林雪芹 綜述 王曉樂 彭鏡 審校

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院兒科/湖南省兒童腦發(fā)育障礙性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖南長沙 410008）

[Chinese Journal of Contemporary Pediatrics, 2022, 24(11): 1281-1287]

Key words:Lysosomal storage disease; Adeno-associated virus; Gene therapy

溶酶體貯積癥（lysosomal storage disorders，LSDs）是一組由溶酶體酶或功能相關(guān)蛋白缺陷所致的高度異質(zhì)性疾病，累及多個組織器官，表現(xiàn)形式多樣。每年活產(chǎn)嬰兒發(fā)病率為1/5 000~1/7 000［1］。臨床治療以酶替代療法（enzyme replacement therapy，ERT）為主，但該療法對具有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的LSDs患者療效甚微。腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）是靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的“明星載體”，其介導(dǎo)的基因治療在部分LSDs動物實(shí)驗和臨床試驗中都取得了較好療效，有望成為治愈LSDs的方式。本文總結(jié)了目前AAV在常見LSDs的動物實(shí)驗及臨床試驗情況，為AAV介導(dǎo)的基因療法在LSDs中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 LSDs概述

LSDs主要是由編碼溶酶體功能相關(guān)的水解酶或蛋白基因突變所致。由于這些酶或蛋白的缺陷，溶酶體不能正常降解大分子底物，未被降解的大分子底物在細(xì)胞內(nèi)逐漸累積，當(dāng)貯積到一定程度時會導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡［2］。截至2021年12月1日，世界研討會溶酶體病官方名單（worldsymposia.org/official-list-of-lysosomal-diseases）已公布68種LSDs。該病的臨床表現(xiàn)形式多樣，可有多個器官系統(tǒng)受累，超過2/3的患者有神經(jīng)系統(tǒng)受累，疾病的嚴(yán)重程度與酶殘留活性呈負(fù)相關(guān)［3］。該病主要治療方法有ERT、造血干細(xì)胞移植、基因治療和對癥支持治療［4］。隨著治療時間的延長，使用ERT的患者可能會因為對外源性酶產(chǎn)生免疫反應(yīng)導(dǎo)致療效下降，此外，血腦屏障的存在限制了有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀患者的給藥途徑［5］。造血干細(xì)胞移植技術(shù)本身比較成熟，在LSDs中的應(yīng)用逐漸增多，對疾病早期和非中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的患者部分有效，但需要找到合適的供者，這使得造血干細(xì)胞移植只對部分LSDs患者有效。迄今，基因治療在LSDs中的應(yīng)用仍處于前臨床及臨床試驗階段，但已完成的試驗結(jié)果提示其具有較好療效，特別是在具有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的LSDs患者中。LSDs基因治療的載體主要有AAV、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒（表1），其中AAV應(yīng)用最為廣泛［4］。

表1 3種病毒載體的特點(diǎn)

2 AAV載體概述

AAV是一個小型的、無包膜的二十四面體病毒，由Rep、Cap 2個開放閱讀框（open reading frame，ORF）和包含145個核苷酸的2個末端重復(fù)序列（inverted terminal repeat，ITR）組成，其基因組為單鏈線性DNA（4.7 kb）（圖1）。ITR是由2個回文序列互補(bǔ)形成的T型發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在AAV的復(fù)制、包裝和整合中起著非常重要的作用。Rep ORF編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白，分別是Rep78、Rep68、Rep52和Rep40；Cap ORF編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為VP1、VP2、VP3和APP蛋白［6］。用于基因治療的AAV載體通常為重組AAV（recombinant adeno-associated virus，rAAV），即野生型AAV中的rep和cap基因被基因表達(dá)盒（1個啟動子、1個目的基因、1個轉(zhuǎn)錄終止信號）所取代，只保留兩端的ITR［6］（圖1）。AAV有十多種血清型，不同血清型具有不同的組織和細(xì)胞趨向性。在基因治療中常根據(jù)靶器官選擇rAAV的血清型和啟動子。構(gòu)建治療LSDs的rAAV常用啟動子有巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）啟 動 子、結(jié) 合 蛋 白（desmin，DES）啟動子、巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)/β肌動蛋白（CMV enhancer/β-actin，CB）啟動子、肝臟特異性啟動子（liver specific promoter，LSP）等［7］。迄 今，AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh.10已被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的實(shí)驗（表2）?？茖W(xué)家們一直致力于開發(fā)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高和組織趨向性更強(qiáng)的AAV，比如AAV2/1、AAVDJ、AAV-PHP.B、AAV2-7m8等［6］。至今已有5種與AAV相關(guān)的基因治療藥物被批準(zhǔn)上市，分別是Glybera（治療脂蛋白脂肪酶缺乏癥）、Luxturna（治療遺傳性視神經(jīng)炎）、Zolgensma（治療脊髓性肌萎縮癥）、Upstaza（治療芳香族L-氨基酸脫羧酶缺乏癥）和Roctavian（治療血友病A）。

表2 靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的AAV常見血清型

圖1 野生型和重組型AAV的結(jié)構(gòu)

3 AAV介導(dǎo)的基因治療在LSDs中的應(yīng)用

在PubMed數(shù)據(jù)庫中以“adeno-associated virus”“AAV”“l(fā)ysosomal storage disorder”“l(fā)ysosomal storage disease”“LSDs”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)近十年有200多篇文章，涉及法布里病、戈謝病、黏脂貯積癥等，其中黏多糖貯積癥（mucopolysaccharidosis disease，MPS）80余 篇，Pompe病（Pompe disease）50余篇，神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積癥（neuronal ceroid lipofuscinoses，NCL）20余篇。此外通過檢索臨床研究網(wǎng)站（clinicaltrials.gov和clinicaltrialsregister.eu），發(fā)現(xiàn)截至2022年7月16日AAV在LSDs上的臨床研究多集中在Pompe病、MPS、NCL（表3）。因此，我們重點(diǎn)闡述AAV載體在這3種疾病中的進(jìn)展。

表3 AAV介導(dǎo)的基因療法在LSDs中的臨床研究

表3（續(xù)）

3.1 Pompe病

Pompe病又稱糖原貯積癥Ⅱ型（glycogen storage disease type Ⅱ，GSD Ⅱ），是一種由17號染色體酸性α-葡萄糖苷酶（acid α-glucosidase，GAA）缺乏所引起糖原在心臟、骨骼肌和運(yùn)動神經(jīng)元中積累的遺傳代謝性疾?。?］。根據(jù)發(fā)病年齡分為嬰兒型和晚發(fā)型。嬰兒型Pompe病以心臟受累為主，晚發(fā)型Pompe病多累及運(yùn)動神經(jīng)元，兩者預(yù)后均不佳［9-10］。自2006年ERT面世以來，給許多患者帶來希望。然而ERT的局限性逐漸顯現(xiàn)：（1）抗體反應(yīng)：不少患者使用后出現(xiàn)持續(xù)高抗重組人類α-葡萄糖苷酶滴度狀態(tài)；（2）治療周期長，需要頻繁注射，具有輸液相關(guān)風(fēng)險；（3）重組的蛋白不能通過血腦屏障，無法治療有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者，對晚發(fā)型Pompe病患者治療效果不佳［11-12］。從2002年開始，以AAV作為載體治療Pompe病的研究已經(jīng)在動物中得以開展，并不斷優(yōu)化以促進(jìn)其臨床應(yīng)用：（1）從單一血清型的AAV到雜交血清型的AAV［13］；（2）不斷優(yōu)化rAAV的策略，如根據(jù)靶向器官選擇CMV、DES、CB、LSP等啟動子［14］；（3）改進(jìn)給藥方式：嬰兒型Pompe病多選擇靜脈注射、肌內(nèi)注射；晚發(fā)型多選擇中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向治療，肝定向治療在成人患者中也是一種方法［15-16］。Falk等［17］發(fā)現(xiàn)與ERT治療的小鼠相比，AAV2/9-DES-hGAA治療后的GAA-/-小鼠在心肌和呼吸肌中顯示GAA活性增加，糖原積累減少。此外，AAV2/9-DES-hGAA治療后的GAA?/?小鼠呼吸功能有顯著變化，表明部分糾正了下運(yùn)動神經(jīng)元功能。Lee等［15］發(fā)現(xiàn)腦室內(nèi)注射AAV9/3-Syn-IhGAA后，通過降低大腦和脊髓的糖原積累，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和增加髓鞘形成，使Pompe病小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)功能得以改善。2009年，用于治療Pompe病的AAV臨床試驗（NCT00976352）首次在佛羅里達(dá)大學(xué)展開，該試驗證明rAAV1-hGAA對治療慢性呼吸機(jī)依賴的Pompe病患兒是有效和安全的，但該試驗只納入10名患兒［18］。近年來，越來越多相關(guān)的臨床試驗已開展（clinicaltrials.gov），2016年開展“在晚發(fā)型Pompe病患者中肌內(nèi)注射重組AAV酸性α-葡萄糖苷酶（rAAV9-DEShGAA）”的Ⅰ期對照研究（NCT02240407），評估該載體的毒理學(xué)、生物分布和潛在活性；2018年至今開展的臨床研究多集中在“不同的重組腺相關(guān)病毒［AAV2/8-LSPhGAA(ACTUS-101)、AT845、SPK-3006］在晚發(fā)型Pompe病中的應(yīng)用”，旨在探索用于晚發(fā)型Pompe病的rAAV血清型和啟動子最佳組合策略?！翱捎糜谥委烶ompe病的組合物”的專利（CN114127275A）在2022年2月通過，該專利提供了一種可用于治療Pompe病的rAAVAAVhu68.CB6.hGAA［19］。盡管目前很多臨床試驗仍處于進(jìn)展階段，但根據(jù)動物實(shí)驗及已完成的臨床試驗結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，對晚發(fā)型Pompe病患者而言，AAV介導(dǎo)的基因治療似乎是一種更可行的治療方法。

3.2 MPS

MPS是由降解黏多糖的酶缺乏所引起的多組織器官受損的一組疾病，發(fā)病率為1/25 000~1/30 000［20］。根據(jù)特定酶的缺乏將MPS分為7種類型，其臨床表現(xiàn)多樣，常累及多個器官系統(tǒng)［21］。其中MPS Ⅱ型為最常見的類型，而MPS Ⅲ型神經(jīng)系統(tǒng)受累最嚴(yán)重，可導(dǎo)致神經(jīng)退行性變、進(jìn)行性智力障礙和發(fā)育倒退［22］。2020年國內(nèi)首個ERT特異性治療藥物——艾度硫酸酯酶β注射液上市，填補(bǔ)了MPS Ⅱ的臨床治療的空白［23］。ERT已經(jīng)廣泛用于MPS Ⅳ、Ⅱ、Ⅳ-A、Ⅵ、Ⅶ型，但在有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的MPS中療效甚微［24］。造血干細(xì)胞移植療法雖然能夠治療有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的MPS，但對MPSⅢ型無效。因此，近年來美國及一些歐洲國家開展了該病的基因治療，主要涉及MPS Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。Hinderer等［25］研究表明，鞘內(nèi)注射AAV9-hIDUA能夠減少M(fèi)PS Ⅰ型小狗的腦生化異常和底物的積累，具有劑量依賴性；此外，在MPS Ⅰ、ⅡB型小狗實(shí)驗中證實(shí)單次注射AAV5.5-hIDUA、rAAV5-hNAGLU可以治療和預(yù)防其神經(jīng)系統(tǒng)的病理改變，且該實(shí)驗結(jié)果可以重復(fù)，為臨床試驗的開展奠定了基礎(chǔ)［26］。Hinderer等［27］發(fā)現(xiàn)將AAV9.CB.hIDS遞送到腦脊液可以作為MPS Ⅱ型小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)高效、長期遞送酶的平臺；Winner等［28］發(fā) 現(xiàn) 在MPS Ⅲ A大 鼠 腦 實(shí) 質(zhì) 內(nèi) 給 予AAVrh10-SGSH-IRES-SUMF1可以實(shí)現(xiàn)廣泛的酶分布和更好地矯正病理改變；Gutiérrez等［29］構(gòu)建出含有人GALNS基因并由CMV免疫早期啟動子驅(qū)動的AAV衍生載體，實(shí)現(xiàn)了MPS Ⅳ型基因治療的第一步。目前大多臨床試驗都集中在MPS Ⅲ型（NCT02053064；NCT04088734；NCT03612869；NCT04655911；NCT04360265），盡管這些臨床試驗結(jié)果目前仍未報道，但就動物實(shí)驗的結(jié)果而言，AAV介導(dǎo)的基因治療在MPS中有較好的前景，其rAAV構(gòu)建中，仍以AAV9血清型最為常見，啟動子以CB為主，常用注射方式為鞘內(nèi)注射。此外，專利“一種腺相關(guān)病毒雙重載體基因治療系統(tǒng)及其在治療黏多糖貯積癥Ⅱ型中的應(yīng)用”（CN 111110865 A）在2020年5月通過，該發(fā)明為MPS Ⅱ型的臨床治療提供了有效的治療手段［30］。AAV介導(dǎo)的基因療法有望成為伴神經(jīng)系統(tǒng)損害的MPS患者的優(yōu)先療法。

3.3 NCL

NCL又稱為Batten病，是一組由脂褐素沉積所致的進(jìn)行性加重的神經(jīng)退行性疾病，以智力和運(yùn)動功能障礙、癲癇、癡呆、視力減退為主要表現(xiàn)［31］。至今已有14個基因（CLN1~CLN14）被報道與該病相關(guān)（www.ucl.ac.uk/ncl）。研究表明，不需要通過血腦屏障的ERT，如鞘內(nèi)注射，可以顯著緩解神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，減緩病程［32］。目前只有CLN2缺陷患者的腦室內(nèi)ERT——Brineura被美國食品藥物管理局批準(zhǔn)，但仍需終生注射。其余NCL主要予抗癲癇藥物對癥治療［33］。Cabrera-Salazar等［34］和Sondhi等［35］研 究 表 明 顱 內(nèi) 注 射AAVrh10.hTPP1和AA2/1.hTPP1的CLN2-/-大鼠有更好的運(yùn)動功能、更長的壽命、反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞的增生及軸突變性情況的減少。Sondhi等［36］在CLN3-/-的新生小鼠中進(jìn)行顱內(nèi)注射AAVrh.10.CAG.hCLN3后發(fā)現(xiàn)，沉積的物質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化減少，但在18個月時未治療的小鼠未出現(xiàn)明顯的運(yùn)動缺陷，故未評估其行為和運(yùn)動功能。另一個研究也表明，靜脈注射AAV2/9.hHCLN3可以糾正CLN3-/-小鼠的運(yùn)動缺陷［37］。Kleine Holthaus等［38］發(fā)現(xiàn)在CLN6-/-新生小鼠的雙側(cè)腦室內(nèi)注射AAV9.hCLN6后，小鼠壽命延長90%以上且在給藥后23個月內(nèi)保持運(yùn)動功能。Mitchell等［39］對CLN5-/-的羊進(jìn)行顱內(nèi)注射AAV2/9后，其生存時間也顯著延長。NCL動物實(shí)驗中rAAV的構(gòu)建主要以較為成熟的AAV2/9血清型為主，這些實(shí)驗都為NCL臨床試驗的開展奠定了基礎(chǔ)。2004年，第一個AAV介導(dǎo)的基因治療試驗在CLN2缺陷患兒中進(jìn)行（NCT00151216），該試驗納入了11名兒童，分為中度（6名）和重度（5名）2組，通過手術(shù)直接顱內(nèi)注射AAV2CUhCLN2，隨訪4年后Worgall等［40］發(fā)現(xiàn)該治療減慢了疾病進(jìn)程，但有一名受試者在第14天出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)并在術(shù)后49 d死亡，未發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的證據(jù)；40%患者對AAV2衣殼蛋白出現(xiàn)輕微、短暫的體液免疫反應(yīng)。故為進(jìn)一步評估AAV介導(dǎo)CLN2基因治療的安全性和有效性，又開展了臨床試驗NCT01414985、NCT01161576，并針對之前出現(xiàn)的體液反應(yīng)，將rAAV載體血清型調(diào)整為AAVrh.10，目前結(jié)果未見相關(guān)報道。CLN6、CLN3和CLN7的臨床試驗NCT02725580、NCT03770572、NCT04737460目前也在開展中。與此同時，越來越多NCL AAV介導(dǎo)的基因療法的專利被發(fā)明。2021年以來，已通過ScAAV9.CB.CLN6、ScAAV9.P546.CLN3、AAV2-CAG-人TPP1等rAAV專利［41-43］，這些專利進(jìn)一步推動了AAV介導(dǎo)的基因療法在NCL的臨床應(yīng)用。

4 展望

AAV作為基因治療中的“明星載體”，截至2022年9月15日 在ClinialTrials.gov注 冊 的AAV臨床研究高達(dá)292項。然而，AAV介導(dǎo)的基因治療也存在一些局限性：（1）許多人的血清中存在一些AAV血清型的抗體，比如AAV2、AAV1、AAV9，此外這些抗體可能與其他血清型會發(fā)生抗體反應(yīng)；（2）小容量性，AAV的容量僅4.7 kb；（3）多數(shù)基因治療存在的共同問題，比如潛在的致瘤性和不可預(yù)測的風(fēng)險。隨著基因工程的發(fā)展，這些問題被不斷優(yōu)化，如在治療前，先篩查患者體內(nèi)的AAV抗體；通過雙載體或三載體提高其基因容量性。從上述內(nèi)容中，我們發(fā)現(xiàn)AAV介導(dǎo)的基因療法已在小鼠、貓、狗、羊等動物中開展；目前已完成的臨床試驗結(jié)果表明AAV介導(dǎo)的基因治療有望成為治愈LSDs患者的有效手段，特別是在Pompe病、MPS、NCL等病中。盡管如此，AAV介導(dǎo)的基因療法在LSDs的臨床應(yīng)用中仍有很長的路要走。就給藥方式而言，盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)在免疫上擁有“特權(quán)”，較少發(fā)生免疫反應(yīng)，但多次顱內(nèi)給藥仍可能會導(dǎo)致癲癇發(fā)作，甚至使神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的LSDs轉(zhuǎn)變成內(nèi)臟癥狀的LSDs。此外，目前所開展的臨床試驗存在一個共性——納入的受試者較少。再者，其費(fèi)用也是醫(yī)患關(guān)注的問題，2021年治療脊髓肌萎縮癥的諾西那生鈉注射液納入醫(yī)保后，每支從70萬元降至3.3萬元，給很多罕見病家庭帶去了希望。隨著基因治療產(chǎn)業(yè)鏈的不斷完善及國家醫(yī)保的大力支持，相信會有越來越多家庭受益于基因治療。