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SOCS基因家族在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及生物信息學(xué)分析

2022-11-22 02:31:34卜文超曾憲智關(guān)云茜謝思源陳世新湯挺兵曹明國
關(guān)鍵詞:家族癌癥成員

卜文超 曾憲智 關(guān)云茜 謝思源 陳世新 湯挺兵 曹明國

麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)院,浙江 麗水 323000

在世界范圍內(nèi),肝癌是癌癥相關(guān)死亡疾病的 第4大常見原因,發(fā)病在癌癥中居于第6位,肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝細(xì)胞癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)最主要類型,約占PHC患者的80%[2]。HCC有多種治療方法,包括手術(shù)切除、化療、放療、肝臟移植等,但高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率導(dǎo)致HCC的預(yù)后仍然很差[3]。由于起病隱匿,大部分HCC患者直到中晚期才確診。盡管HCC發(fā)生、發(fā)展中眾多基因和信號通路已被廣泛研究,但HCC潛在的分子機(jī)制尚未完全闡明。因此尋找HCC患者前瞻性的藥物治療靶點(diǎn)并預(yù)測HCC患者的預(yù)后具有重要意義。

細(xì)胞因子信號抑制物(suppressor of cytokine signaling,SOCS)蛋白家族成員在細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[4]。SOCS家族成員的異常表達(dá)可促進(jìn)疾病的發(fā)生和進(jìn)展[5]。SOCS家族包括8個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)基因,SOCS1~7和CISH[6]。SOCS家族與各種類型腫瘤之間關(guān)系密切[7]。越來越多的研究表明,SOCS蛋白參與HCC的進(jìn)展[8],這可能有助于尋找HCC的治療靶點(diǎn)。

本研究應(yīng)用高通量數(shù)據(jù)庫平臺系統(tǒng)分析了SOCS在HCC中表達(dá)、臨床病理特征、預(yù)后、生物學(xué)功能和潛在功能,為研究并驗(yàn)證SOCS家族成員在HCC中作用機(jī)制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 SOCS家族在HCC中的表達(dá)分析

Onconine(https://www.oncomine.org/)包含一個(gè)常見癌癥類型的微陣列數(shù)據(jù)庫和一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)挖掘平臺,該數(shù)據(jù)庫旨在促進(jìn)全腫瘤基因組表達(dá)的分析[9]。在最新的Oncomine版本中包含715個(gè)數(shù)據(jù)集和86 733個(gè)樣本。本研究采用Student'st檢驗(yàn)分析癌癥標(biāo)本與正常對照之間SOCS基因家族的轉(zhuǎn)錄水平。檢索閾值設(shè)定為:P<0.05,F(xiàn)OLD CHANGE=ALL,GENE RANK Top 10%。

1.2 SOCS家族基因表達(dá)

UALCAN(http://ath.uab.ualcan.pedu)是基于癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫平臺中31種常見腫瘤的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的交互式網(wǎng)絡(luò)資源。UALCAN數(shù)據(jù)可以查詢31種常見腫瘤類型和正常樣本中基因的相對表達(dá)量,以及其他臨床病理特征,如癌癥分期、分級、種族、體質(zhì)量、性別、年齡等[10]。在本研究中,UNLCAN被用來比較HCC和正常肝組織中SOCSs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。此外,還探討了癌癥分期和分級。Student'st檢驗(yàn)用于分析癌癥標(biāo)本和正常對照之間SOCS基因家族的轉(zhuǎn)錄水平。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.3 SOCS家族基因表達(dá)對HCC預(yù)后價(jià)值分析

Kaplan-Meier Plotter(http://www.kmplot.com)是一種在線分析工具,可提供基因表達(dá)譜以及多種癌癥患者的生存信息[11-12]。在本研究中根據(jù)SOCS家族在HCC表達(dá)的中位數(shù),將HCC患者分為低、高表達(dá)組,并分別繪制SOCS家族K-M生存曲線,分析SOCS家族在HCC中的預(yù)后的價(jià)值,主要評估HCC患者的總生存期(overall survival,OS)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.4 SOCS家族蛋白表達(dá)分析

Human Protein Atlas(http://www.proteinatlas.org/)是一個(gè)公共數(shù)據(jù)庫,允許免費(fèi)訪問以探索人類蛋白質(zhì)組。Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫中包含44種正常人體組織類型的組織微陣列的免疫組織化學(xué)圖片和來自近8 000名患者的17種主要人類癌癥類型的表達(dá)數(shù)據(jù)[13]。本研究僅利用Human Protein Atlas判斷SOCSs在正常和病理性HCC樣品中的免疫組化染色結(jié)果。SOCSs蛋白表達(dá)基于染色強(qiáng)度和表達(dá)量,并展示典型表達(dá)圖片[14]。

1.5 SOCS基因突變情況及在HCC患者中與SOCS家族共表達(dá)基因

cBioPortal(http://www.cbioportal.org)是一個(gè)開放網(wǎng)絡(luò)資源,用于可視化和分析多維癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)集[15]。在本研究中cBioPortal用于訪問HCC(TCGA,臨時(shí))數(shù)據(jù)集,該數(shù)據(jù)集包含371個(gè)患者的臨床病例數(shù)據(jù),該數(shù)據(jù)集被用來探索SOCS家族基因改變頻率、SOCS家族相關(guān)性分析、50個(gè)SOCS家族最常改變基因。String在線網(wǎng)站(https://stringdb.org)用于構(gòu)建蛋白與蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)[16]。Cytoscape用來構(gòu)建蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中核心蛋白[17]。本研究利用經(jīng)過String網(wǎng)站構(gòu)建SOCS家族及相關(guān)蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),結(jié)果放入Cytoscape軟件中構(gòu)建SOCS家族相互作用蛋白在HCC相關(guān)蛋白的核心蛋白。

1.6 SOCS家族成員及其共表達(dá)基因GO、KEGG信號通路富集分析

DAVID在線網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)是一個(gè)在線生物信息學(xué)工具,可鑒定大量基因或蛋白質(zhì)的功能[18]。在本研究中利用DAVID進(jìn)行SOCS家族基因相互作用蛋白的基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。GO富集分析包括分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)、參與的生物過程(biological process,BP)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

HCC與正常肝組織中SOCS家族基因表達(dá)差異采用t檢驗(yàn),Oncomine、UALCAN、cBioPortal、Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的處理采用系統(tǒng)自帶的在線軟件進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中SOCS家族分子在HCC中的表達(dá)

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫對SOCS基因家族在HCC中的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析,SOCS家族大部分成員在HCC中存在差異表達(dá)(P<0.05),見圖1。SOCS2 mRNA在HCC組織中表達(dá)下降,下調(diào)倍數(shù)為-3.686、-4.266、-5.57,分別發(fā)表于Roessler Liver 2數(shù)據(jù)集[19]、Roessler Liver數(shù)據(jù)集[19]、Wurmbach Liver數(shù)據(jù)集[20]。SOCS3 mRNA在HCC中表達(dá)-3.693倍,見于Chen Liver數(shù)據(jù)集[21]。SOCS5 mRNA在HCC組織中表達(dá)上調(diào),改變倍數(shù)為1.97、1.437、1.693,分別發(fā)表于Roessler Liver 2數(shù)據(jù)集[19]、Chen Liver數(shù)據(jù)集[21]、Roessler Liver數(shù)據(jù)集[18]。SOCS6 mRNA在HCC中表達(dá)下調(diào)-1.824倍,見于數(shù)據(jù)集Wurmbach Liver[20]。SOCS7 mRNA在HCC中 表 達(dá)上 調(diào)1.958倍,見 于Wurmbach Liver數(shù)據(jù) 集[20]。CISH mRNA在HCC組織中表達(dá)下降,下調(diào)倍數(shù)為-1.729、-2.259、-1.941、-1.752,分別發(fā)表于Mas Liver[22]、Roessler Liver[19]、Chen Liver[21]、Roessler Liver 2[19]。

2.2 UNLCAN數(shù)據(jù)庫中SOCS家族分子驗(yàn)證

UNLCAN進(jìn)一步測量了8個(gè)SOCS家族成員的mRNA表達(dá)水平,與正常肝臟組織樣本相比,SOCS2、SOCS3、SOCS6、CISH表 達(dá) 量 下 降(P<0.05),SOCS4、SOCS5、SOCS7表 達(dá) 量 上 調(diào)(P<0.05),SOCS1表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,如表1所示。UNLCAN數(shù)據(jù)庫中SOCS家族成員在HCC表達(dá)差異與Oncomine數(shù)據(jù)庫中結(jié)果基本一致,僅有SOCS4結(jié)果存在不同。

表1 Ualcan數(shù)據(jù)庫中SOCS家族分子驗(yàn)證

2.3 HCC中SOCS蛋白質(zhì)表達(dá)

通過Human Protein Atlas驗(yàn)證HCC中SOCSs蛋白質(zhì)的表達(dá)模式。選取Human Protein Atlas中SOCSs蛋白的典型表達(dá)圖片,如圖2所示,SOCSs大部分成員在正常肝組織中不表達(dá)或低表達(dá),而在HCC組織中觀察到中等表達(dá)或不表達(dá),部分SOCSs蛋白表達(dá)存在和轉(zhuǎn)錄水平不一致。

圖2 Human Protein Atlas驗(yàn)證HCC組織和正常肝組織中不同SOCS的代表性免疫組織化學(xué)圖像

2.4 Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫 中SOCS mRNA表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌的預(yù)后分析

HCC患者中高表達(dá)的SOCS1(P=0.015)、SOCS2(P<0.001)、SOCS8(P=0.001)mRNA與較長的OS相關(guān)(圖4A、4B、和4H);HCC組織中高表達(dá)的SOCS4(P<0.05)、SOCS5(P<0.001)、SOCS7(P<0.05)mRNA與較短的OS相關(guān);SOCS3(P>0.05)、SOCS6(P>0.05)mRNA與OS沒有顯著相關(guān)性。見圖3。

圖3 SOCS基因家族的表達(dá)與HCC患者OS的相關(guān)性

2.5 SOCS家族成員在HCC患者中突變及共表達(dá)基因

SOCS家族突變結(jié)果顯示,在360例HCC患者中,共有133例(37%)患者存在SOCS家族基因改變,其中SOCS3基因突變率最高(11%),SOCS7基因突變率次之(9%),SOCS5基因突變率為7%,SOCS2、SOCS4、SOCS6基因突變率為6%,SOCS1基因突變率為3%(圖4A)。采用cBioPortal在線工具計(jì)算SOCS家族之間的相關(guān)性,并進(jìn)行Pearson校正,結(jié)果顯示多個(gè)SOCS家族成員存在相關(guān)性(P<0.05),見圖4B。本研究構(gòu)建了SOCS各家族成員50個(gè)最常改變的相互作用鄰近基因,用維恩圖構(gòu)建各家族成員共表達(dá)基因,去除共表達(dá)重合部分,共有384個(gè)臨近基因。用String在線網(wǎng)站構(gòu)建SOCS家族基因及384個(gè)臨近基因(圖4C)。采用Cytoscape軟件插件cytohubba構(gòu)建384個(gè)臨近基因中的核心基因,發(fā)現(xiàn)CCNB1、PLK1、CDC20、KIF20A、HJURP、CDCA3、GTSE1、MYBL2、IL6、PTGS2與SOCS家族之間改變密切相關(guān)(圖4D)。

圖4 HCC中SOCS家族成員的遺傳相關(guān)性和突變

2.6 SOCS家族成員和共表達(dá)基因在HCC中的富集分析

DAVID分析顯示,BP主要富集在Stat3蛋白酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、胚胎胎盤發(fā)育、蛋白質(zhì)泛素化、JAK-STAT級聯(lián)、炎癥反應(yīng)(圖5A),CC主要富集在細(xì)胞-基質(zhì)連接、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、免疫突觸、中心粒、膜(圖5B),MF主要富集在細(xì)胞因子受體活性、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性/轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(圖5C),KEGG通路主要富集在Jak-STAT、催乳素、腫瘤壞死因子、HTLV-1感染、FoxO相關(guān)的信號通路(圖5D)。

圖5 HCC患者中SOCS家族成員及其最相關(guān)基因功能預(yù)測和途徑分析

3 討論

SOCS蛋白通常被認(rèn)為是JAK-STAT信號通路的拮抗劑和其他信號通路的調(diào)節(jié)劑。然而,SOCS和HCC相關(guān)研究較少,SOCS蛋白在HCC中的具體功能尚不確定。在本研究中,利用公開數(shù)據(jù)庫綜合分析SOCS家族在HCC中轉(zhuǎn)錄、預(yù)后價(jià)值、生存分析及可能的潛在功能。

HCC組織與癌旁組織相比SOCS1 mRNA在HCC中低表達(dá),組織微列陣也顯示SOCS1在HCC中低表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)證明,SOCS1在多種HCC細(xì)胞系中低表達(dá),并且檢測了SOCS1在HCC中不同程度的甲基化[23]。SOCS1和SOCS3在腫瘤中是重要的參與者,缺乏SOCS1和SOCS3的小鼠對二乙基亞硝酸銨誘 導(dǎo) 的HCC易 感[24]。本研究利 用UNLCAN、Human Protein Atlas分析,結(jié)果顯示SOCS1在HCC組織和正常組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但K-M生存分析顯示,患者SOCS1高表達(dá)有更長的OS。

SOCS2 mRNA和蛋白水平在HCC組織低于癌旁組織,低表達(dá)的SOCS2有更短的OS[25]。在本研究中oncomine數(shù)據(jù)庫中多個(gè)數(shù)據(jù)集顯示HCC中SOCS2 mRNA低表達(dá)[19-20],UNLCAN平臺中也顯示SOCS2在HCC組織中低表達(dá),患者SOCS2低表達(dá)有更短的OS,與上述研究結(jié)果基本一致。

SOCS3在HCC中表達(dá)低于癌旁組織,HCC中SOCS的低表達(dá)與較短OS顯著相關(guān),SOCS3表達(dá)水平是OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[26-27]。在本研究中,Oncomine、UNLCAN、Human Protein Atlas都 顯 示SOCS3在HCC中低表達(dá),與上述研究結(jié)果基本一致,SOCS3表達(dá)水平與OS不相關(guān),與上述研究結(jié)果不一致,有待進(jìn)一步研究。

目前關(guān)于SOCS4與HCC發(fā)生、發(fā)展關(guān)系及臨床病理特征相關(guān)研究較少。在本研究中,UNLCAN、Human Protein Atlas中顯示SOCS4在HCC組織中高表達(dá),HCC組織中高表達(dá)SOCS4與較差的預(yù)后顯著相關(guān)。

Zhang等[28]研究顯示,SOCS5在HCC組織中高表達(dá),SOCS5高表達(dá)組OS和DFS明顯低于低表達(dá)組,高表達(dá)的SOCS5是HCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在本研究中多個(gè)高通量數(shù)據(jù)庫表明,SOCS5在HCC組織表達(dá)高于正常肝臟組織,SOCS5高表達(dá)組與低表達(dá)組相比有更短的OS,與上述研究結(jié)果基本一致。

本研究顯示,與正常組織相比,SOCS6在HCC組織中低表達(dá),低表達(dá)的HCC患者有更短OS和DFS[25]。

目前少有關(guān)于SOCS7與HCC發(fā)生、發(fā)展關(guān)系及臨床病理特征的相關(guān)研究,本研究中多個(gè)數(shù)據(jù)庫綜合分析顯示,SOCS7 mRNA在HCC組織中高表達(dá),高表達(dá)的SOCS7傾向于更短的OS,而在HPA數(shù)據(jù)庫中存在部分SOCS7蛋白高表達(dá)樣本。

Oncomine中有多個(gè)數(shù)據(jù)集顯示CISH在HCC中低表達(dá)[19,21-22],UNLCAN中也顯示CISH在HCC組織中低表達(dá),低表達(dá)CISH的患者有更短的OS。

本研究應(yīng)用多個(gè)高通量數(shù)據(jù)庫評估SOCS家族在HCC中潛在的作用機(jī)制,從大數(shù)據(jù)角度探究SOCS家族在HCC組織中的表達(dá)、預(yù)后價(jià)值、潛在作用機(jī)制。本研究還存在一些局限性,首先,雖然SOCS1、SOCS2、CISH高表達(dá)的患者有更長的OS,SOCS4、SOCS5、SOCS7高表達(dá)mRNA的患者有更短OS,分析的所有數(shù)據(jù)均來自在線數(shù)據(jù)庫,進(jìn)一步的研究應(yīng)包括更大的樣本量來驗(yàn)證并探索SOCS成員在HCC治療中的作用;其次,本研究沒有評估SOCSs在HCC中的潛在診斷和治療作用,因此需要進(jìn)一步研究,探索SOCSs是否可以用作診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

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