卜文超 曾憲智 關(guān)云茜 謝思源 陳世新 湯挺兵 曹明國

麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 麗水 323000

在世界范圍內(nèi)，肝癌是癌癥相關(guān)死亡疾病的 第4大常見原因，發(fā)病在癌癥中居于第6位，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝細(xì)胞癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）最主要類型，約占PHC患者的80%［2］。HCC有多種治療方法，包括手術(shù)切除、化療、放療、肝臟移植等，但高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率導(dǎo)致HCC的預(yù)后仍然很差［3］。由于起病隱匿，大部分HCC患者直到中晚期才確診。盡管HCC發(fā)生、發(fā)展中眾多基因和信號通路已被廣泛研究，但HCC潛在的分子機(jī)制尚未完全闡明。因此尋找HCC患者前瞻性的藥物治療靶點(diǎn)并預(yù)測HCC患者的預(yù)后具有重要意義。

細(xì)胞因子信號抑制物（suppressor of cytokine signaling，SOCS）蛋白家族成員在細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用［4］。SOCS家族成員的異常表達(dá)可促進(jìn)疾病的發(fā)生和進(jìn)展［5］。SOCS家族包括8個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)基因，SOCS1～7和CISH［6］。SOCS家族與各種類型腫瘤之間關(guān)系密切［7］。越來越多的研究表明，SOCS蛋白參與HCC的進(jìn)展［8］，這可能有助于尋找HCC的治療靶點(diǎn)。

本研究應(yīng)用高通量數(shù)據(jù)庫平臺系統(tǒng)分析了SOCS在HCC中表達(dá)、臨床病理特征、預(yù)后、生物學(xué)功能和潛在功能，為研究并驗(yàn)證SOCS家族成員在HCC中作用機(jī)制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 SOCS家族在HCC中的表達(dá)分析

Onconine（https：//www.oncomine.org/）包含一個(gè)常見癌癥類型的微陣列數(shù)據(jù)庫和一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)挖掘平臺，該數(shù)據(jù)庫旨在促進(jìn)全腫瘤基因組表達(dá)的分析［9］。在最新的Oncomine版本中包含715個(gè)數(shù)據(jù)集和86 733個(gè)樣本。本研究采用Student'st檢驗(yàn)分析癌癥標(biāo)本與正常對照之間SOCS基因家族的轉(zhuǎn)錄水平。檢索閾值設(shè)定為：P＜0.05，F(xiàn)OLD CHANGE=ALL，GENE RANK Top 10%。

1.2 SOCS家族基因表達(dá)

UALCAN（http：//ath.uab.ualcan.pedu）是基于癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫平臺中31種常見腫瘤的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的交互式網(wǎng)絡(luò)資源。UALCAN數(shù)據(jù)可以查詢31種常見腫瘤類型和正常樣本中基因的相對表達(dá)量，以及其他臨床病理特征，如癌癥分期、分級、種族、體質(zhì)量、性別、年齡等［10］。在本研究中，UNLCAN被用來比較HCC和正常肝組織中SOCSs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。此外，還探討了癌癥分期和分級。Student'st檢驗(yàn)用于分析癌癥標(biāo)本和正常對照之間SOCS基因家族的轉(zhuǎn)錄水平。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.3 SOCS家族基因表達(dá)對HCC預(yù)后價(jià)值分析

Kaplan-Meier Plotter（http：//www.kmplot.com）是一種在線分析工具，可提供基因表達(dá)譜以及多種癌癥患者的生存信息［11-12］。在本研究中根據(jù)SOCS家族在HCC表達(dá)的中位數(shù)，將HCC患者分為低、高表達(dá)組，并分別繪制SOCS家族K-M生存曲線，分析SOCS家族在HCC中的預(yù)后的價(jià)值，主要評估HCC患者的總生存期（overall survival，OS）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.4 SOCS家族蛋白表達(dá)分析

Human Protein Atlas（http：//www.proteinatlas.org/）是一個(gè)公共數(shù)據(jù)庫，允許免費(fèi)訪問以探索人類蛋白質(zhì)組。Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫中包含44種正常人體組織類型的組織微陣列的免疫組織化學(xué)圖片和來自近8 000名患者的17種主要人類癌癥類型的表達(dá)數(shù)據(jù)［13］。本研究僅利用Human Protein Atlas判斷SOCSs在正常和病理性HCC樣品中的免疫組化染色結(jié)果。SOCSs蛋白表達(dá)基于染色強(qiáng)度和表達(dá)量，并展示典型表達(dá)圖片［14］。

1.5 SOCS基因突變情況及在HCC患者中與SOCS家族共表達(dá)基因

cBioPortal（http：//www.cbioportal.org）是一個(gè)開放網(wǎng)絡(luò)資源，用于可視化和分析多維癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)集［15］。在本研究中cBioPortal用于訪問HCC（TCGA，臨時(shí)）數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含371個(gè)患者的臨床病例數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)集被用來探索SOCS家族基因改變頻率、SOCS家族相關(guān)性分析、50個(gè)SOCS家族最常改變基因。String在線網(wǎng)站（https：//stringdb.org）用于構(gòu)建蛋白與蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)［16］。Cytoscape用來構(gòu)建蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中核心蛋白［17］。本研究利用經(jīng)過String網(wǎng)站構(gòu)建SOCS家族及相關(guān)蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果放入Cytoscape軟件中構(gòu)建SOCS家族相互作用蛋白在HCC相關(guān)蛋白的核心蛋白。

1.6 SOCS家族成員及其共表達(dá)基因GO、KEGG信號通路富集分析

DAVID在線網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/）是一個(gè)在線生物信息學(xué)工具，可鑒定大量基因或蛋白質(zhì)的功能［18］。在本研究中利用DAVID進(jìn)行SOCS家族基因相互作用蛋白的基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO富集分析包括分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、參與的生物過程（biological process，BP）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

HCC與正常肝組織中SOCS家族基因表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)，Oncomine、UALCAN、cBioPortal、Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的處理采用系統(tǒng)自帶的在線軟件進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中SOCS家族分子在HCC中的表達(dá)

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫對SOCS基因家族在HCC中的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析，SOCS家族大部分成員在HCC中存在差異表達(dá)（P＜0.05），見圖1。SOCS2 mRNA在HCC組織中表達(dá)下降，下調(diào)倍數(shù)為-3.686、-4.266、-5.57，分別發(fā)表于Roessler Liver 2數(shù)據(jù)集［19］、Roessler Liver數(shù)據(jù)集［19］、Wurmbach Liver數(shù)據(jù)集［20］。SOCS3 mRNA在HCC中表達(dá)-3.693倍，見于Chen Liver數(shù)據(jù)集［21］。SOCS5 mRNA在HCC組織中表達(dá)上調(diào)，改變倍數(shù)為1.97、1.437、1.693，分別發(fā)表于Roessler Liver 2數(shù)據(jù)集［19］、Chen Liver數(shù)據(jù)集［21］、Roessler Liver數(shù)據(jù)集［18］。SOCS6 mRNA在HCC中表達(dá)下調(diào)-1.824倍，見于數(shù)據(jù)集Wurmbach Liver［20］。SOCS7 mRNA在HCC中 表 達(dá)上 調(diào)1.958倍，見 于Wurmbach Liver數(shù)據(jù) 集［20］。CISH mRNA在HCC組織中表達(dá)下降，下調(diào)倍數(shù)為-1.729、-2.259、-1.941、-1.752，分別發(fā)表于Mas Liver［22］、Roessler Liver［19］、Chen Liver［21］、Roessler Liver 2［19］。

2.2 UNLCAN數(shù)據(jù)庫中SOCS家族分子驗(yàn)證

UNLCAN進(jìn)一步測量了8個(gè)SOCS家族成員的mRNA表達(dá)水平，與正常肝臟組織樣本相比，SOCS2、SOCS3、SOCS6、CISH表 達(dá) 量 下 降（P＜0.05），SOCS4、SOCS5、SOCS7表 達(dá) 量 上 調(diào)（P＜0.05），SOCS1表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表1所示。UNLCAN數(shù)據(jù)庫中SOCS家族成員在HCC表達(dá)差異與Oncomine數(shù)據(jù)庫中結(jié)果基本一致，僅有SOCS4結(jié)果存在不同。

表1 Ualcan數(shù)據(jù)庫中SOCS家族分子驗(yàn)證

2.3 HCC中SOCS蛋白質(zhì)表達(dá)

通過Human Protein Atlas驗(yàn)證HCC中SOCSs蛋白質(zhì)的表達(dá)模式。選取Human Protein Atlas中SOCSs蛋白的典型表達(dá)圖片，如圖2所示，SOCSs大部分成員在正常肝組織中不表達(dá)或低表達(dá)，而在HCC組織中觀察到中等表達(dá)或不表達(dá)，部分SOCSs蛋白表達(dá)存在和轉(zhuǎn)錄水平不一致。

圖2 Human Protein Atlas驗(yàn)證HCC組織和正常肝組織中不同SOCS的代表性免疫組織化學(xué)圖像

2.4 Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫 中SOCS mRNA表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌的預(yù)后分析

HCC患者中高表達(dá)的SOCS1（P=0.015）、SOCS2（P＜0.001）、SOCS8（P=0.001）mRNA與較長的OS相關(guān)（圖4A、4B、和4H）；HCC組織中高表達(dá)的SOCS4（P＜0.05）、SOCS5（P＜0.001）、SOCS7（P＜0.05）mRNA與較短的OS相關(guān)；SOCS3（P＞0.05）、SOCS6（P＞0.05）mRNA與OS沒有顯著相關(guān)性。見圖3。

圖3 SOCS基因家族的表達(dá)與HCC患者OS的相關(guān)性

2.5 SOCS家族成員在HCC患者中突變及共表達(dá)基因

SOCS家族突變結(jié)果顯示，在360例HCC患者中，共有133例（37%）患者存在SOCS家族基因改變，其中SOCS3基因突變率最高（11%），SOCS7基因突變率次之（9%），SOCS5基因突變率為7%，SOCS2、SOCS4、SOCS6基因突變率為6%，SOCS1基因突變率為3%（圖4A）。采用cBioPortal在線工具計(jì)算SOCS家族之間的相關(guān)性，并進(jìn)行Pearson校正，結(jié)果顯示多個(gè)SOCS家族成員存在相關(guān)性（P＜0.05），見圖4B。本研究構(gòu)建了SOCS各家族成員50個(gè)最常改變的相互作用鄰近基因，用維恩圖構(gòu)建各家族成員共表達(dá)基因，去除共表達(dá)重合部分，共有384個(gè)臨近基因。用String在線網(wǎng)站構(gòu)建SOCS家族基因及384個(gè)臨近基因（圖4C）。采用Cytoscape軟件插件cytohubba構(gòu)建384個(gè)臨近基因中的核心基因，發(fā)現(xiàn)CCNB1、PLK1、CDC20、KIF20A、HJURP、CDCA3、GTSE1、MYBL2、IL6、PTGS2與SOCS家族之間改變密切相關(guān)（圖4D）。

圖4 HCC中SOCS家族成員的遺傳相關(guān)性和突變

2.6 SOCS家族成員和共表達(dá)基因在HCC中的富集分析

DAVID分析顯示，BP主要富集在Stat3蛋白酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、胚胎胎盤發(fā)育、蛋白質(zhì)泛素化、JAK-STAT級聯(lián)、炎癥反應(yīng)（圖5A），CC主要富集在細(xì)胞-基質(zhì)連接、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、免疫突觸、中心粒、膜（圖5B），MF主要富集在細(xì)胞因子受體活性、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性/轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（圖5C），KEGG通路主要富集在Jak-STAT、催乳素、腫瘤壞死因子、HTLV-1感染、FoxO相關(guān)的信號通路（圖5D）。

圖5 HCC患者中SOCS家族成員及其最相關(guān)基因功能預(yù)測和途徑分析

3 討論

SOCS蛋白通常被認(rèn)為是JAK-STAT信號通路的拮抗劑和其他信號通路的調(diào)節(jié)劑。然而，SOCS和HCC相關(guān)研究較少，SOCS蛋白在HCC中的具體功能尚不確定。在本研究中，利用公開數(shù)據(jù)庫綜合分析SOCS家族在HCC中轉(zhuǎn)錄、預(yù)后價(jià)值、生存分析及可能的潛在功能。

HCC組織與癌旁組織相比SOCS1 mRNA在HCC中低表達(dá)，組織微列陣也顯示SOCS1在HCC中低表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)證明，SOCS1在多種HCC細(xì)胞系中低表達(dá)，并且檢測了SOCS1在HCC中不同程度的甲基化［23］。SOCS1和SOCS3在腫瘤中是重要的參與者，缺乏SOCS1和SOCS3的小鼠對二乙基亞硝酸銨誘 導(dǎo) 的HCC易 感［24］。本研究利 用UNLCAN、Human Protein Atlas分析，結(jié)果顯示SOCS1在HCC組織和正常組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但K-M生存分析顯示，患者SOCS1高表達(dá)有更長的OS。

SOCS2 mRNA和蛋白水平在HCC組織低于癌旁組織，低表達(dá)的SOCS2有更短的OS［25］。在本研究中oncomine數(shù)據(jù)庫中多個(gè)數(shù)據(jù)集顯示HCC中SOCS2 mRNA低表達(dá)［19-20］，UNLCAN平臺中也顯示SOCS2在HCC組織中低表達(dá)，患者SOCS2低表達(dá)有更短的OS，與上述研究結(jié)果基本一致。

SOCS3在HCC中表達(dá)低于癌旁組織，HCC中SOCS的低表達(dá)與較短OS顯著相關(guān)，SOCS3表達(dá)水平是OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［26-27］。在本研究中，Oncomine、UNLCAN、Human Protein Atlas都 顯 示SOCS3在HCC中低表達(dá)，與上述研究結(jié)果基本一致，SOCS3表達(dá)水平與OS不相關(guān)，與上述研究結(jié)果不一致，有待進(jìn)一步研究。

目前關(guān)于SOCS4與HCC發(fā)生、發(fā)展關(guān)系及臨床病理特征相關(guān)研究較少。在本研究中，UNLCAN、Human Protein Atlas中顯示SOCS4在HCC組織中高表達(dá)，HCC組織中高表達(dá)SOCS4與較差的預(yù)后顯著相關(guān)。

Zhang等［28］研究顯示，SOCS5在HCC組織中高表達(dá)，SOCS5高表達(dá)組OS和DFS明顯低于低表達(dá)組，高表達(dá)的SOCS5是HCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在本研究中多個(gè)高通量數(shù)據(jù)庫表明，SOCS5在HCC組織表達(dá)高于正常肝臟組織，SOCS5高表達(dá)組與低表達(dá)組相比有更短的OS，與上述研究結(jié)果基本一致。

本研究顯示，與正常組織相比，SOCS6在HCC組織中低表達(dá)，低表達(dá)的HCC患者有更短OS和DFS［25］。

目前少有關(guān)于SOCS7與HCC發(fā)生、發(fā)展關(guān)系及臨床病理特征的相關(guān)研究，本研究中多個(gè)數(shù)據(jù)庫綜合分析顯示，SOCS7 mRNA在HCC組織中高表達(dá)，高表達(dá)的SOCS7傾向于更短的OS，而在HPA數(shù)據(jù)庫中存在部分SOCS7蛋白高表達(dá)樣本。

Oncomine中有多個(gè)數(shù)據(jù)集顯示CISH在HCC中低表達(dá)［19，21-22］，UNLCAN中也顯示CISH在HCC組織中低表達(dá)，低表達(dá)CISH的患者有更短的OS。

本研究應(yīng)用多個(gè)高通量數(shù)據(jù)庫評估SOCS家族在HCC中潛在的作用機(jī)制，從大數(shù)據(jù)角度探究SOCS家族在HCC組織中的表達(dá)、預(yù)后價(jià)值、潛在作用機(jī)制。本研究還存在一些局限性，首先，雖然SOCS1、SOCS2、CISH高表達(dá)的患者有更長的OS，SOCS4、SOCS5、SOCS7高表達(dá)mRNA的患者有更短OS，分析的所有數(shù)據(jù)均來自在線數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步的研究應(yīng)包括更大的樣本量來驗(yàn)證并探索SOCS成員在HCC治療中的作用；其次，本研究沒有評估SOCSs在HCC中的潛在診斷和治療作用，因此需要進(jìn)一步研究，探索SOCSs是否可以用作診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。