韓俊峰，沈中陽(yáng)，高偉，田彥璋，付西峰

（1.山西白求恩醫(yī)院普通外科，山西太原 030000；2.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 300100）

原發(fā)性肝癌在我國(guó)惡性腫瘤排名中位于第4位［1］，同時(shí)在腫瘤致死病因排第2 位，其中肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占到75% ～ 85%。近年來(lái)，肝細(xì)胞肝癌分子靶向藥物、免疫檢查點(diǎn)抑制劑等系統(tǒng)治療的突破性進(jìn)展使肝癌患者的預(yù)后較前明顯改善，但對(duì)于中國(guó)肝癌分期方案（China liver cancer staging，CNLC）中Ⅰa 期、Ⅰb 期、Ⅱa 期肝癌的首選治療方式仍是外科治療，主要包括肝切除術(shù)和肝移植術(shù)。腫瘤復(fù)發(fā)是肝癌外科治療后面臨的主要問(wèn)題，原發(fā)性肝癌診療指南（2022 年版）指出，肝癌切除術(shù)后5 年腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高達(dá)40% ～70%［2］。

當(dāng)前肝癌在內(nèi)的終末期肝病患者的主要治療手段是原位肝移植，在一些肝移植中心活體肝移植（living donor liver transplantation， LDLT）已普遍開(kāi)展。然而有研究報(bào)道指出，在HCC 患者治療過(guò)程中，LDLT 較尸體供肝肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)率較高，可能的原因是LDLT 手術(shù)完成后患者肝再生過(guò)程加速了殘存肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［3-4］。

肝切除或LDLT 術(shù)后患者的肝細(xì)胞會(huì)立即進(jìn)入增殖的狀態(tài)，目前還不能確定肝再生過(guò)程是否能夠加速腫瘤組織的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其具體機(jī)制也沒(méi)有明確的解釋，本研究擬初步探究肝癌肝臟切除或LDLT 術(shù)后患者肝再生過(guò)程是否對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)產(chǎn)生影響，并揭示其可能存在的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑：SPF 級(jí)健康的成年雌性Wistar 大鼠體重200 ～ 230 g，8 ～ 10 周齡，購(gòu)買自解放軍軍事醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物檢疫合格，許可證號(hào)為SCXK-（軍）2014-0001，保持自由進(jìn)食飲水。Walker 256 腫瘤細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)提供。鼠增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA） IgG、c-met 抗體、VEGFR2 抗體、CAPNS-1 抗體均購(gòu)買于英國(guó)Abcam 公司。本研究獲得天津市第一中心醫(yī)院學(xué)術(shù)與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：2014 -SYDWLL-000062）。

1.2 腫瘤細(xì)胞懸液的制備：于幼鼠腹腔接種含Walker 256 腫瘤細(xì)胞株的原始細(xì)胞懸液，并連續(xù)傳代2 ～ 3 代，最終獲得處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞株。臺(tái)盼藍(lán)染色法用于確定活性細(xì)胞的比例是否大于90%，PBS 緩沖液用于調(diào)整懸液濃度至約1.0×106/ml備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及術(shù)后管理：將24 只SPF 級(jí)健康的成年雌性Wistar 大鼠隨機(jī)分為3 組，無(wú)肝切組定義為H0 組：將麻醉后的大鼠充分游離肝臟周圍韌帶，于門靜脈注射0.5 ml Walker 256 腫瘤細(xì)胞的懸液（約5.0×105個(gè)）；30%肝切組定義為H30 組：切除大鼠肝臟左外側(cè)葉后經(jīng)門靜脈注射腫瘤細(xì)胞懸液0.5 ml；70%肝切組（H70）：切除大鼠肝臟左葉和肝中葉后經(jīng)門靜脈注射腫瘤細(xì)胞懸液0.5 ml。手術(shù)完畢后為預(yù)防感染靜脈注射100000U/Kg 青霉素鈉，并在SPF 環(huán)境中保持大鼠自由進(jìn)食和飲水。

1.4 病理學(xué)檢查：使用4%多聚甲醛溶液固定瘤肝組織，石蠟包埋后獲得常規(guī)病理切片，觀測(cè)HE 染色后組織病理學(xué)改變。于顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果，400×下隨機(jī)觀測(cè)5 個(gè)視野，計(jì)算增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）染色陽(yáng)性細(xì)胞占比，即PCNA 指數(shù)。

1.5 Western Blot 用于分析VEGFR-2、c-met、CAPNS-1蛋白表達(dá)水平：取凍存的腫瘤組織，進(jìn)行液氮研磨勻漿，1% Triton 重懸后進(jìn)行BCA 蛋白測(cè)定。將裂解的蛋白按照80 V 30 min 轉(zhuǎn)100 V 1.5 h 進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳；電泳后進(jìn)行DVPF 膜恒流300 mA，轉(zhuǎn)膜2 h；轉(zhuǎn)膜后封閉緩沖液2 h；一抗孵育過(guò)夜（待測(cè)蛋白c-met、VEGFR2、CAPNS-1 與內(nèi)參GAPDH）；洗膜后進(jìn)行二抗孵育；最后在凝膠成像儀中分別曝光，采集條帶圖片。

1.6 RT-PCR 檢 測(cè)c-met、VEGFR-2 mRNA 轉(zhuǎn) 錄 豐度：凍存的肝組織樣品使用RNA iso Plus 提取總RNA，進(jìn)行定量測(cè)定。隨后，提取的RNA 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明加入試劑，在37℃ 60 min、85℃5 min、4℃的條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；將逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA 根據(jù)定量試劑盒，在37℃ 2 min、95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s 的條件下進(jìn)行40 個(gè)周期循環(huán)。本部分設(shè)計(jì)檢測(cè)基因和引物序列如下：CMET（F-AAAAGTTCACCACCAAGTC；R-CATTC ACATAAGTAGCGTTC）、VEGFR2（F-TTTTGG TAGCGGGATGAA；R-ATGGGATTGGTGAGGATGA）、GAPDH（F-ATGCCGCCTGGAGAAACC；R-GCATC AAAGGTGGAAGAATGG）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：SPSS 26.0 軟件用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素方差分析用于組間差異分析，皮爾遜相關(guān)檢驗(yàn)用于相關(guān)性分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后存活率及一般觀察指標(biāo)：術(shù)后3 周無(wú)肝切組、30%肝切組、70%肝切組大鼠均存活，大鼠肝臟表面出現(xiàn)不同程度轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)，復(fù)發(fā)率在各組間無(wú)顯著性差異。此外，70%肝切組大鼠瘤肝體積較對(duì)照明顯變大，質(zhì)地較硬，且表面分布許多不同大小的灰白色轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)，肝實(shí)質(zhì)明顯受累（圖1A）。在無(wú)肝切組和30%肝切組，肝臟表面的結(jié)節(jié)顯示斑點(diǎn)狀浸潤(rùn)，肝臟輪廓完整，肝實(shí)質(zhì)輕微受累（圖1B）。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組瘤肝組織外觀

無(wú)肝切組、30%肝切組、70%肝切組實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前的平均體重不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（F=1.885，P ＞0.05）。然而術(shù)后3 周，70%肝切組實(shí)驗(yàn)大鼠的平均體重顯著低于其他2 組（F=26.692，P ＜0.05），而無(wú)肝切組與30%肝切組的大鼠平均體重仍沒(méi)有明顯差異。實(shí)驗(yàn)前后大鼠的體重變化（F=31.933）、荷瘤肝重（F=36.424）、荷瘤肝體質(zhì)量比 （F=65.813） 70%肝切組明顯高于無(wú)肝切組、30%肝切組（P ＜0.05）（表1）。

表1 一般觀察指標(biāo)（±s）

表1 一般觀察指標(biāo)（±s）

注：* P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

項(xiàng)目 H0 H30 H70 F 值術(shù)前體重（g） 216.75±6.50 223.38±5.13 219.13±8.66 1.885術(shù)后3 周體重（g） 195.75±5.55 199.50±5.29 172.13±11.80* 26.692體重變化（g） 21.00±4.54 23.88±4.42 47.00±10.61* 31.933荷瘤肝重量（g） 11.60±0.83 11.98±0.84 16.20±1.70* 36.424肝體質(zhì)量比（%） 5.93±0.44 6.15±0.75 9.42±0.80* 65.813

圖2 說(shuō)明腫瘤細(xì)胞團(tuán)灶彌漫性分布于70%肝切組大鼠肝臟內(nèi)。由于轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞團(tuán)灶的膨脹性生長(zhǎng)，使得周圍的肝實(shí)質(zhì)受到不同程度的損傷，其中70%肝切組肝臟周邊的肝實(shí)質(zhì)損傷最為嚴(yán)重（圖2A），而無(wú)肝切組、30%肝切組肝實(shí)質(zhì)破壞較輕。PCNA 指數(shù)的大小可間接反映出腫瘤組織的侵襲性，本研究中70%肝切組大鼠腫瘤組織的PCNA 指數(shù)顯著高于其他兩組（F=131.746，P ＜0.05），且無(wú)肝切組與30%肝切組的PCNA 指數(shù)無(wú)顯著差異（圖2B、2C）。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組瘤肝組織病理學(xué)檢查（×400）

2.2 腫瘤的侵襲性：本研究中70%肝切組的CAPNS-1 蛋白表達(dá)水平顯著高于無(wú)肝切組、30%肝切組（F=28.115， P ＜0.05），而無(wú)肝切組與30%肝切組的表達(dá)水平之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖3 Western Blot 示不同實(shí)驗(yàn)組中CAPNS-1 的蛋白表達(dá)水平

2.3 腫瘤結(jié)節(jié)中c-met、VEGFR-2 的蛋白及mRNA表達(dá)水平：圖4 可見(jiàn)70%肝切組的c-met（F=178.083， P＜0.05）、VEGFR-2（F=14.035，P＜0.05）蛋白表達(dá)水平與無(wú)肝切組、30%肝切組存在顯著性差異（圖4 a）。

RT-PCR 結(jié) 果 表 明70%肝 切 組c-met（F=22.803， P ＜0.05）、VEGFR-2（F=35.005， P ＜0.05）的mRNA 轉(zhuǎn)錄豐度顯著高于30%肝切組以及無(wú)肝切組（見(jiàn)圖4 b）。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組腫瘤結(jié)節(jié)中c-met、VEGFR-2 的蛋白表達(dá)及mRNA 轉(zhuǎn)錄豐度

c-met、VEGFR-2 蛋白的表達(dá)分別與荷瘤肝重、體重變化、荷瘤肝體質(zhì)量比、CAPNS-1 表達(dá)水平之間存在顯著正相關(guān)。其中c-met 與荷瘤肝重、體重變化、荷瘤肝體質(zhì)量比、CAPNS-1 表達(dá)水平之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.864、0.865、0.897、0.895，VEGFR-2 與荷瘤肝重、大鼠體重變化、荷瘤肝體質(zhì)量比、CAPNS-1 表達(dá)水平之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.796、0.710、0.803、0.606。

3 討 論

當(dāng)前HCC 患者的主要治療方式是肝移植和肝部分切除，然而有數(shù)據(jù)顯示，患者術(shù)后5 年腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的發(fā)生率達(dá)到40% ～ 70%，這嚴(yán)重威脅到HCC 患者的生命健康。一些研究表明，肝切除術(shù)后肝臟再生過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子并表達(dá)部分特征基因，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［5-6］，本研究以陳穎華等［7］的方法為參考經(jīng)門靜脈將Walker 256腫瘤細(xì)胞懸液注射至大鼠，探索不同比例肝切除對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的影響程度并探究其可能的發(fā)生機(jī)制。

在肝臟實(shí)質(zhì)遭受損傷或部分切除術(shù)后肝臟會(huì)進(jìn)行自我修復(fù)，在大鼠肝切除研究中，不同比例的肝切除會(huì)引起不成程度的肝再生。本研究表明，肝切除的比例與肝再生過(guò)程顯著相關(guān)，且該過(guò)程可加速腫瘤組織的生長(zhǎng)。同時(shí)30%肝切實(shí)驗(yàn)組大鼠肝再生過(guò)程并未明顯影響腫瘤結(jié)節(jié)的生長(zhǎng)，這可能是由于肝切除比例低于30%時(shí)，其DNA 合成速度僅是無(wú)肝切實(shí)驗(yàn)組的1 ～ 5 倍。

鈣蛋白酶小亞基-1（calpain small subunit-1，CAPNS-1）是鈣蛋白酶家族成員的一種調(diào)節(jié)性小亞基，在許多惡性腫瘤侵襲、進(jìn)展和遷移等過(guò)程異常表達(dá)［8］。在Dai 等［9］的研究中指出肝癌組織中基因CAPNS-1 的轉(zhuǎn)錄水平明顯比癌旁正常組織高，其可能通過(guò)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白-2 的表達(dá)或參與黏附斑激酶/酪氨酸蛋白激酶途徑加速肝癌細(xì)胞的形成、侵襲、遷移等過(guò)程。PCNA 是一種細(xì)胞核非組蛋白，研究表明可以通過(guò)PCNA 表達(dá)強(qiáng)弱判斷腫瘤的生物學(xué)行為從而作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)［10］。本研究中，CAPNS-1 蛋白在70%肝切組大鼠腫瘤組織的表達(dá)水平、PCNA 指數(shù)顯著高于30%肝切組和無(wú)肝切組，說(shuō)明70%肝切組大鼠的腫瘤組織侵襲性更高，惡性潛能更大。這些結(jié)果說(shuō)明肝再生過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤組織發(fā)生惡性轉(zhuǎn)換，進(jìn)而表現(xiàn)出較高水平的侵襲性與惡性潛能。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）最早于20 世紀(jì)80 年代末被人們發(fā)現(xiàn)，其信號(hào)通路在肝臟再生中起著核心作用，HGF 信號(hào)通路依賴于酪氨酸激酶受體c-met 的激活。研究表明，肝切除術(shù)后約30 min，HGF 表達(dá)水平上升約30 倍，并伴有c-met 受體的激活［11］。c-met 受體本身就是一種原癌基因，c-met 的過(guò)表達(dá)是腫瘤預(yù)后不良的一項(xiàng)指標(biāo)［12］。我們發(fā)現(xiàn)大鼠腫瘤組織中的c-met 蛋白和mRNA 表達(dá)量70%肝切實(shí)驗(yàn)組顯著高于無(wú)肝切組和30%肝切組，且c-met 的表達(dá)水平顯著相關(guān)于大鼠體重變化、荷瘤肝重等指標(biāo)，說(shuō)明腫瘤組織的侵襲性與較高水平的c-met 表達(dá)密切相關(guān)。因此，我們推測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移可能被70%肝切組手術(shù)完成后大量HGF 與c-met 高表達(dá)之間的相互作用促進(jìn)。

新生血管的生成為肝臟的再生過(guò)程中提供了充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）是活性較強(qiáng)的促血管生成因子之一。已有研究表明，在多種惡性腫瘤中VEGF 皆表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)錄豐度，其受體VEGFR-2 在腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲以及血管的形成發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，目前在中晚期肝癌治療中應(yīng)用了多種抗VEGF 和VEGF 受體靶向藥［13］。此外，本實(shí)驗(yàn)中70%肝切組大鼠腫瘤組織表現(xiàn)出高水平的VEGFR-2 mRNA 和蛋白表達(dá)，這與荷瘤肝重等指標(biāo)以及CAPNS-1 表達(dá)顯著相關(guān)，說(shuō)明VEGFR-2 的大量積累與腫瘤組織的侵襲性緊密相關(guān)。在肝再生過(guò)程中，VEGF 與VEGFR-2 受體的結(jié)合有利于腫瘤血管的生成進(jìn)而加速腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)VEGF 提高血管內(nèi)皮的通透性從而達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與浸潤(rùn)的目的。

4 小 結(jié)

在切除不同比例肝的基礎(chǔ)上經(jīng)門靜脈注射Walker 256 腫瘤細(xì)胞模擬肝癌肝部分切除或LDLT術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)模型，研究結(jié)果顯示，肝再生過(guò)程不僅促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還加快了其惡性轉(zhuǎn)換的速度，這可能與肝再生的過(guò)程中釋放大量的細(xì)胞因子有關(guān)。