耿鈺鑫 陳正濤 張鐘允 董波 古惠文 李欣雨 賈凌云 王新 孫方園 唐華，

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250117；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)院（省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），山東 濟(jì)南 250117；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院），山東 濟(jì)南 250013

腸道Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Foxp3+Treg）分為Helios+Treg、RORγt+Treg和Helios-RORγt-Treg 3個(gè)亞群，對(duì)腸道免疫穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮重要調(diào)控作用。RORγt+Treg是一群腸道菌群依賴的誘導(dǎo)性Treg，2011年Atarashi等［1］描述Helios-Treg亞群發(fā)育依賴于腸道菌群，而且共生梭菌屬發(fā)揮重要作用，2013年Furusawa等［2］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，共生菌群的代謝產(chǎn)物可以誘導(dǎo)其分化發(fā)育，2015年兩個(gè)課題組同時(shí)對(duì)這一細(xì)胞在腸道免疫穩(wěn)態(tài)維持中的作用進(jìn)行了描述［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸以及次級(jí)膽汁酸對(duì)腸道RORγt+Tregs的穩(wěn)態(tài)具有重要調(diào)控作用［5-6］，是否還有其他腸道菌群的代謝產(chǎn)物也對(duì)RORγt+Tregs的維持具有重要調(diào)控作用目前尚不清楚。

煙酸屬于維生素B族，又稱為維生素B3，可由腸道菌群代謝產(chǎn)生［7］，Singh等［8］研究發(fā)現(xiàn)抗生素清除腸道菌群可導(dǎo)致腸道Treg穩(wěn)態(tài)失調(diào)，而補(bǔ)充煙酸能夠恢復(fù)腸道Treg的比例，但煙酸是否對(duì)腸道RORγt+Treg亞群的穩(wěn)態(tài)維持有作用以及機(jī)制目前還不清楚。本研究通過(guò)給小鼠口服抗生素，破壞小腸固有層RORγt+Treg穩(wěn)態(tài)賴以維持的菌群微環(huán)境，探討口服煙酸對(duì)RORγt+Treg比例及增殖變化的影響，為腸道菌群紊亂導(dǎo)致的腸道炎癥型疾病的預(yù)防及治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)買(mǎi)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究中心SPF動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)操作符合山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 抗小鼠CD3e Biotin（eBioscience，13-0031-85），CD4-APC（Invitrogen，17-0041-82），CD8-APC-eFluor 780（Invitrogen，47-0081-82），F(xiàn)oxp3-PE（Invitrogen，12-5773-82），Helios-FITC（Invitrogen，11-9883-82），Ki67-PE-Cyanine7（Invitrogen，25-5698-82），GATA3-PerCP-eFluor 710（Invitrogen，46-9966-42），RORγt-BV421（BD，562894），BV650 Streptavidin（BD，563855），破膜固定液（Invitrogen，00-5223-56），Ⅷ型 膠 原 酶（Sigma，C2139-5G），Percoll細(xì)胞分離液（GE，17089101），新生牛血清（四季青，22011-8612），HEPES（SIGMA，H3537），EDTA（Invitrogen，15575-038），DTT（Solarbio，D8220），1640培 養(yǎng) 基（Cytiva，SH30809.01），萬(wàn) 古 霉 素（Meilunbio，MB1260-4），甲 硝 唑（Sigma-Aldrich，M3761），新霉素（Fisher Scientific，SR0163H），氨芐青 霉 素（Sigma-Aldrich，A5354），煙 酸（Sigma-Aldrich，72309），流式細(xì)胞儀（BD，LSRFortessa），水平離心機(jī)（Thermo Fisher，XIR），搖床（SHAKER INCUBATOR，TS-100B）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥C57BL/6小鼠共隨機(jī)分為四組：對(duì)照組（Ctrl，n=5）正常飲水；抗生素處理組（VMNA，n=5）飲水中添加0.5 mg/mL萬(wàn)古霉素，1 mg/mL甲硝唑，1 mg/mL新霉素，1 mg/mL氨芐青霉素，連續(xù)飲水用藥7 d；煙酸處理對(duì)照組（Niacin，n=5）飲水中添加終濃度為25 mmol/L的煙酸，連續(xù)飲水用藥7 d；煙酸實(shí)驗(yàn)組（VMNA+Niacin，n=5）需同時(shí)在飲水中添加上述抗生素混合以及終濃度為25 mmol/L的煙酸，連續(xù)飲水用藥7 d。

1.2.2 小鼠小腸單細(xì)胞制備 采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出小腸，去除腸內(nèi)容物、腸系膜以及派氏結(jié)，沿長(zhǎng)軸剖開(kāi)，放入PBS中涮洗干凈，剪成數(shù)段放入緩沖溶液中；使用搖床220 r/min震蕩20 min去除腸上皮，重復(fù)2次；將腸段轉(zhuǎn)移到1.5 mg/mLⅧ型膠原酶中，37oC消化16 min，過(guò)濾離心；使用36%Percoll液1 400 r/min離心20 min，獲得小腸固有層淋巴細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)染色方法 將獲得的細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用CD3e Biotin（1∶50）、CD4-APC（1∶200）、CD8-APC-eFluor 780（1∶100）、BV650 Streptavidin（1∶800）進(jìn)行表面標(biāo)記染色，標(biāo)記死細(xì)胞后使用染色固定液固定30 min后，標(biāo)記Foxp3-PE（1∶50）、Helios-FITC（1∶100）、Ki67-PE-Cyanine7（1：1600）、GATA3-PerCP-eFluor 710（1∶100）和RORγt-BV421（1∶100）60 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 抗生素處理導(dǎo)致小腸腸道固有層RORγt+Treg比例降低

使用廣譜抗生素混合以及抗生素單獨(dú)飲水處理C57BL/6小鼠后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)小腸固有層Treg細(xì)胞以及RORγt+Treg細(xì)胞亞群比例變化，結(jié)果顯示，無(wú)論單獨(dú)還是混合使用抗生素，小腸腸道固有層Treg細(xì)胞比例及相對(duì)數(shù)量均出現(xiàn)顯著的升高或升高趨勢(shì)（圖1A）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，抗生素混合處理組中菌群依賴的RORγt+Treg細(xì)胞亞群比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而抗生素的單獨(dú)使用對(duì)于這一亞群的影響較小或者沒(méi)有影響（圖1B）。

圖1 C57BL/6小鼠飲水抗生素7 d后小腸固有層RORγt+Treg細(xì)胞的比例

2.2 煙酸恢復(fù)抗生素處理后小腸固有層RORγt+Treg的比例

為了研究菌群代謝產(chǎn)物煙酸在菌群缺失的情況下對(duì)小腸固有層RORγt+Treg比例變化的影響，本研究在上述聯(lián)合抗生素組的飲水中添加煙酸，7 d后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抗生素處理下調(diào)了小腸固有層RORγt+Treg以及TH17的比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而煙酸能夠拯救因腸道菌群缺失導(dǎo)致的小腸固有層RORγt+Treg比例的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B，P＜0.05），但對(duì)TH17則沒(méi)有顯著作用（圖2C，P＞0.05）。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小腸固有層RORγt+Treg以及TH17的RORγt蛋白的平均熒光強(qiáng)度（median fluorescence intensity，MFI），結(jié)果顯示，抗生素處理以及煙酸單獨(dú)處理后兩者M(jìn)FI均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2D，P＜0.01），抗生素處理并補(bǔ)充煙酸后兩者的MFI也沒(méi)有出現(xiàn)顯著的恢復(fù)（圖2D，P＞0.05）。

圖2 飲水中添加煙酸能夠顯著恢復(fù)聯(lián)合抗生素組小腸固有層RORγt+Treg比例

2.3 煙酸恢復(fù)抗生素處理組小腸固有層RORγt+Tregs的增殖

為了驗(yàn)證煙酸是否具有促進(jìn)RORγt+Treg增殖的作用，本研究檢測(cè)了RORγt+Tregs細(xì)胞Ki67增殖蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，抗生素處理組中小腸固有層RORγt+Treg以及TH17細(xì)胞的Ki67蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而添加煙酸后，與對(duì)照組相比表達(dá)Ki67的RORγt+Treg比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A，P＜0.01）。而對(duì)于小腸固有層的TH17，煙酸的補(bǔ)充并不能夠恢復(fù)其增殖能力（圖3B）。

圖3 煙酸促進(jìn)小腸固有層RORγt+Treg的增殖

3 討論

小腸口服耐受的打破是導(dǎo)致機(jī)體食物過(guò)敏的原因之一［9］，人類(lèi)腸道包含有將近1015個(gè)腸道共生菌，腸道菌群的組成影響腸道固有層內(nèi)大多數(shù)免疫細(xì)胞亞群的穩(wěn)態(tài)或功能［10］，這對(duì)機(jī)體食物過(guò)敏反應(yīng)具有保護(hù)作用［11-12］。Treg是一類(lèi)調(diào)控免疫穩(wěn)態(tài)及免疫反應(yīng)的T細(xì)胞亞群［13］，在食物過(guò)敏、自身免疫、炎癥及微生物和腫瘤的免疫反應(yīng)中具有重要作用。RORγt+Treg亞群主要存在于腸道固有層，其發(fā)育依賴于腸道共生菌群［14］，目前對(duì)于腸道共生菌群調(diào)控RORγt+Tregs的發(fā)育機(jī)制還不清楚。Ohnmacht等［3］研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體及NOD樣受體家族均不參與RORγt+Treg亞群的發(fā)育，腸道菌群產(chǎn)生的“危險(xiǎn)信號(hào)”可能并沒(méi)有發(fā)揮作用。Smith等［15］研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物降解纖維素產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以顯著誘導(dǎo)無(wú)菌小鼠腸道Treg的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽飼喂SPF小鼠4周，可以誘導(dǎo)RORγt+Treg亞群的發(fā)育［3］，而Sefik等［4］使用抗生素飲水處理2周后，再加入短鏈脂肪酸處理2～3周，發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有明顯誘導(dǎo)RORγt+Treg亞群的發(fā)育，因此推測(cè)短鏈脂肪酸似乎并不是菌群影響RORγt+Treg發(fā)育的唯一因素。

GPR109a在腸道中作為丁酸及煙酸共同受體［16］，對(duì)抑制結(jié)腸炎和癌變有重要作用［17-18］，還參與誘導(dǎo)結(jié)腸Treg及產(chǎn)生IL-10的T細(xì)胞分化［8］。煙酸屬于維生素B家族，參與人體的脂質(zhì)代謝、氧化和無(wú)氧分解過(guò)程，在抑制炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能［19］。腸道共生菌群可以產(chǎn)生煙酸，Singh等［8］證實(shí)，煙酸可以通過(guò)GPR109a參與結(jié)腸Treg穩(wěn)態(tài)的維持。小腸作為食物耐受誘導(dǎo)主要部位，對(duì)小腸RORγt+Treg分化發(fā)育的研究具有重要意義，為了進(jìn)一步探索煙酸對(duì)RORγt+Treg分化發(fā)育的影響，本研究使用抗生素清除腸道共生菌群，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小腸固有層RORγt+Treg亞群的比例及增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小腸固有層RORγt+Treg亞群比例及增殖出現(xiàn)顯著降低。補(bǔ)充煙酸后，RORγt+Treg亞群比例及增殖均出現(xiàn)顯著的恢復(fù)，因此作為共生菌群的代謝產(chǎn)物，煙酸在維持小腸固有層RORγt+Treg亞群的增殖中具有非常重要的作用。結(jié)腸中RORγt+Treg比例比小腸更高［4］，煙酸能否拯救因菌群紊亂導(dǎo)致的結(jié)腸RORγt+Treg比例的降低，目前還不清楚。Singh等［8］發(fā)現(xiàn)，煙酸能夠拯救因抗生素清除腸道共生菌群導(dǎo)致Treg比例的降低，通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移OTII CD4+T細(xì)胞，檢測(cè)來(lái)自于供者的Treg也有相同的變化，提示結(jié)腸內(nèi)RORγt+Treg的穩(wěn)態(tài)可能也受到煙酸的調(diào)控。TH17是新發(fā)現(xiàn)的一種能夠分泌白介素17的T細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要意義。腸道分節(jié)絲狀桿菌（segmented filamentous bacteria，SFB）調(diào) 控 腸 道TH17細(xì)胞的分化與發(fā)育，在促進(jìn)免疫系統(tǒng)的成熟中起著非常重要的作用［20］，抗生素聯(lián)合處理后由于SFB等誘導(dǎo)菌群的缺失，TH17比例顯著降低，但是補(bǔ)充煙酸并不能恢復(fù)這一細(xì)胞的比例，因此煙酸可能不是SFB等細(xì)菌誘導(dǎo)TH17分化發(fā)育的因子。

細(xì)胞因子在T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中具有重要影響，細(xì)胞因子受體信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)激活STAT家族并介導(dǎo)疾病的發(fā)生，如促炎細(xì)胞因子IL-6與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）就可以聯(lián)合激活STAT3信號(hào)并增加RORγt的表達(dá)［3，15，21-22］，對(duì)于RORγt+Treg以及TH17發(fā)育發(fā)揮著重要的作用。在本研究中煙酸是否也可以通過(guò)STAT3信號(hào)調(diào)控RORγt+Treg的分化，目前還不清楚，共生菌群的缺失導(dǎo)致腸道pTreg細(xì)胞比例以及RORγt蛋白表達(dá)水平均顯著降低［3，22］，在這一過(guò)程中STAT3信號(hào)可能具有十分重要的作用［22-23］，然而本研究發(fā)現(xiàn)，煙酸雖然能夠通過(guò)調(diào)控RORγt+Treg的增殖來(lái)上調(diào)其比例，但是對(duì)RORγt蛋白的平均熒光強(qiáng)度并沒(méi)有顯著恢復(fù)作用，盡管菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可以通過(guò)STAT3以及c-Maf調(diào)控RORγt蛋白的表達(dá)水平［22］，但是目前還缺乏煙酸也可以通過(guò)STAT3調(diào)控RORγt蛋白表達(dá)的證據(jù)，另外STAT3的磷酸化是否參與煙酸促進(jìn)RORγt+Treg的增殖過(guò)程，也需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，煙酸對(duì)于小腸RORγt+Treg亞群的穩(wěn)態(tài)維持具有重要促進(jìn)作用，本研究結(jié)果為預(yù)防及治療食物過(guò)敏等疾病提供了理論基礎(chǔ)，并有助于揭示腸道菌群維持口服耐受的機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突