，包含14個跨結(jié)構(gòu)域組氨酸中的9個(CHRD)，PCSK9由分子量為74 kDa的可溶性原PCSK9在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中通過自催化作用，并從N端釋放分子量為14 kDa的原肽，隨后生成成熟蛋白(60 kDa)。這種自切割對PCSK9的生物學(xué)反應(yīng)和成熟度至關(guān)重要。在自催化之后，會暫時結(jié)合到催化結(jié)構(gòu)域的活性位點上，護送活性的PCSK9貫穿整個細胞，這是該酶所獨有的。前結(jié)構(gòu)域N端抑制PCSK9的轉(zhuǎn)化酶活性，阻止其與周圍底物相互作用。提示前結(jié)構(gòu)域通過釋放催化結(jié)構(gòu)域來調(diào)節(jié)PCSK9的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9在肝臟、小腸和腎臟中廣泛表達，肝臟是PCSK9蛋白發(fā)揮作用的主要靶點，也是PCSK9循環(huán)的主要來源[13]。據(jù)國外研究報道，PCSK9 mRNA還表達在小鼠胰島上，不過PCSK9 mRNA是否在人體胰島上表達尚無報道[14]。

2 PCSK9功能

PCSK9是原蛋白轉(zhuǎn)換酶家族中的第九個成員，于2003年，Abifadel和他的同事在兩個家族性高膽固醇血癥常染色體顯性遺傳的法國家庭中發(fā)現(xiàn)了編碼PCSK9的基因突變，并被確定為膽固醇穩(wěn)態(tài)的參與者[15]。在大腦神經(jīng)元凋亡的情況下，PCSK9 cDNA有一定程度的上調(diào)，因此，經(jīng)鑒定，它最初被命名為神經(jīng)凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換酶1(neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1)[13]，是參與原蛋白激活的分泌蛋白家族的新成員[16]。

PCSK9主要生理功能是調(diào)節(jié)肝臟中低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)半衰期的循環(huán)蛋白。PCSK9在肝臟作為前體蛋白產(chǎn)生后，經(jīng)過分子內(nèi)自催化裂解，由此產(chǎn)生的異源二聚體被分泌進入循環(huán)。PCSK9與LDLR的表皮生長因子前體同源結(jié)構(gòu)域A結(jié)合，并與受體一起內(nèi)化。在酸性條件下，存在于核內(nèi)體中的LDLR和PCSK9之間的親和力增加，導(dǎo)致LDLR的構(gòu)象改變，阻止了LDLR的正常循環(huán)，促使LDLR轉(zhuǎn)運到溶酶體進行降解，使血漿中LDL水平增高，在膽固醇穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[17]。LDLR-PCSK9復(fù)合物發(fā)生細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的機制尚未完全闡明。該復(fù)合物可以通過細胞外核內(nèi)體-溶酶體途徑或通過細胞內(nèi)高爾基-溶酶體途徑到達溶酶體。隨著對PCSK9研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)除可調(diào)控LDLR水平之外，還具有參與炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)細胞凋亡等生物功能。下面就PCSK9與HLAP相關(guān)的炎癥反應(yīng)、脂代謝、細胞凋亡等方面做一闡述。

3 PCSK9致HLAP可能的機制

3.1 PCSK9 與炎癥反應(yīng)

目前已經(jīng)有很多關(guān)于PCSK9對促炎細胞因子影響的研究，有動物實驗結(jié)果表明，感染和炎癥刺激PCSK9的表達。PCSK9基因敲除小鼠表現(xiàn)出炎性細胞因子的產(chǎn)生減少，對脂多糖的反應(yīng)降低，對機體具有保護作用，而PCSK9過表達則會加劇多器官病理損傷以及膿毒癥早期的促炎狀態(tài)。在轉(zhuǎn)基因小鼠的體外實驗中也發(fā)現(xiàn)，升高 PCSK9 濃度可以誘導(dǎo)巨噬細胞LDLR相關(guān)蛋白1的降解，而LDLR相關(guān)蛋白1缺乏則下調(diào)了巨噬細胞中抗炎表型M2表達，同時刺激巨噬細胞表達促炎表型M1，并加強炎癥因子的分泌[18]。

值得注意的是，NF-κB在PCSK9表達介導(dǎo)的炎癥刺激中具有重要的信號傳導(dǎo)作用。巨噬細胞中PCSK9過表達可誘導(dǎo)NF-κB核移位，增加促炎細胞因子mRNA水平和TLR4表達，促進促炎基因的表達，從而導(dǎo)致全身炎癥[12]。相比之下，在oxLDL處理后的巨噬細胞，PCSK9基因敲除顯著減弱了這些影響，有研究表明，由于PCSK9 C末端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域與抵抗素結(jié)構(gòu)同源，推測PCSK9可能通過與TLR4的C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，上調(diào)TLR4的表達，激活TLR4/NF-κB信號通路，從而上調(diào)促炎細胞因子水平[15]。然而，還需要更多的研究來闡明PCSK9激活TLR4/NF-κB通路的機制。還有研究表明，PCSK9與氧化低密度脂蛋白受體-1(oxidized LDL receptor-1，LOX-1)以相互促進的方式相互作用，增加對oxLDLs的攝取，oxLDLs作為配體結(jié)合TLR4，激活NF-κB從而上調(diào)炎性細胞因子的表達，誘導(dǎo)促炎狀態(tài)[19]。這些觀察表明PCSK9調(diào)控TLR4的表達和NF-κB的激活以及與LOX-1以相互促進的方式相互作用，促進炎癥的表達。

近年來，大量的研究數(shù)據(jù)證實了NF-κB的激活和氧化應(yīng)激在AP發(fā)生、發(fā)展過程具有損傷和促進作用[20]。盡管NF-κB在腺泡內(nèi)激活的機制尚不清楚，但有研究表明，病理鈣信號、蛋白C亞型激活和活性氧產(chǎn)物的生成啟動了腺泡內(nèi)NF-κB炎癥級聯(lián)反應(yīng)，并且抑制該活性可減輕AP的嚴重程度[21]，因此，認為NF-κB活化是炎癥進展的關(guān)鍵步驟。1998年，Gukovsky等首次報道了AP期間腺泡細胞NF-κB的活化。并表明病理性胰蛋白酶原激活的缺失并不影響腺泡內(nèi)NF-κB的激活，NF-κB激活是一個獨立于胰蛋白酶原激活的早期事件，并在誘發(fā)AP中充分發(fā)揮作用[22]。然而，目前還不清楚發(fā)展為AP是否同時需要這兩個條件。正常生理條件下TLR4/ NF-κB通路的活化可激活機體免疫應(yīng)答，然而炎癥級聯(lián)反應(yīng)是在天然免疫反應(yīng)開始之前通過NF-κB的激活在腺泡細胞中開始的，并且通過TLR促發(fā)的髓樣分化因子88途徑啟動有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[23]，同時釋放的炎癥因子又可以作為激活物激活NF-κB，放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致病情進一步加重。此外，也研究證實，柴苗皂苷a通過與NF-κB密切相互作用，抑制其信號通路，隨后抑制AP相關(guān)促炎細胞因子的釋放，對炎癥反應(yīng)起到保護作用，減輕器官損傷[1]。可以看出，在AP的發(fā)病機制中，NF-κB在將初始腺泡損傷與全身炎癥聯(lián)系起來中起著核心作用。因此，PCSK9在NF-κB信號通路中可能作為一個新的靶點參與調(diào)節(jié)AP的炎癥反應(yīng)過程。

3.2 PCSK9與細胞凋亡

細胞凋亡是一種不引起炎癥反應(yīng)的程序性細胞死亡，細胞凋亡的復(fù)雜性一直是眾多研究的焦點，已知p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 motigen-activated protein kinase， MAPK)通路是真核生物信號網(wǎng)絡(luò)中最重要的信號通路之一，參與多種細胞功能，特別是細胞增殖、分化和凋亡。有動物實驗表明，在載脂蛋白E基因敲除的小鼠中，PCSK9可通過c-Jun氨基末端激酶/MAPK信號途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡[24]。Ece等[23]揭示了oxLDL刺激引起的血管內(nèi)皮細胞凋亡增加與PCSK9過表達之間的相關(guān)性。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制PCSK9表達可影響B(tài)cl-2/Bax比值的變化，降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinecontaining aspartate-specific proteases9和3，Caspase9和3 ) 的活性，明顯抑制oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡。有研究結(jié)果表明，oxLDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡及PCSK9和LOX-1的表達，用PCSK9 siRNA預(yù)處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞可阻斷oxLDL的上述作用，提示PCSK9 siRNA可抑制oxLDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡，其中Bcl/Bax-caspase9-caspase3通路可能通過降低Bcl-2/Bax比值，抑制caspase9和caspase3的激活而發(fā)揮作用[25]。PCSK9抑制也降低了c-Jun氨基末端激酶和p38的磷酸化，后者在氧化應(yīng)激、IL-1、TNF-α和G蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)的細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[26]。另外也有研究表示，脂多糖處理培養(yǎng)的平滑肌細胞可刺激PCSK9的釋放，在活性氧的參與下通過p38MAPK信號通路誘導(dǎo)線粒體DNA的損傷，進而導(dǎo)致平滑肌細胞凋亡[27]。

田璐[28]等發(fā)現(xiàn)，AP時胰液異常釋放引起的胰腺細胞內(nèi)MAPK活化主要與胰腺細胞的凋亡有關(guān)。在機體受到缺氧、缺血以及炎性因子等刺激下，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間平衡的改變導(dǎo)致了細胞凋亡的發(fā)生。進一步激活下游caspase-3級聯(lián)反應(yīng)從而誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，有動物實驗表明，小鼠肝臟中p38-MAPK磷酸化和caspase-3切割與AP的誘導(dǎo)及Fas配體的上調(diào)有關(guān)，提示藍素誘導(dǎo)的AP上調(diào)肝臟中促凋亡通路，促進肝細胞損傷和肝細胞死亡[29]。朱等[30]研究顯示，黃芩素可下調(diào)肺組織中p-p38MAPK和Bax表達，上調(diào)Bcl-2表達，進而改善胰腺的病理損傷。早在1999年Gomez等人便得出，多種基因在AP發(fā)生時被激活進而用于調(diào)控胰腺腺泡細胞凋亡。在脂多糖刺激之前給予p38抑制劑處理，脂多糖所致的中性粒細胞凋亡明顯增強，說明抑制p38途徑能調(diào)節(jié)脂多糖刺激后中性粒細胞內(nèi)ERK-MAPK途徑的激活，促進急性炎細胞凋亡，從而減輕對正常組織的損傷作用[31]。

3.3 PCSK9與脂質(zhì)代謝

Shirya等[32]首次提出了PCSK9在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平驅(qū)動腸細胞合成載脂蛋白B和甘油三酯，并表示PCSK9刺激膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1脂肪酸/甘油三酯生物合成途徑中靶基因的表達，從而增加腸細胞中間密度脂蛋白的合成，這可能是PCSK9促進細胞內(nèi)甘油三酯生物合成的原因之一。有研究提出血漿PCSK9和甘油三酯水平之間的正相關(guān)是間接的，PCSK9通過消耗LDLR而阻止中間密度脂蛋白和乳糜微粒殘余物的代謝從而升高甘油三脂，也可能通過對其他LDLR樣受體，如CD36、VLDL受體的降解來升高甘油三酯[10]。但也有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PCSK9抑制劑并未對VLDL載脂蛋白B和VLDL甘油三酯生成有影響，但它能增加VLDL載脂蛋白B和VLDL甘油三酯的分解代謝，表明PCSK9可能并不影響甘油三脂的脂蛋白生成，而只影響其清除[33]。而且PCSK9抑制劑對甘油三酯水平的影響，不同的研究結(jié)果差異很大，甘油三酯下降范圍從3.3%～33.7%不等[34]。Hitoshi等[35]指出，PCSK9除了作為肝臟LDL代謝的中介外，也與胰島素抵抗和甘油三酯水平呈正相關(guān)，是腸道富含甘油三酯的ApoB脂蛋白代謝的重要調(diào)節(jié)因子，通過影響富含甘油三酯顆粒的LDL代謝而影響血清甘油三酯水平。PCSK9基因的功能缺失突變也將導(dǎo)致富含甘油三酯的脂蛋白減少，甘油三酯水平降低[36]。

高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia，HTG)導(dǎo)致胰腺炎的機制目前尚不完全清楚，最早由Havel提出的一個被廣泛接受的機制，即滲出到胰腺腺泡細胞外的胰脂肪酶水解胰腺內(nèi)和胰腺周圍的甘油三脂，導(dǎo)致游離脂肪酸增多引起胰腺局部缺血以及酸堿失衡，進一步增加了游離脂肪酸的細胞毒性，擴大炎癥反應(yīng)[37]。Saharia等[38]人的實驗研究支持了這一假設(shè)，用脂肪酸灌注胰腺會導(dǎo)致胰腺制劑的水腫和出血，此外，在AP動物模型中，HTG已被證明有助于并加速炎癥級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎性細胞因子，導(dǎo)致HLAP。這些研究進一步印證了HTG對胰腺的損傷，從而誘發(fā)HLAP。目前研究證實PCSK9與甘油三酯水平密切相關(guān)，因此PCSK9在HLAP的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用，有望成為HLAP相關(guān)研究的新靶點。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，PCSK9可通過NF-κB通路調(diào)控炎癥反應(yīng)，以及通過MAPK通路調(diào)節(jié)細胞凋亡，此外，還發(fā)現(xiàn)PCSK9具有參與脂代謝，調(diào)控甘油三酯水平的作用。已知HLAP的病理生理過程不僅有炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的參與，而且高甘油三脂水平也參與其中，因此，PCSK9與HLAP的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。但是相關(guān)機制是復(fù)雜的，有許多未知的病理生理機制需要去探索，需要更多的動物及臨床實驗進行專門的驗證。鑒于上述理論和實踐基礎(chǔ)，我們將在臨床上進行相關(guān)實驗研究，為診治HLAP提供新的靶點，旨在為HLAP患者帶來的福音。