易明花等

摘要：采用正交試驗(yàn)研究了碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖最適的培養(yǎng)基配方為玉米粉的添加量為2.0%，黃豆粉的添加量為0.3%，KH2PO4的添加量為0.15%，此條件下胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為13.036 mg/100 mL，較優(yōu)化前提高了121.7%。

關(guān)鍵詞：灰樹(shù)花（Grifola frondosa）；胞內(nèi)多糖；碳源；氮源；無(wú)機(jī)鹽

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ461 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）06-1378-04

Effects of Culture Medium Conditions on Intracellular Polysaccharides of

Grifola frondosa

YI Ming-hua1，WU Xiao-yan2，GUO Xun-jing2，CHEN Bi2

（Department of Life Science， Yuanpei College， Shaoxing University，

Shaoxing 312000， Zhejiang， China）

Abstract： The effects of carbon source， nitrogen source， inorganic salts on the production of intracellular polysaccharide of Grifola frondosa were studied by orthogonal test. The results showed that the optimal culture medium contained 2.0% corn powder， 0.3% soybean powder and 0.15% KH2PO4. Under this condition， the yield of intracellular polysaccharides was 13.036 mg/100 mL， 121.7% higher than that before optimization.

Key words： Grifola frondosa； intracellular polysaccharide； carbon source； nitrogen source； inorganic salts

灰樹(shù)花（Grifola frondosa）是多孔菌屬的一種大型真菌， 別稱(chēng)貝葉多孔菌、栗子蘑、佛菌、重菇等。研究表明，灰樹(shù)花多糖已被證實(shí)是一種具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、治療糖尿病、降低血藥血脂等多種功效真菌多糖[1，2]。目前市場(chǎng)上開(kāi)發(fā)有灰樹(shù)花多糖產(chǎn)品，多數(shù)是從灰樹(shù)花子實(shí)體里提取的，由于灰樹(shù)花子實(shí)體的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，因此灰樹(shù)花多糖及其制品的開(kāi)發(fā)和推廣受到一定的限制。

本研究從浙江省慶元縣獲得一株長(zhǎng)勢(shì)較好的灰樹(shù)花菌株，試圖采用液體發(fā)酵的方法，通過(guò)優(yōu)化其生長(zhǎng)所需要的培養(yǎng)基來(lái)促進(jìn)灰樹(shù)花多糖的產(chǎn)量。關(guān)于灰樹(shù)花液體發(fā)酵產(chǎn)多糖的研究近年來(lái)的報(bào)道很多，多集中在胞外多糖的研究，而胞外多糖的測(cè)定受培養(yǎng)基添加組分的影響較大。因此本研究主要研究培養(yǎng)基組分對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

灰樹(shù)花菌種引自浙江省慶元縣食用菌科研中心；牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，維生素B1，KH2PO4，MgSO4等均為分析純；土豆、玉米粉、黃豆粉為市售。

1.2 培養(yǎng)基

斜面和平板培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加去離子水至1 000 mL，pH 自然。

種子培養(yǎng)基[3]：去皮馬鈴薯200 g，葡糖糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO4 2 g，MgSO4 1 g，維生素B1 10 mg，加水至1 000 mL，pH自然。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[3]：葡萄糖22 g，蛋白胨3 g，KH2PO4 0.8 g，維生素B1 0.12 g，加去離子水至1 000 mL，pH自然。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化 從保藏菌種的試管中挖取黃豆大小長(zhǎng)有菌絲體的培養(yǎng)基1塊，轉(zhuǎn)接在平板培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，待菌絲體長(zhǎng)出后，立即接種或貯存于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 種子培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[4]在三角瓶中裝入液體培養(yǎng)基50 mL，從平板培養(yǎng)基上挖取黃豆大小已活化的菌絲體10塊接入三角瓶中，130 r/min，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。 在接入發(fā)酵培養(yǎng)基前，采用鏡檢與斜面培養(yǎng)法結(jié)合檢查菌種是否染菌，無(wú)雜菌污染方可使用。

1.3.3 胞內(nèi)多糖的提取及測(cè)定

1）菌絲生物量的測(cè)定。取50 mL發(fā)酵液3 000 r/min離心20 min，去除上清液，沉淀55 ℃烘干，用分析天平稱(chēng)重，得菌絲生物量[5]。

2）胞內(nèi)多糖的提取。微波輔助熱水浸提法[6-8]。將培養(yǎng)好的菌液經(jīng)4層紗布過(guò)濾后得菌絲體，蒸餾水沖洗干凈后，置于干燥箱中70 ℃烘干至恒重，取干菌絲體粉末2 g，按料液比1∶40（g∶mL）加入蒸餾水，置于微波爐中，750 W加熱10 min，放入沸水浴中30 min，1 000 r/min離心取上清液即為胞內(nèi)多糖水溶液。

3）胞內(nèi)多糖的測(cè)定。采用苯酚-硫酸法[9，10]。最大吸收波長(zhǎng)的選擇：吸取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.6 mL，加去離子水至1 mL，在冰水浴中加入5%苯酚水溶液0.5 mL、濃硫酸5 mL，混勻，沸水浴2 min，冷水浴冷卻，于400～600 nm掃描。

4）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。分別吸取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.7 mL各3份，按最大吸收波長(zhǎng)下方法測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 單因素試驗(yàn)

在三角瓶中裝入液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，10% 種子液接種，130 r/min，25 ℃恒溫發(fā)酵10 d。研究不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響[11，12]。

1.5 正交試驗(yàn)

在分析灰樹(shù)花發(fā)酵單因素碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)上，選擇玉米粉為碳源、黃豆粉為氮源、KH2PO4為無(wú)機(jī)鹽，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

通過(guò)對(duì)最大吸收波長(zhǎng)的選擇得出，最大吸收波長(zhǎng)為485 nm處。根據(jù)葡萄糖濃度和最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制如圖。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為Y=0.004 8x+0.145 9，R2=0.999 1，表明葡萄糖濃度在20～170 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源及其添加量對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響 在250 mL的三角瓶中，裝入100 mL去葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加濃度為2%葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉及玉米粉。120 r/min，28 ℃恒溫發(fā)酵10 d，每組重復(fù)3次。測(cè)定發(fā)酵液中菌絲、胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量（圖2）。由圖2可知，單糖、雙糖和多糖都能促進(jìn)灰樹(shù)花的生長(zhǎng)，多糖的效果優(yōu)于單糖和雙糖，其中多糖中玉米粉對(duì)灰樹(shù)花的生長(zhǎng)促進(jìn)作用優(yōu)于淀粉。在玉米粉添加的發(fā)酵瓶中，明顯發(fā)現(xiàn)菌絲球較多、直徑也較大，這可能是由于玉米粉中除淀粉外，還含有維生素等微量元素。

由圖3可知，隨著玉米粉的濃度上升，灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量呈上升的趨勢(shì)。當(dāng)玉米粉的濃度為2.0%時(shí)，灰樹(shù)花的菌絲和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量均達(dá)到最高。隨著玉米粉濃度的繼續(xù)增加菌絲、胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量反倒下降，這可能是玉米粉的濃度太大抑制了代謝的正向進(jìn)行。研究中還發(fā)現(xiàn)，較高的玉米粉濃度，容易導(dǎo)致菌絲直徑過(guò)大，不利于發(fā)酵的進(jìn)行。因此選擇玉米粉的最適合濃度為2.0%。

2.2.2 氮源及其添加量對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響 在250 mL的三角瓶中，裝入100 mL去蛋白胨的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加濃度為0.3%的牛肉膏、蛋白胨、大豆粉、硝酸銨、氯化銨。120 r/min，28 ℃恒溫?fù)u床發(fā)酵10 d，每組重復(fù)3次。由圖4可知，灰樹(shù)花對(duì)有機(jī)氮源的利用明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源；在有機(jī)氮源中，大豆粉的效果最為明顯。這可能是由于大豆粉不僅能提供灰樹(shù)花生長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，同時(shí)還能提供豐富的纖維、脂肪酸和維生素，而這些物質(zhì)為灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖的積累提供了重要的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)。因此選擇大豆粉作為最佳的氮源，同時(shí)考慮其濃度對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖和菌絲生物量的影響。

由圖5可知，隨著大豆粉濃度的增加，灰樹(shù)花菌絲和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量都呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)大豆粉濃度為0.3%時(shí)，灰樹(shù)花菌絲和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量均達(dá)到最高。隨著大豆粉濃度的繼續(xù)上升，反而抑制了灰樹(shù)花菌絲的生長(zhǎng)和胞內(nèi)多糖的積累。

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽及其添加量對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響 無(wú)機(jī)鹽能提供微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中所需要的除氮源、碳源以外的重要營(yíng)養(yǎng)素，同時(shí)也是微生物酶系的重要激活因素。本試驗(yàn)分別以濃度為0.1%的CaCl2、MgSO4、ZnSO4、FeSO4、KH2PO4 5種無(wú)機(jī)鹽接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，空白對(duì)照不添加，每組重復(fù)3次。120 r/min，28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 d，測(cè)定灰樹(shù)花菌絲和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、K+等離子對(duì)灰樹(shù)花菌絲體的生長(zhǎng)及胞內(nèi)多糖的積累有一定的促進(jìn)作用，其中KH2PO4和MgSO4的影響更為明顯，考慮到KH2PO4既是灰樹(shù)花菌株體內(nèi)酶的激活因素，H2PO4-又是細(xì)胞膜生長(zhǎng)的有效成分，同時(shí)較MgSO4有更好的溶解性，因此在灰樹(shù)花的液體發(fā)酵過(guò)程中選擇KH2PO4作為其生長(zhǎng)所需要的無(wú)機(jī)鹽。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)因素水平的設(shè)計(jì)，按照正交試驗(yàn)表L9（34），共進(jìn)行了9組發(fā)酵試驗(yàn)，以菌絲體胞內(nèi)多糖含量為指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由極差R的大小，可知A為主要影響因素，C為最次要因素。因素主次關(guān)系為A>B>C。由表2可知，最佳工藝條件為A2B2C3，即，碳源玉米粉的添加量為2.0%，氮源黃豆粉的添加量為0.3%，KH2PO4的添加量為0.15%。用所得的最適發(fā)酵培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行比較，檢驗(yàn)正交試驗(yàn)的優(yōu)化效果。胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量為 13.036 mg/100 mL，比優(yōu)化前胞內(nèi)多糖產(chǎn)量（5.880 mg/100 mL）提高了121.7%。

3 小結(jié)與討論

綜上所述，灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的單因素研究得出：玉米粉為最適碳源，黃豆粉為最適氮源，KH2PO4為最適無(wú)機(jī)鹽。通過(guò)正交試驗(yàn)得出，最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米粉的添加量為2.0%，黃豆粉的添加量為0.3%，KH2PO4的添加量為0.15%，此工藝條件下，胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量為13.036 mg/100 mL，較優(yōu)化前提高了121.7%。

灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量受培養(yǎng)基的影響較為明顯，本研究只對(duì)其中的氮源、氮源和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，生長(zhǎng)因子、發(fā)酵工藝條件等都會(huì)影響多糖的產(chǎn)量，這將是下一步繼續(xù)研究的方向。

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1.4 單因素試驗(yàn)

在三角瓶中裝入液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，10% 種子液接種，130 r/min，25 ℃恒溫發(fā)酵10 d。研究不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響[11，12]。

1.5 正交試驗(yàn)

在分析灰樹(shù)花發(fā)酵單因素碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)上，選擇玉米粉為碳源、黃豆粉為氮源、KH2PO4為無(wú)機(jī)鹽，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

通過(guò)對(duì)最大吸收波長(zhǎng)的選擇得出，最大吸收波長(zhǎng)為485 nm處。根據(jù)葡萄糖濃度和最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制如圖。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為Y=0.004 8x+0.145 9，R2=0.999 1，表明葡萄糖濃度在20～170 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源及其添加量對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響 在250 mL的三角瓶中，裝入100 mL去葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加濃度為2%葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉及玉米粉。120 r/min，28 ℃恒溫發(fā)酵10 d，每組重復(fù)3次。測(cè)定發(fā)酵液中菌絲、胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量（圖2）。由圖2可知，單糖、雙糖和多糖都能促進(jìn)灰樹(shù)花的生長(zhǎng)，多糖的效果優(yōu)于單糖和雙糖，其中多糖中玉米粉對(duì)灰樹(shù)花的生長(zhǎng)促進(jìn)作用優(yōu)于淀粉。在玉米粉添加的發(fā)酵瓶中，明顯發(fā)現(xiàn)菌絲球較多、直徑也較大，這可能是由于玉米粉中除淀粉外，還含有維生素等微量元素。

由圖3可知，隨著玉米粉的濃度上升，灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量呈上升的趨勢(shì)。當(dāng)玉米粉的濃度為2.0%時(shí)，灰樹(shù)花的菌絲和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量均達(dá)到最高。隨著玉米粉濃度的繼續(xù)增加菌絲、胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量反倒下降，這可能是玉米粉的濃度太大抑制了代謝的正向進(jìn)行。研究中還發(fā)現(xiàn)，較高的玉米粉濃度，容易導(dǎo)致菌絲直徑過(guò)大，不利于發(fā)酵的進(jìn)行。因此選擇玉米粉的最適合濃度為2.0%。

2.2.2 氮源及其添加量對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響 在250 mL的三角瓶中，裝入100 mL去蛋白胨的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加濃度為0.3%的牛肉膏、蛋白胨、大豆粉、硝酸銨、氯化銨。120 r/min，28 ℃恒溫?fù)u床發(fā)酵10 d，每組重復(fù)3次。由圖4可知，灰樹(shù)花對(duì)有機(jī)氮源的利用明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源；在有機(jī)氮源中，大豆粉的效果最為明顯。這可能是由于大豆粉不僅能提供灰樹(shù)花生長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，同時(shí)還能提供豐富的纖維、脂肪酸和維生素，而這些物質(zhì)為灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖的積累提供了重要的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)。因此選擇大豆粉作為最佳的氮源，同時(shí)考慮其濃度對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖和菌絲生物量的影響。

由圖5可知，隨著大豆粉濃度的增加，灰樹(shù)花菌絲和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量都呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)大豆粉濃度為0.3%時(shí)，灰樹(shù)花菌絲和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量均達(dá)到最高。隨著大豆粉濃度的繼續(xù)上升，反而抑制了灰樹(shù)花菌絲的生長(zhǎng)和胞內(nèi)多糖的積累。

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽及其添加量對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響 無(wú)機(jī)鹽能提供微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中所需要的除氮源、碳源以外的重要營(yíng)養(yǎng)素，同時(shí)也是微生物酶系的重要激活因素。本試驗(yàn)分別以濃度為0.1%的CaCl2、MgSO4、ZnSO4、FeSO4、KH2PO4 5種無(wú)機(jī)鹽接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，空白對(duì)照不添加，每組重復(fù)3次。120 r/min，28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 d，測(cè)定灰樹(shù)花菌絲和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、K+等離子對(duì)灰樹(shù)花菌絲體的生長(zhǎng)及胞內(nèi)多糖的積累有一定的促進(jìn)作用，其中KH2PO4和MgSO4的影響更為明顯，考慮到KH2PO4既是灰樹(shù)花菌株體內(nèi)酶的激活因素，H2PO4-又是細(xì)胞膜生長(zhǎng)的有效成分，同時(shí)較MgSO4有更好的溶解性，因此在灰樹(shù)花的液體發(fā)酵過(guò)程中選擇KH2PO4作為其生長(zhǎng)所需要的無(wú)機(jī)鹽。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)因素水平的設(shè)計(jì)，按照正交試驗(yàn)表L9（34），共進(jìn)行了9組發(fā)酵試驗(yàn)，以菌絲體胞內(nèi)多糖含量為指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由極差R的大小，可知A為主要影響因素，C為最次要因素。因素主次關(guān)系為A>B>C。由表2可知，最佳工藝條件為A2B2C3，即，碳源玉米粉的添加量為2.0%，氮源黃豆粉的添加量為0.3%，KH2PO4的添加量為0.15%。用所得的最適發(fā)酵培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行比較，檢驗(yàn)正交試驗(yàn)的優(yōu)化效果。胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量為 13.036 mg/100 mL，比優(yōu)化前胞內(nèi)多糖產(chǎn)量（5.880 mg/100 mL）提高了121.7%。

3 小結(jié)與討論

綜上所述，灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的單因素研究得出：玉米粉為最適碳源，黃豆粉為最適氮源，KH2PO4為最適無(wú)機(jī)鹽。通過(guò)正交試驗(yàn)得出，最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米粉的添加量為2.0%，黃豆粉的添加量為0.3%，KH2PO4的添加量為0.15%，此工藝條件下，胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量為13.036 mg/100 mL，較優(yōu)化前提高了121.7%。

灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量受培養(yǎng)基的影響較為明顯，本研究只對(duì)其中的氮源、氮源和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，生長(zhǎng)因子、發(fā)酵工藝條件等都會(huì)影響多糖的產(chǎn)量，這將是下一步繼續(xù)研究的方向。

參考文獻(xiàn)：

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1.4 單因素試驗(yàn)

在三角瓶中裝入液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，10% 種子液接種，130 r/min，25 ℃恒溫發(fā)酵10 d。研究不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響[11，12]。

1.5 正交試驗(yàn)

在分析灰樹(shù)花發(fā)酵單因素碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)上，選擇玉米粉為碳源、黃豆粉為氮源、KH2PO4為無(wú)機(jī)鹽，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

通過(guò)對(duì)最大吸收波長(zhǎng)的選擇得出，最大吸收波長(zhǎng)為485 nm處。根據(jù)葡萄糖濃度和最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制如圖。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為Y=0.004 8x+0.145 9，R2=0.999 1，表明葡萄糖濃度在20～170 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源及其添加量對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響 在250 mL的三角瓶中，裝入100 mL去葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加濃度為2%葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉及玉米粉。120 r/min，28 ℃恒溫發(fā)酵10 d，每組重復(fù)3次。測(cè)定發(fā)酵液中菌絲、胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量（圖2）。由圖2可知，單糖、雙糖和多糖都能促進(jìn)灰樹(shù)花的生長(zhǎng)，多糖的效果優(yōu)于單糖和雙糖，其中多糖中玉米粉對(duì)灰樹(shù)花的生長(zhǎng)促進(jìn)作用優(yōu)于淀粉。在玉米粉添加的發(fā)酵瓶中，明顯發(fā)現(xiàn)菌絲球較多、直徑也較大，這可能是由于玉米粉中除淀粉外，還含有維生素等微量元素。

由圖3可知，隨著玉米粉的濃度上升，灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量呈上升的趨勢(shì)。當(dāng)玉米粉的濃度為2.0%時(shí)，灰樹(shù)花的菌絲和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量均達(dá)到最高。隨著玉米粉濃度的繼續(xù)增加菌絲、胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量反倒下降，這可能是玉米粉的濃度太大抑制了代謝的正向進(jìn)行。研究中還發(fā)現(xiàn)，較高的玉米粉濃度，容易導(dǎo)致菌絲直徑過(guò)大，不利于發(fā)酵的進(jìn)行。因此選擇玉米粉的最適合濃度為2.0%。

2.2.2 氮源及其添加量對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響 在250 mL的三角瓶中，裝入100 mL去蛋白胨的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加濃度為0.3%的牛肉膏、蛋白胨、大豆粉、硝酸銨、氯化銨。120 r/min，28 ℃恒溫?fù)u床發(fā)酵10 d，每組重復(fù)3次。由圖4可知，灰樹(shù)花對(duì)有機(jī)氮源的利用明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源；在有機(jī)氮源中，大豆粉的效果最為明顯。這可能是由于大豆粉不僅能提供灰樹(shù)花生長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，同時(shí)還能提供豐富的纖維、脂肪酸和維生素，而這些物質(zhì)為灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖的積累提供了重要的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)。因此選擇大豆粉作為最佳的氮源，同時(shí)考慮其濃度對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖和菌絲生物量的影響。

由圖5可知，隨著大豆粉濃度的增加，灰樹(shù)花菌絲和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量都呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)大豆粉濃度為0.3%時(shí)，灰樹(shù)花菌絲和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量均達(dá)到最高。隨著大豆粉濃度的繼續(xù)上升，反而抑制了灰樹(shù)花菌絲的生長(zhǎng)和胞內(nèi)多糖的積累。

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽及其添加量對(duì)灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響 無(wú)機(jī)鹽能提供微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中所需要的除氮源、碳源以外的重要營(yíng)養(yǎng)素，同時(shí)也是微生物酶系的重要激活因素。本試驗(yàn)分別以濃度為0.1%的CaCl2、MgSO4、ZnSO4、FeSO4、KH2PO4 5種無(wú)機(jī)鹽接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，空白對(duì)照不添加，每組重復(fù)3次。120 r/min，28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 d，測(cè)定灰樹(shù)花菌絲和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、K+等離子對(duì)灰樹(shù)花菌絲體的生長(zhǎng)及胞內(nèi)多糖的積累有一定的促進(jìn)作用，其中KH2PO4和MgSO4的影響更為明顯，考慮到KH2PO4既是灰樹(shù)花菌株體內(nèi)酶的激活因素，H2PO4-又是細(xì)胞膜生長(zhǎng)的有效成分，同時(shí)較MgSO4有更好的溶解性，因此在灰樹(shù)花的液體發(fā)酵過(guò)程中選擇KH2PO4作為其生長(zhǎng)所需要的無(wú)機(jī)鹽。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)因素水平的設(shè)計(jì)，按照正交試驗(yàn)表L9（34），共進(jìn)行了9組發(fā)酵試驗(yàn)，以菌絲體胞內(nèi)多糖含量為指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由極差R的大小，可知A為主要影響因素，C為最次要因素。因素主次關(guān)系為A>B>C。由表2可知，最佳工藝條件為A2B2C3，即，碳源玉米粉的添加量為2.0%，氮源黃豆粉的添加量為0.3%，KH2PO4的添加量為0.15%。用所得的最適發(fā)酵培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行比較，檢驗(yàn)正交試驗(yàn)的優(yōu)化效果。胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量為 13.036 mg/100 mL，比優(yōu)化前胞內(nèi)多糖產(chǎn)量（5.880 mg/100 mL）提高了121.7%。

3 小結(jié)與討論

綜上所述，灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的單因素研究得出：玉米粉為最適碳源，黃豆粉為最適氮源，KH2PO4為最適無(wú)機(jī)鹽。通過(guò)正交試驗(yàn)得出，最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米粉的添加量為2.0%，黃豆粉的添加量為0.3%，KH2PO4的添加量為0.15%，此工藝條件下，胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量為13.036 mg/100 mL，較優(yōu)化前提高了121.7%。

灰樹(shù)花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量受培養(yǎng)基的影響較為明顯，本研究只對(duì)其中的氮源、氮源和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，生長(zhǎng)因子、發(fā)酵工藝條件等都會(huì)影響多糖的產(chǎn)量，這將是下一步繼續(xù)研究的方向。

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