黃向業(yè) 張茜 孫方利 李金光 趙靜

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬濟(jì)南市章丘人民醫(yī)院 1.骨關(guān)節(jié)科；2.宣傳科；3.超聲醫(yī)學(xué)科；4.臨床實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250200

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是臨床常見病，病因復(fù)雜。以往認(rèn)為，腰椎間盤病變是由生理性退變、椎間盤損傷、脊柱過度負(fù)荷、吸煙等多種因素引起［1-2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素在椎間盤病變發(fā)生、發(fā)展中可能扮演著重要的角色［3-4］。有研究顯示，人類在近20歲時椎間盤開始持續(xù)退變，并且隨年齡的增長不斷加重［5］。眾多國內(nèi)外研究人員一致認(rèn)為腰椎間盤的退變與LDH的發(fā)病聯(lián)系緊密［1］，是其基本病因。隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的迅速發(fā)展以及細(xì)胞因子研究的深入，炎性細(xì)胞因子在椎間盤退變中的作用越來越受到重視，它可能在椎間盤退行性變的病理生理過程中發(fā)揮重要作用［6-7］。IL-6作為重要的促炎因子，在突出的椎間盤組織及周圍組織中均有較高的表達(dá)活性，且與其他細(xì)胞因子和化學(xué)介質(zhì)關(guān)系密切，與LDH的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［8］。雖然IL-6部分基因位點(diǎn)的基因多態(tài)性與LDH的相關(guān)性已有學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究，但是IL-6的基因多態(tài)性與腰椎退變程度的關(guān)系較少有相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究主要觀察IL-6的基因多態(tài)性與LDH及腰椎退變程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選擇2018年10月至2020年9月在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和章丘區(qū)人民醫(yī)院骨科住院的患者682例，根據(jù)其臨床癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查、手術(shù)中的發(fā)現(xiàn)，分為病例組（LDH組）321例和對照組（非LDH組）361例。

病例組（LDH組）病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診為LDH的患者；②年齡18～60歲；③近三代直系親屬均為漢族。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝腎疾病、心腦血管、呼吸系統(tǒng)或精神病患者；②合并血液病、糖尿病、自身免疫性疾病、腫瘤等；③體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）＜18.5 kg/m2或＞28.0 kg/m2。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照胥少?。?］主編的《實(shí)用骨科學(xué)》第3版。

對照組（非LDH組）納入標(biāo)準(zhǔn)：漢族，年齡18～60歲，既往無腰腿痛病史，家族中無腰腿痛病史，無骨性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕、類風(fēng)濕病、紅斑性狼瘡等結(jié)締組織病，多以外傷骨折、肌腱血管損傷等診斷為主而住院者。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有LDH病史，家族中有腰椎間盤突出癥病史者，腫瘤患者。

該項研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行，并取得了所有患者知情同意。

1.2 標(biāo)本收集方法

抽取兩組患者外周靜脈血作為檢測樣本。所有研究對象抽血前空腹8 h后，均于早上抽取外周血3～5 mL作為檢測樣本，然后注入含抗凝劑的真空管中混勻，置于4℃冰箱保存待用。

1.3 主要儀器與試劑

高速離心機(jī)（EBA 12，Hettich Germany），紫外分光光度計（上海復(fù)日科技有限公司），7500實(shí)時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），全血DNA抽提試劑盒（QIAamp Blood Kit，德國Qiagen公司），Ex Taq DNA聚合酶（日本TAKARA公司），等位基因分型試劑（美國ABI公司）。

1.4 基因多態(tài)性分析

檢測指標(biāo)包括IL-6啟動區(qū)基因-572C/G和-174G/C，利用TaqMan探針技術(shù)對其進(jìn)行基因多態(tài)性檢測并進(jìn)行基因分型?；蚨鄳B(tài)性分析主要步驟：①DNA的提?。翰杉锌鼓齽┑耐庵苎?.0 mL，使用全血DNA抽提試劑盒獲取基因組DNA，操作按照說明書進(jìn)行。取DNA樣本2μL，用紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度，將DNA檢測合格的樣本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。②引物合成：采?500實(shí)時熒光定量PCR儀隨機(jī)軟件Primer Express3.0進(jìn)行引物和探針的設(shè)計。針對每一個基因位點(diǎn)設(shè)計2條探針，分別采用VIC和FAM進(jìn)行熒光標(biāo)記。所有引物均由invitrogen公司合成。③位點(diǎn)SNP分型：實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為10μL，其中2×TaqMan等位基因分型預(yù)混液5 μL，40×引物探針混合液0.25μL，DNA 2μL，dd H2O2，75μL。反應(yīng)條件為95℃10 min，95℃10 s，60℃1 min，共40個循環(huán)。儀器自動收集熒光信號，軟件分析給出SNP分型結(jié)果。

1.5 主要觀察指標(biāo)

記錄兩組患者的基本情況、患者體質(zhì)量指數(shù)、吸煙指數(shù)（smoking index，SI）及IL-6基因多態(tài)性分布情況和椎間盤退變程度。

1.5.1 吸煙指數(shù) 按平均每天吸煙支數(shù)乘以吸煙年限評價，參考Battie等方法劃分為不吸煙和吸煙兩個等級，不吸煙指從未吸過煙和SI＜100的個體，吸煙指吸過煙而且SI≥100的個體。由3位經(jīng)過培訓(xùn)的課題調(diào)查員通過問卷調(diào)查后提出分類意見。

1.5.2 BMI采用國際通用方法，超重、肥胖判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國際生命科學(xué)會中國辦事處中國肥胖問題工作組對中國成人體質(zhì)量指數(shù)分類的推薦意見中建議標(biāo)準(zhǔn)分為過輕、超重、肥胖及正常體質(zhì)量4個等級。其中BMI＜18.5 kg/m2為體重過輕，24 kg/m2≤BMI≤28 kg/m2為超重，BMI＞28kg/m2為肥胖，18.6 kg/m2≤BMI≤23.9 kg/m2為正常體質(zhì)量。由3位經(jīng)過培訓(xùn)的課題調(diào)查員測量研究對象的身高、體質(zhì)量并將計算結(jié)果同以上相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較歸類。

1.5.3 椎間盤退變程度 病例組均行腰椎MRI檢查，應(yīng)用GE超導(dǎo)型1.5T磁共振成像系統(tǒng)行腰椎矢狀位掃描和L1-S1椎間盤橫軸位掃描，均在正中矢狀面MRI圖像上根據(jù)T2加權(quán)像椎間盤信號強(qiáng)度判定腰椎間盤退行性變的程度，具體參考Gibson等標(biāo)準(zhǔn)劃分為5個等級。0級：強(qiáng)信號；1級：較強(qiáng)信號；2級：中等強(qiáng)度信號；3級：較弱信號；4級：無信號。其中0級為正常椎間盤，1～2級分別為輕度、中度退變椎間盤，3～4級為重度退變椎間盤。退變程度取突出節(jié)段及相鄰椎間盤退變均值。由3位資深MRI診斷醫(yī)師盲法閱片并提出分類意見。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

以Hardy-Weinberg平衡檢查樣本是否具有群體代表性。IL-6基因型及等位基因頻率采用頻率計數(shù)法計算，研究對象基因型與等位基因頻率的比較均采用χ2檢驗(yàn)，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，比值比（OR）計算采用Logistic回歸分析，各基因型間的MRI分級差異性采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 受試者數(shù)量分析

納入對象病例組321例、對照組361例均進(jìn)入結(jié)果分析，無中途退出者。

2.2 受試者基線資料

兩組患者的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 受試者基線資料［±s，n（%）］

表1 受試者基線資料［±s，n（%）］

基本資料年齡（歲）性別（男/女）BMI（kg/m2）SI≥100病例組43.89±9.21 208/113 24.28±1.08 122/38.12對照組42.51±10.03 230/131 24.31±1.95 146/40.32 t/χ2 1.866 0.087-0.256 0.423 P 0.062 0.768 0.798 0.515

2.3 IL-6基因多態(tài)性分析

經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，病例組（χ2=1.674，P=0.433）和對照組（χ2=5.255，P=0.072）的基因位點(diǎn)-572C/G基因型均滿足Hardy-Weinberg遺傳平衡，并且病例組和對照組總體基因型（χ2=4.78，P=0.091）也滿足Hardy-Weinberg遺傳平衡。IL-6基因型、等位基因分布頻率的比較，見表2～5。

IL-6-572C/G基因型頻率的差異性分析結(jié)果顯示，病例組和對照組的基因型CC、CG、GG頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=16.066，P＜0.001），等位基因C/G頻率的差異性分析結(jié)果顯示，病例組和對照組的基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.700，P＜0.001）。

IL-6-572C/G基因型頻率的相對風(fēng)險分析發(fā)現(xiàn)，CG基因攜帶者患LDH的風(fēng)險是CC基因型的1.545倍（95%CI：1.128～2.117，P=0.007）；GG基因攜帶者患LDH的風(fēng)險是CC基因型的4.426倍（95%CI：1.730～11.321，P=0.002）。等位基因G攜帶者患LDH的風(fēng)險是C患者的1.617倍（95%CI：1.252～2.087，P＜0.001）。見表2。

表2 病例組與對照組IL-6-572C/G基因型、等位基因分布頻率差異性和相對風(fēng)險分析［n（%）］

IL-6-174 G/C位點(diǎn)有GG、CG 2種基因型，以GG型為主；經(jīng)Hardy-weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，對照組（χ2=0.937，P=0.626）和病例組（χ2=0.484，P=0.785）的基因位點(diǎn)-174G/C基因型均滿足Hardy-Weinberg遺傳平衡，并且對照組和病例組總體基因型（χ2=1.417，P=0.492）也滿足Hardy-Weinberg遺傳平衡。

IL-6-174 G/C基因型頻率的差異性分析結(jié)果顯示，病例組和對照組的GG/CG基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.058，P=0.304），等位基因頻率的差異性分析結(jié)果顯示，病例組和對照組的基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.011，P=0.315）。

IL-6-174 G/C基因型頻率的相對風(fēng)險分析發(fā)現(xiàn)，CG基因與GG基因攜帶者患LDH的風(fēng)險比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.305）；等位基因G攜帶者與C攜帶者患LDH的風(fēng)險比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.316）。見表3。

表3 病例組與對照組IL-6-174 G/C基因型、等位基因分布頻率差異性和相對風(fēng)險分析［n（%）］

2.4 IL-6基因多態(tài)性與LDH椎間盤退變的關(guān)系

321例LDH患者均行MRI檢查，并根據(jù)Gibson分級判定LDH患者的腰椎退變程度。IL-6-572C/G基因多態(tài)性分布與MRI分級有相關(guān)性：經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，IL-6-572C/G各基因型間的MRI分級有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=11.803，P=0.003）。具體見表4。

表4 321例腰椎間盤突出癥患者IL-6-572C/G基因多態(tài)性與椎間盤退變程度的關(guān)系［n（%）］

IL-6-174 G/C基因多態(tài)性分布與MRI分級無相關(guān)性：經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，IL-6-174G/C各基因型間的MRI分級無統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=0.007，P=0.953）。具體見表5。

表5 321例患者IL-6-174G/C基因多態(tài)性與椎間盤退變程度的關(guān)系［n（%）］

3 討論

LDH的好發(fā)年齡為20～50歲，是導(dǎo)致腰腿痛的最常見的原因。有研究表明，各種炎癥因子在腰椎間盤退變和神經(jīng)根性疼痛中扮演著重要的角色［7］，它既是椎間盤退變的結(jié)果，又是重要的炎性促進(jìn)劑，進(jìn)一步加劇了椎間盤的退變［10］，形成惡性循環(huán)。腰腿痛由炎性反應(yīng)引起，其主要機(jī)制為各種生物化學(xué)因子引起基質(zhì)金屬蛋白酶家族的活性變化，加快椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的降解進(jìn)程，最終引起椎間盤的退變；而慢性炎癥主要是由炎性因子引起，它包括促炎因子和抗炎因子，這兩種因子決定著炎癥的發(fā)展變化趨勢。促炎因子和抗炎因子的基因多態(tài)性與其自身表達(dá)水平有關(guān)，因此二者的基因多態(tài)性在慢性炎癥的形成過程中也具有重要的作用［11］。

IL-6是一種由184個氨基酸組成的糖蛋白，它是由激活的炎癥細(xì)胞如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要的促炎癥細(xì)胞因子。IL-6基因啟動子區(qū)的基因變異，可導(dǎo)致個體間IL-6基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的差異，從而影響到個體產(chǎn)生IL-6的水平和相關(guān)性疾病的易感性，進(jìn)而成為一些疾病發(fā)生發(fā)展的遺傳相關(guān)因子［12］。IL-6-572基因?qū)L-6的基因轉(zhuǎn)錄有調(diào)控功能，其多態(tài)性可能影響IL-6的水平；并且多項研究表明，該多態(tài)性可以影響健康個體的骨密度水平、代謝特點(diǎn)以及腎移植患者的存活率、糖尿病腎病患者的嚴(yán)重程度［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6-572GG基因型及G等位基因頻率均高于對照組，而CC基因型頻率低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；提示IL-6啟動區(qū)基因-572C/G多態(tài)性可以影響中國漢族人群腰椎間盤突出癥的發(fā)病易感性，G等位基因可能是該人群腰椎間盤突出癥發(fā)生的遺傳危險因素和易感因子。有研究表明，IL-6基因啟動子區(qū)域-174位點(diǎn)存在G/C單核苷酸多態(tài)性，直接影響轉(zhuǎn)錄的效率［14］。將其他種族和地區(qū)人群IL-6基因多態(tài)性研究結(jié)果與本研究結(jié)果綜合分析發(fā)現(xiàn)，不同種族間基因分布及等位基因頻率均存在顯著差異。由于IL-6-174位點(diǎn)突變率很低，在我國LDH的發(fā)病機(jī)制中不是主要危險因素。

遺傳因素在LDH發(fā)病中的作用受到國內(nèi)外眾多學(xué)者的重視。Videman等［3］通過對孿生子的觀察指出，遺傳因素是椎間盤退變過程中不可或缺的重要因素。國內(nèi)外眾多研究顯示，成人和青少年LDH患者都有明顯的家族聚集性，比如父母、子女均發(fā)病或者兄弟姊妹均發(fā)病等［4］。并且炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制、腫瘤壞死因子（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β等基因多態(tài)性與腰椎間盤退變有關(guān)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶IL-6-572C/G基因GG基因型和CG基因型者椎間盤退變程度較攜帶CC基因型者嚴(yán)重，攜帶IL-6-174 G/C基因CG和GG基因型者椎間盤退變程度無明顯差異，說明IL-6-572C/G基因其G等位基因可能參與了椎間盤的退變過程。

綜上所述，我們認(rèn)為IL-6-572C/G多態(tài)性可能是中國北方地區(qū)漢族人群腰椎間盤突出癥發(fā)病的遺傳危險因素之一，其G等位基因可能參與了椎間盤的退變進(jìn)程。此研究結(jié)果為進(jìn)一步開展腰椎間盤突出癥的病因?qū)W以及遺傳學(xué)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于IL-6的分泌在遺傳水平受到多方面因素的影響，并且腰椎間盤突出癥和慢性炎癥是一種多基因及多因素聯(lián)合作用的復(fù)雜病理過程，因此有待于進(jìn)行更大樣本量、前瞻性、多種族的病例-對照研究，尋找更多的證據(jù)加以驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突