◎ 余 薇，鄧小華，劉 婷，潘篤杰，鄭巧雙

（湖北工業(yè)微生物菌種保藏與研究中心，湖北 武漢 430019）

枯草芽孢桿菌是一種廣泛存在于自然界的好氧桿菌，該菌主要是通過消耗腸道內多余的氧、降低氧化還原電位及環(huán)境pH，從而創(chuàng)造厭氧環(huán)境，抑制某些有害病菌，達到預防及治療某些腸道病的作用[1-2]?？莶菅挎邨U菌還具有較強的多種酶促活性，能用于動物飼料添加劑中發(fā)揮益生菌的功效[3]。水產養(yǎng)殖行業(yè)中，在水體環(huán)境或者水產養(yǎng)殖飼料中使用枯草芽孢桿菌制劑能有效抑制甚至殺滅水體環(huán)境中的某些有害微生物，強化益生菌群體系，從而達到防治水產疾病的目的[4-5]?？莶菅挎邨U菌在食品工業(yè)也有廣泛的應用，例如日本學者發(fā)現(xiàn)枯草桿菌能發(fā)酵納豆產生一種枯草桿菌蛋白激酶，這種酶能溶解血栓，可開發(fā)出一種新的溶栓藥品[6]。在醫(yī)藥領域，枯草芽孢桿菌活菌劑還可以作為口服液治療腸炎、支氣管炎和腹瀉等多種疾病，也能用來預防和治療燒傷面感染等[7]。

目前枯草芽孢桿菌在飼料行業(yè)應用廣泛，多采用固態(tài)發(fā)酵模式獲得高活菌數，菌粉純度不高，做法較為粗糙只能用于飼用行業(yè)及水產養(yǎng)殖行業(yè)，而醫(yī)藥行業(yè)以及食品行業(yè)所需要的菌劑要求純度較高，有些也需要液態(tài)發(fā)酵代謝產物。因此，本研究對一株能改善腸道功能的藥食性益生型枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，期望解決現(xiàn)階段液態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產中存在的活菌數低、成本高等問題，為工業(yè)化生產提供一定的指導。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗菌種與培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisHB82025），來源于湖北工業(yè)微生物菌種保藏與研究中心。

營養(yǎng)肉湯NB：蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

1.1.2 儀器與設備

三角瓶、量筒、pH計、UV2600分光光度計（島津）、DL2002電子天平（梅特勒）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒）、BSC-1600ⅡA2生物安全柜（蘇凈安泰）、cx31三目顯微鏡（奧林巴斯）、生化培養(yǎng)箱（上海一恒）、自動滅菌鍋（上海申安）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將保藏好的菌種凍存管（編號HB82025），按照5%接種量，接種于10 mL營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基中， 37 ℃，200 r·min-1，活化16 h，然后將活化種按照5%接種量接種于50 mL NB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r·min-1，培養(yǎng)8 h，作為一級種子液，按照5%接種量接種于發(fā)酵液，采用三角瓶裝發(fā)酵液，裝液量為1/10（v/v），于37 ℃、200 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，進行培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化試驗。

1.2.2 碳源篩選

在原始NB培養(yǎng)基基礎上分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和淀粉作為額外碳源，添加量均為0.5%，并設置空白，于37 ℃、200 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后采用傾注法[8]活菌計數，檢測發(fā)酵液中的活菌含量以篩選最佳碳源。

1.2.3 氮源篩選

在上述1.2.2確定的最佳碳源基礎上，分別以蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉粉、酵母粉和尿素作為氮源，添加量均為2%，于37 ℃、200 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)24 h檢測發(fā)酵液中的活菌含量以篩選最佳氮源。

1.2.4 無機鹽篩選

無機鹽選擇1#—氯化鈉、2#—MgSO4.7H2O、3#—MnSO4.H2O、4#—磷 酸 二 氫 鉀（0.25%）+磷酸 氫 二 鉀（0.25%）及5#—MgSO4·7H2O（0.07%）+MnSO4·H2O（0.03%）+磷酸二氫鉀（0.2%）+磷酸氫二鉀（0.2%）；無機鹽總量控制在0.5%，于37 ℃、200 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，檢測發(fā)酵液的活菌數以篩選最佳的無機鹽。

1.2.5 菌株生長曲線測定

將保藏凍存管活化好后，種子液及發(fā)酵液均采用上述篩選出的最佳培養(yǎng)基，種子液活化及接種量、發(fā)酵參數等均同1.2.1，自接種后每2 h取樣1次測定菌液的OD600，用未接種的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.6 發(fā)酵模式優(yōu)化

將24 h連續(xù)搖床發(fā)酵改為分段式補料發(fā)酵模式，發(fā)酵液接種后在第一階段發(fā)酵14 h，然后將發(fā)酵培養(yǎng)基按照1∶1補料，再連續(xù)發(fā)酵10 h，結束發(fā)酵；取樣測定發(fā)酵液活菌等指標。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

培養(yǎng)基中碳源、氮源、無機鹽優(yōu)化結果分別如圖1～ 圖3所示。

圖1 碳源對菌株生長影響圖

圖2 氮源對菌株生長影響圖

圖3 無機鹽對菌株生長影響圖

（1）碳源篩選。在原始營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基基礎上，額外添加0.5%葡萄糖、蔗糖等作為碳源，除了淀粉外，其他實驗組均有明顯的促生長作用，葡萄糖作為單糖也明顯優(yōu)于蔗糖和麥芽糖。

（2）氮源篩選。將大豆蛋白胨作為氮源替代普通蛋白胨，對該枯草芽孢桿菌有很明顯的促生長作用，尿素作為氮源效果最差，而蛋白胨、牛肉粉、酵母粉效果相當。

（3）無機鹽篩選。采用5組無機鹽添加配比，篩選最佳的無機鹽組分，由圖3可以看到2#、4#分別采用MgSO4·7H2O以及磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀替代NaCl，對枯草芽孢桿菌的生長有一定促進作用，但是不顯著；3#效果更差一些，可能是Mn+濃度過高，對菌株生長產生了抑制；5#采用MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀4種無機鹽進行復配，其促生長效果很顯著。

2.2 發(fā)酵模式改進優(yōu)化

該菌種采用上述最優(yōu)培養(yǎng)基發(fā)酵，生長曲線如圖4 所示。由圖4可知，0～4 h為菌株生長的停滯期，菌數增長很少，而4 h后進入對數生長期，14 h到達生長高峰，10～14 h為生長穩(wěn)定期，菌株生長緩慢， 14 h后生物量開始減少，進入衰亡期。以該生長曲線作為參考，在其到達最高點時調整發(fā)酵模式，在14 h后進行補料，添加新鮮培養(yǎng)基，再繼續(xù)發(fā)酵10 h，延長其對數生長期。

圖4 菌株生長曲線圖

改進發(fā)酵模式后，相應發(fā)酵液活菌如表1所示。

表1 不同發(fā)酵模式生物量表

由表1可知，更改發(fā)酵模式采用分段發(fā)酵，發(fā)酵14 h后補料，新加入培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵10 h，因新增營養(yǎng)，有利于發(fā)酵過程中菌體生長期延長，能有效提高其發(fā)酵液活菌生物量情況。OD600提高近1倍，而活菌也由2.48×109CFU·mL-1提高到8.4×109CFU·mL-1，優(yōu)化效果非常顯著，該發(fā)酵模式對工業(yè)化生產發(fā)酵放大具有很大的指導意義。

3 結論

本實驗對一株藥食性益生型枯草芽孢桿菌的液態(tài)發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為0.5%葡萄糖、2%大豆蛋白胨、0.07% MgSO4·7H2O、0.03% MnSO4·H2O、0.2%磷酸二氫鉀、0.2%磷酸氫二鉀，pH=7.2，接種量5%，裝液量10%，搖床轉速 200 r·min-1、發(fā)酵14 h后按照1∶1補料新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵10 h，整個發(fā)酵時間為24 h。該液態(tài)發(fā)酵條件下，發(fā)酵液活菌高達8.4×109CFU·mL-1，優(yōu)化效果顯著。