夏楚睿，壽辰菲，金明，葉澤嵐，宋益康，章余旋，傅紅興

（1.浙江樹人學(xué)院樹蘭國際醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 312028；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州310000）

胰島移植是目前臨床上唯一微創(chuàng)并能實(shí)現(xiàn)血糖精確調(diào)控的外科治療手段，隨著近幾年胰島移植臨床治療方案和標(biāo)準(zhǔn)的純化人胰島生產(chǎn)方法的公布［1-6］，國內(nèi)外已有越來越多的醫(yī)療機(jī)構(gòu)正在開展或準(zhǔn)備開展該項(xiàng)手術(shù)。但胰島移植依然存在體內(nèi)移植的胰島追蹤、存活評價(jià)困難等問題［7-8］，成為該技術(shù)研究和推廣應(yīng)用的一個(gè)障礙。

活體生物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)在近20 年里發(fā)展迅速［9-10］。其中熒光素酶（Luciference，LUC）基因可整合到細(xì)胞染色體DNA 上，表達(dá)的偏紅外熒光在體內(nèi)穿透性強(qiáng)，無需激發(fā)光，使用底物熒光素（D-Luciferin）即可在小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)中觀察標(biāo)記的細(xì)胞或蛋白在體內(nèi)的存活和運(yùn)行軌跡，在腫瘤、干細(xì)胞和蛋白因子的表達(dá)、測定研究中應(yīng)用廣泛［11-12］。本研究采用慢病毒載體將熒光素酶基因?qū)敕蛛x后的胰島中，并移植至裸鼠腎被膜下，在成像系統(tǒng)中定期觀察LUC 基因轉(zhuǎn)染后胰島在體外和體內(nèi)的熒光表達(dá)，為胰島的LUC 標(biāo)記和體內(nèi)移植后的跟蹤研究提供方法參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ICR 小鼠、Balb/c-nu 裸鼠（雄性，SPF 級，6 ～ 8 周，杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和器材：慢病毒Luciference 基因質(zhì)粒（HBLV-LUC-PURO）、慢病毒ZsGreen 基因質(zhì)粒（HBLV-ZsGreen-PURO）、溴化己二甲銨（Polybrene）〔漢恒生物科技（上海）有限公司〕；D-熒光素鉀鹽（D-Luciferin，貨號(hào)：MB1834，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（Gibco，Thermo Fisher Scientific，美國）；Ficoll-1077、Ficoll-1119、FDAPI 雙染細(xì)胞活力檢測試劑盒、CMRL-1066（溫州市怡康細(xì)胞移植技術(shù)開發(fā)有限公司）；全自動(dòng)活細(xì)胞成像系統(tǒng)（EVOS M7000，Invitrogen，美國）；IVIS Lumina LT 小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)（Series Ⅲ，PerkinElmer，美國）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胰島的分離和培養(yǎng)：參考前期工作基礎(chǔ)［13-14］，簡述如下：取ICR 小鼠，頸椎脫臼法處死，U 型切口剪開腹部肌肉層；夾閉膽總管入十二指腸口；逆行膽總管灌注V 型膠原酶溶液2.5 ml，膨脹的胰腺放入含2 ml 同濃度V 型膠原酶的15 ml 離心管中，在（37.0±0.5）℃恒溫水浴中振搖消化呈乳糜狀，用Ficoll-1077、Ficoll-1119 進(jìn)行密度梯度純化，得到高純度的小鼠胰島，用CMRL 1066 胰島培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和青鏈霉素）在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 ～ 8 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 慢病毒LUC 基因轉(zhuǎn)染胰島

1.2.2.1 慢病毒-LUC 胰島培養(yǎng)液的配制：基于前期慢病毒ZsGreen 基因轉(zhuǎn)染胰島預(yù)實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)選擇慢病毒的感染復(fù)數(shù)為10 MOI。慢病毒-LUC 胰島培養(yǎng)液的配制方法：取病毒-LUC 原液（病毒滴度：108TU/ml）10 μl，加入CMRL 1066 胰島培養(yǎng)液990 μl，混勻后得到含10 MOI 病毒-LUC 基因質(zhì)粒的胰島培養(yǎng)液1 ml。

1.2.2.2 胰島經(jīng)慢病毒LUC 基因轉(zhuǎn)染：將需轉(zhuǎn)染的胰島細(xì)胞團(tuán)（約200 IEQ）放置于24 孔板中，盡量去除胰島培養(yǎng)液；快速加入1 ml 10 MOI 的慢病毒-LUC 胰島培養(yǎng)液，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分散后培養(yǎng)24 h。將轉(zhuǎn)染慢病毒后的胰島取出后至新的12 孔板中，用胰島培養(yǎng)液洗滌1 遍后加入2 ml新鮮的CMRL 1066 胰島培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 LUC 基因轉(zhuǎn)染后胰島的體外發(fā)光檢測：取不同當(dāng)量的上述轉(zhuǎn)染LUC 基因的小鼠胰島（約100、200、250 IEQ，各3 份），加入50 μl 底物D-Luciferin溶液（取D-Luciferin 原料，用無菌水配制成15 mg/ml 的熒光素溶液），在小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)中測定胰島在體外的LUC 熒光表達(dá)，作為培養(yǎng)后第0 日熒光表達(dá)；取測定熒光后的小鼠胰島（約100 IEQ），用胰島培養(yǎng)液洗滌1 遍后，放置在新的12 孔板中，加入2 ml 胰島培養(yǎng)液繼續(xù)37℃、5%CO2培養(yǎng)；在培養(yǎng)1、7、14 d 進(jìn)行相同的活體光學(xué)成像系統(tǒng)觀察，得到LUC 標(biāo)記胰島在體外培養(yǎng)不同時(shí)間的熒光表達(dá)變化。

1.2.4 腎被膜下胰島移植：將培養(yǎng)第0 天后約200 IEQ 轉(zhuǎn)染慢病毒LUC 基因的胰島移植至正常裸鼠的腎被膜下。方法簡述如下［14］：異氟烷吸入麻醉正常Balb/c-nu 裸鼠，用眼科剪在右腎背側(cè)皮膚和肌肉上開1 cm 小口暴露右腎。用針在腎被膜上刺一小口，并使用自制的移植工具將胰島移植到腎背膜下?？p合切口并用聚維酮碘消毒，皮下注射1 ml 生理鹽水補(bǔ)液。術(shù)后小鼠每日皮下注射100 μl 頭孢唑啉鈉預(yù)防感染，持續(xù)1 周。

1.2.5 LUC 基因轉(zhuǎn)染后胰島的體內(nèi)發(fā)光檢測：取胰島移植后的裸鼠，異氟烷吸入麻醉后，腹腔注射100 μl 底物D-Luciferin 溶液，5 min 后在小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)中測定LUC 標(biāo)記胰島在體內(nèi)的熒光表達(dá)。對同一小鼠在胰島移植術(shù)后的同一位置，術(shù)后第0、1、3、5、7、14、21、30 日監(jiān)測1 次熒光表達(dá)，以未轉(zhuǎn)染慢病毒LUC 基因的胰島移植為對照組進(jìn)行相同的觀察。

1.2.6 胰島活性：使用FDA-PI 雙染細(xì)胞活力檢測試劑盒評估胰島的活性。方法：取25 個(gè)經(jīng)慢病毒基因轉(zhuǎn)染后的胰島細(xì)胞團(tuán)（約0.5 ml），加入10 μl PI 和10 μl FDA 溶 液 后，室 溫 下 避 光 孵育30 s，使用EVOS M 7000 細(xì)胞成像系統(tǒng)，在藍(lán)色激發(fā)光下發(fā)綠色熒光的為活細(xì)胞；在綠色激發(fā)光下發(fā)紅色熒光的為死細(xì)胞。用發(fā)綠色熒光的組織面積占胰島總面積的百分比進(jìn)行胰島活性的評估。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并采用成對樣品t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠胰島的分離、培養(yǎng)及LUC 標(biāo)記后胰島的活性結(jié)果：1 只ICR 小鼠可分離得到（166±47）個(gè)胰島，當(dāng)量為（183.6±36.5） IEQ；胰島形態(tài)圓整，經(jīng)雙硫腙（dithizone，DTZ）染色后，純度＞90%。經(jīng)培養(yǎng)6 ～ 8 h 后的胰島經(jīng)熒光素雙醋酸酯-碘化丙啶（fluorescein diacetate-propidium iodide，F(xiàn)DA-PI）染色后，活性達(dá)（93.6±3.1）%。胰島經(jīng)慢病毒LUC 轉(zhuǎn)染24 h和再培養(yǎng)24 h 后，可見LUC 標(biāo)記后的胰島外形圓整（圖1A），經(jīng)FDA-PI 染色后大部分體積呈綠色，胰島活性為（86.7±6.7）%（圖1B）。

圖1 LUC 標(biāo)記后小鼠胰島的形態(tài)和活性

2.2 LUC 標(biāo)記胰島在體外隨時(shí)間的熒光表達(dá)結(jié)果：不同當(dāng)量上述LUC 標(biāo)記的胰島培養(yǎng)第0 天，在小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)中測定的胰島LUC 熒光的表達(dá)結(jié)果如下圖2A（白色箭頭）、2B 所示；取約100 IEQ LUC 標(biāo)記胰島，在培養(yǎng)第0、1、7、14 日的LUC 熒光表達(dá)結(jié)果如下圖2C 所示。

體外培養(yǎng)的LUC 標(biāo)記胰島在小動(dòng)物活體成像儀中可見熒光表達(dá)（圖2A 中白色箭頭所示），且熒光表達(dá)量與胰島當(dāng)量有關(guān)（圖2B）；LUC 標(biāo)記胰島在體外培養(yǎng)2 周內(nèi)的熒光表達(dá)強(qiáng)度呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)趨勢（圖2C）。

圖2 LUC 標(biāo)記胰島在不同胰島當(dāng)量、培養(yǎng)時(shí)間的熒光表達(dá)結(jié)果（n=3）

2.3 LUC 標(biāo)記胰島移植至裸鼠體內(nèi)后隨時(shí)間的熒光表達(dá)結(jié)果：培養(yǎng)第0 天的LUC 標(biāo)記胰島移植至裸鼠腎被膜下后，在小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)中的成像結(jié)果如下圖3A 所示。移植術(shù)后第0、1、3、5、7、14、21、30 日的體內(nèi)LUC 熒光表達(dá)結(jié)果如下圖3B所示。

在小動(dòng)物活體成像儀中，裸鼠腎被膜下移植的LUC 標(biāo)記胰島可見熒光表達(dá)（圖3A 中白色箭頭所示），并可實(shí)現(xiàn)在活體狀態(tài)下長期觀察（＞30 d）；但熒光表達(dá)的強(qiáng)度隨時(shí)間變化有較大差異（圖3B）。對照組移植未轉(zhuǎn)染LUC 基因的胰島的裸鼠，在活體成像儀中無熒光表達(dá)。

圖3 LUC 標(biāo)記胰島移植至裸鼠體內(nèi)后隨時(shí)間的熒光表達(dá)結(jié)果

3 討 論

關(guān)于LUC 標(biāo)記胰島的研究有經(jīng)腺病毒載體轉(zhuǎn)染分離后的胰島［15］和轉(zhuǎn)染胰島素Ⅰ啟動(dòng)子控制的LUC 基因至小鼠［16］等，但存在LUC 表達(dá)時(shí)間短，模型構(gòu)建難度大等問題。本研究中LUC 基因經(jīng)慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)，可實(shí)現(xiàn)LUC 的長期表達(dá)，轉(zhuǎn)染方法簡便。

LUC 標(biāo)記的胰島在體外培養(yǎng)2 周內(nèi)，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長熒光強(qiáng)度表達(dá)增強(qiáng)，說明胰島細(xì)胞內(nèi)LUC的表達(dá)隨時(shí)間逐漸增加。LUC 標(biāo)記胰島在體內(nèi)移植后的熒光表達(dá)的差異較大，且不像體外胰島LUC 的表達(dá)逐漸增加，這可能與體內(nèi)腎被膜下環(huán)境復(fù)雜，胰島細(xì)胞團(tuán)內(nèi)表達(dá)LUC 的細(xì)胞在腎被膜下移植后有部分死亡，存活的表達(dá)LUC 細(xì)胞數(shù)量差異較大有關(guān)；且在活體成像儀下測定時(shí)裸鼠的體位、測定時(shí)間對熒光強(qiáng)度的結(jié)果也具有一定的影響。為提高慢病毒對細(xì)胞的感染效率，慢病毒基因轉(zhuǎn)染中常加入Polybrene；但在本實(shí)驗(yàn)中慢病毒-LUC 胰島培養(yǎng)液中添加Polybrene 后，標(biāo)記的胰島細(xì)胞病死率大大增加，因此后續(xù)LUC 轉(zhuǎn)染胰島實(shí)驗(yàn)中未加該成分。本研究LUC 標(biāo)記的胰島移植至裸鼠體內(nèi)后，可實(shí)現(xiàn)在活體狀態(tài)下長期觀察體內(nèi)胰島的存活情況，為后續(xù)研究胰島在移植部位的存活和功效研究提供一定的參考。