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煙酸促進(jìn)小腸RORγt+Tregs穩(wěn)態(tài)的維持

2022-11-22 02:31:32耿鈺鑫陳正濤張鐘允董波古惠文李欣雨賈凌云王新孫方園唐華
關(guān)鍵詞:煙酸亞群小腸

耿鈺鑫 陳正濤 張鐘允 董波 古惠文 李欣雨 賈凌云 王新 孫方園 唐華,

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新中心,山東 濟(jì)南 250117;2.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)院(省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),山東 濟(jì)南 250117;3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(山東省千佛山醫(yī)院),山東 濟(jì)南 250013

腸道Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Foxp3+Treg)分為Helios+Treg、RORγt+Treg和Helios-RORγt-Treg 3個(gè)亞群,對(duì)腸道免疫穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮重要調(diào)控作用。RORγt+Treg是一群腸道菌群依賴的誘導(dǎo)性Treg,2011年Atarashi等[1]描述Helios-Treg亞群發(fā)育依賴于腸道菌群,而且共生梭菌屬發(fā)揮重要作用,2013年Furusawa等[2]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),共生菌群的代謝產(chǎn)物可以誘導(dǎo)其分化發(fā)育,2015年兩個(gè)課題組同時(shí)對(duì)這一細(xì)胞在腸道免疫穩(wěn)態(tài)維持中的作用進(jìn)行了描述[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸以及次級(jí)膽汁酸對(duì)腸道RORγt+Tregs的穩(wěn)態(tài)具有重要調(diào)控作用[5-6],是否還有其他腸道菌群的代謝產(chǎn)物也對(duì)RORγt+Tregs的維持具有重要調(diào)控作用目前尚不清楚。

煙酸屬于維生素B族,又稱為維生素B3,可由腸道菌群代謝產(chǎn)生[7],Singh等[8]研究發(fā)現(xiàn)抗生素清除腸道菌群可導(dǎo)致腸道Treg穩(wěn)態(tài)失調(diào),而補(bǔ)充煙酸能夠恢復(fù)腸道Treg的比例,但煙酸是否對(duì)腸道RORγt+Treg亞群的穩(wěn)態(tài)維持有作用以及機(jī)制目前還不清楚。本研究通過(guò)給小鼠口服抗生素,破壞小腸固有層RORγt+Treg穩(wěn)態(tài)賴以維持的菌群微環(huán)境,探討口服煙酸對(duì)RORγt+Treg比例及增殖變化的影響,為腸道菌群紊亂導(dǎo)致的腸道炎癥型疾病的預(yù)防及治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠,6~8周齡,體質(zhì)量18~20 g,購(gòu)買(mǎi)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究中心SPF動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)操作符合山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 抗小鼠CD3e Biotin(eBioscience,13-0031-85),CD4-APC(Invitrogen,17-0041-82),CD8-APC-eFluor 780(Invitrogen,47-0081-82),F(xiàn)oxp3-PE(Invitrogen,12-5773-82),Helios-FITC(Invitrogen,11-9883-82),Ki67-PE-Cyanine7(Invitrogen,25-5698-82),GATA3-PerCP-eFluor 710(Invitrogen,46-9966-42),RORγt-BV421(BD,562894),BV650 Streptavidin(BD,563855),破膜固定液(Invitrogen,00-5223-56),Ⅷ型 膠 原 酶(Sigma,C2139-5G),Percoll細(xì)胞分離液(GE,17089101),新生牛血清(四季青,22011-8612),HEPES(SIGMA,H3537),EDTA(Invitrogen,15575-038),DTT(Solarbio,D8220),1640培 養(yǎng) 基(Cytiva,SH30809.01),萬(wàn) 古 霉 素(Meilunbio,MB1260-4),甲 硝 唑(Sigma-Aldrich,M3761),新霉素(Fisher Scientific,SR0163H),氨芐青 霉 素(Sigma-Aldrich,A5354),煙 酸(Sigma-Aldrich,72309),流式細(xì)胞儀(BD,LSRFortessa),水平離心機(jī)(Thermo Fisher,XIR),搖床(SHAKER INCUBATOR,TS-100B)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥C57BL/6小鼠共隨機(jī)分為四組:對(duì)照組(Ctrl,n=5)正常飲水;抗生素處理組(VMNA,n=5)飲水中添加0.5 mg/mL萬(wàn)古霉素,1 mg/mL甲硝唑,1 mg/mL新霉素,1 mg/mL氨芐青霉素,連續(xù)飲水用藥7 d;煙酸處理對(duì)照組(Niacin,n=5)飲水中添加終濃度為25 mmol/L的煙酸,連續(xù)飲水用藥7 d;煙酸實(shí)驗(yàn)組(VMNA+Niacin,n=5)需同時(shí)在飲水中添加上述抗生素混合以及終濃度為25 mmol/L的煙酸,連續(xù)飲水用藥7 d。

1.2.2 小鼠小腸單細(xì)胞制備 采用頸椎脫臼法處死小鼠,取出小腸,去除腸內(nèi)容物、腸系膜以及派氏結(jié),沿長(zhǎng)軸剖開(kāi),放入PBS中涮洗干凈,剪成數(shù)段放入緩沖溶液中;使用搖床220 r/min震蕩20 min去除腸上皮,重復(fù)2次;將腸段轉(zhuǎn)移到1.5 mg/mLⅧ型膠原酶中,37oC消化16 min,過(guò)濾離心;使用36%Percoll液1 400 r/min離心20 min,獲得小腸固有層淋巴細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)染色方法 將獲得的細(xì)胞計(jì)數(shù),使用CD3e Biotin(1∶50)、CD4-APC(1∶200)、CD8-APC-eFluor 780(1∶100)、BV650 Streptavidin(1∶800)進(jìn)行表面標(biāo)記染色,標(biāo)記死細(xì)胞后使用染色固定液固定30 min后,標(biāo)記Foxp3-PE(1∶50)、Helios-FITC(1∶100)、Ki67-PE-Cyanine7(1:1600)、GATA3-PerCP-eFluor 710(1∶100)和RORγt-BV421(1∶100)60 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 抗生素處理導(dǎo)致小腸腸道固有層RORγt+Treg比例降低

使用廣譜抗生素混合以及抗生素單獨(dú)飲水處理C57BL/6小鼠后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)小腸固有層Treg細(xì)胞以及RORγt+Treg細(xì)胞亞群比例變化,結(jié)果顯示,無(wú)論單獨(dú)還是混合使用抗生素,小腸腸道固有層Treg細(xì)胞比例及相對(duì)數(shù)量均出現(xiàn)顯著的升高或升高趨勢(shì)(圖1A)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),抗生素混合處理組中菌群依賴的RORγt+Treg細(xì)胞亞群比例降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而抗生素的單獨(dú)使用對(duì)于這一亞群的影響較小或者沒(méi)有影響(圖1B)。

圖1 C57BL/6小鼠飲水抗生素7 d后小腸固有層RORγt+Treg細(xì)胞的比例

2.2 煙酸恢復(fù)抗生素處理后小腸固有層RORγt+Treg的比例

為了研究菌群代謝產(chǎn)物煙酸在菌群缺失的情況下對(duì)小腸固有層RORγt+Treg比例變化的影響,本研究在上述聯(lián)合抗生素組的飲水中添加煙酸,7 d后檢測(cè)發(fā)現(xiàn),抗生素處理下調(diào)了小腸固有層RORγt+Treg以及TH17的比例,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而煙酸能夠拯救因腸道菌群缺失導(dǎo)致的小腸固有層RORγt+Treg比例的降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B,P<0.05),但對(duì)TH17則沒(méi)有顯著作用(圖2C,P>0.05)。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小腸固有層RORγt+Treg以及TH17的RORγt蛋白的平均熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity,MFI),結(jié)果顯示,抗生素處理以及煙酸單獨(dú)處理后兩者M(jìn)FI均降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2D,P<0.01),抗生素處理并補(bǔ)充煙酸后兩者的MFI也沒(méi)有出現(xiàn)顯著的恢復(fù)(圖2D,P>0.05)。

圖2 飲水中添加煙酸能夠顯著恢復(fù)聯(lián)合抗生素組小腸固有層RORγt+Treg比例

2.3 煙酸恢復(fù)抗生素處理組小腸固有層RORγt+Tregs的增殖

為了驗(yàn)證煙酸是否具有促進(jìn)RORγt+Treg增殖的作用,本研究檢測(cè)了RORγt+Tregs細(xì)胞Ki67增殖蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,抗生素處理組中小腸固有層RORγt+Treg以及TH17細(xì)胞的Ki67蛋白表達(dá)水平下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而添加煙酸后,與對(duì)照組相比表達(dá)Ki67的RORγt+Treg比例升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A,P<0.01)。而對(duì)于小腸固有層的TH17,煙酸的補(bǔ)充并不能夠恢復(fù)其增殖能力(圖3B)。

圖3 煙酸促進(jìn)小腸固有層RORγt+Treg的增殖

3 討論

小腸口服耐受的打破是導(dǎo)致機(jī)體食物過(guò)敏的原因之一[9],人類(lèi)腸道包含有將近1015個(gè)腸道共生菌,腸道菌群的組成影響腸道固有層內(nèi)大多數(shù)免疫細(xì)胞亞群的穩(wěn)態(tài)或功能[10],這對(duì)機(jī)體食物過(guò)敏反應(yīng)具有保護(hù)作用[11-12]。Treg是一類(lèi)調(diào)控免疫穩(wěn)態(tài)及免疫反應(yīng)的T細(xì)胞亞群[13],在食物過(guò)敏、自身免疫、炎癥及微生物和腫瘤的免疫反應(yīng)中具有重要作用。RORγt+Treg亞群主要存在于腸道固有層,其發(fā)育依賴于腸道共生菌群[14],目前對(duì)于腸道共生菌群調(diào)控RORγt+Tregs的發(fā)育機(jī)制還不清楚。Ohnmacht等[3]研究發(fā)現(xiàn),Toll樣受體及NOD樣受體家族均不參與RORγt+Treg亞群的發(fā)育,腸道菌群產(chǎn)生的“危險(xiǎn)信號(hào)”可能并沒(méi)有發(fā)揮作用。Smith等[15]研究發(fā)現(xiàn),腸道微生物降解纖維素產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以顯著誘導(dǎo)無(wú)菌小鼠腸道Treg的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn),丁酸鹽飼喂SPF小鼠4周,可以誘導(dǎo)RORγt+Treg亞群的發(fā)育[3],而Sefik等[4]使用抗生素飲水處理2周后,再加入短鏈脂肪酸處理2~3周,發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有明顯誘導(dǎo)RORγt+Treg亞群的發(fā)育,因此推測(cè)短鏈脂肪酸似乎并不是菌群影響RORγt+Treg發(fā)育的唯一因素。

GPR109a在腸道中作為丁酸及煙酸共同受體[16],對(duì)抑制結(jié)腸炎和癌變有重要作用[17-18],還參與誘導(dǎo)結(jié)腸Treg及產(chǎn)生IL-10的T細(xì)胞分化[8]。煙酸屬于維生素B家族,參與人體的脂質(zhì)代謝、氧化和無(wú)氧分解過(guò)程,在抑制炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能[19]。腸道共生菌群可以產(chǎn)生煙酸,Singh等[8]證實(shí),煙酸可以通過(guò)GPR109a參與結(jié)腸Treg穩(wěn)態(tài)的維持。小腸作為食物耐受誘導(dǎo)主要部位,對(duì)小腸RORγt+Treg分化發(fā)育的研究具有重要意義,為了進(jìn)一步探索煙酸對(duì)RORγt+Treg分化發(fā)育的影響,本研究使用抗生素清除腸道共生菌群,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小腸固有層RORγt+Treg亞群的比例及增殖情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小腸固有層RORγt+Treg亞群比例及增殖出現(xiàn)顯著降低。補(bǔ)充煙酸后,RORγt+Treg亞群比例及增殖均出現(xiàn)顯著的恢復(fù),因此作為共生菌群的代謝產(chǎn)物,煙酸在維持小腸固有層RORγt+Treg亞群的增殖中具有非常重要的作用。結(jié)腸中RORγt+Treg比例比小腸更高[4],煙酸能否拯救因菌群紊亂導(dǎo)致的結(jié)腸RORγt+Treg比例的降低,目前還不清楚。Singh等[8]發(fā)現(xiàn),煙酸能夠拯救因抗生素清除腸道共生菌群導(dǎo)致Treg比例的降低,通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移OTII CD4+T細(xì)胞,檢測(cè)來(lái)自于供者的Treg也有相同的變化,提示結(jié)腸內(nèi)RORγt+Treg的穩(wěn)態(tài)可能也受到煙酸的調(diào)控。TH17是新發(fā)現(xiàn)的一種能夠分泌白介素17的T細(xì)胞亞群,在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要意義。腸道分節(jié)絲狀桿菌(segmented filamentous bacteria,SFB)調(diào) 控 腸 道TH17細(xì)胞的分化與發(fā)育,在促進(jìn)免疫系統(tǒng)的成熟中起著非常重要的作用[20],抗生素聯(lián)合處理后由于SFB等誘導(dǎo)菌群的缺失,TH17比例顯著降低,但是補(bǔ)充煙酸并不能恢復(fù)這一細(xì)胞的比例,因此煙酸可能不是SFB等細(xì)菌誘導(dǎo)TH17分化發(fā)育的因子。

細(xì)胞因子在T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中具有重要影響,細(xì)胞因子受體信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)激活STAT家族并介導(dǎo)疾病的發(fā)生,如促炎細(xì)胞因子IL-6與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)就可以聯(lián)合激活STAT3信號(hào)并增加RORγt的表達(dá)[3,15,21-22],對(duì)于RORγt+Treg以及TH17發(fā)育發(fā)揮著重要的作用。在本研究中煙酸是否也可以通過(guò)STAT3信號(hào)調(diào)控RORγt+Treg的分化,目前還不清楚,共生菌群的缺失導(dǎo)致腸道pTreg細(xì)胞比例以及RORγt蛋白表達(dá)水平均顯著降低[3,22],在這一過(guò)程中STAT3信號(hào)可能具有十分重要的作用[22-23],然而本研究發(fā)現(xiàn),煙酸雖然能夠通過(guò)調(diào)控RORγt+Treg的增殖來(lái)上調(diào)其比例,但是對(duì)RORγt蛋白的平均熒光強(qiáng)度并沒(méi)有顯著恢復(fù)作用,盡管菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可以通過(guò)STAT3以及c-Maf調(diào)控RORγt蛋白的表達(dá)水平[22],但是目前還缺乏煙酸也可以通過(guò)STAT3調(diào)控RORγt蛋白表達(dá)的證據(jù),另外STAT3的磷酸化是否參與煙酸促進(jìn)RORγt+Treg的增殖過(guò)程,也需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述,煙酸對(duì)于小腸RORγt+Treg亞群的穩(wěn)態(tài)維持具有重要促進(jìn)作用,本研究結(jié)果為預(yù)防及治療食物過(guò)敏等疾病提供了理論基礎(chǔ),并有助于揭示腸道菌群維持口服耐受的機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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