駱旭銘，陳詩(shī)敏，潘 廣，楊春曉，潘慧鵬*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2.廣州國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新中心，廣州 510520；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

茄二十八星瓢蟲(chóng)Henosepilachna vigintioctopunctata(Fabricius)隸屬鞘翅目 Coleoptera瓢蟲(chóng)科Coccinellidae，是一種在亞洲國(guó)家廣泛分布的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，主要對(duì)茄科植物造成為害，尤其是茄子、馬鈴薯等蔬菜作物[1]。該害蟲(chóng)在我國(guó)及其他亞洲國(guó)家分布廣泛且為害嚴(yán)重[2]。目前，茄二十八星瓢蟲(chóng)的防治主要是以化學(xué)防治為主，然而，在我國(guó)農(nóng)作物生產(chǎn)要求農(nóng)藥負(fù)增長(zhǎng)的背景下，人們迫切需要尋找一種新的、有效的害蟲(chóng)防治方法來(lái)應(yīng)對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)的為害。

RNA干擾（RNA reference，RNAi）作為一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，是通過(guò)導(dǎo)入體外合成的與內(nèi)源靶基因同源的雙鏈RNA（dsRNA）或 siRNA到生物體內(nèi)，使其同源mRNA降解，從而引發(fā)靶標(biāo)基因的沉默[3]。目前，RNA干擾被證實(shí)為研究基因功能的有效工具，為開(kāi)發(fā)具有靶標(biāo)特異性、環(huán)境友好型的害蟲(chóng)防治新方法提供了新思路[4]?；赗NAi的生物農(nóng)藥預(yù)計(jì)將以植物表達(dá)RNAi產(chǎn)品（植物嵌入式殺蟲(chóng)劑，PIPs）和非PIP產(chǎn)品（可噴灑、莖注射、灌根和種子處理等）的形式進(jìn)入市場(chǎng)[5]。近十年，RNAi在害蟲(chóng)綜合治理中的潛在應(yīng)用得到了廣泛的研究[6-8]。

幾丁質(zhì)是僅次于纖維素的第二大天然多糖，廣泛分布于真菌、線蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物中[9]。幾丁質(zhì)主要存在于昆蟲(chóng)表皮層中的上表皮以及消化道的圍食膜基質(zhì)中，這種多糖與硬化蛋白結(jié)合組成復(fù)合體，在增強(qiáng)昆蟲(chóng)的外骨骼結(jié)構(gòu)以及保護(hù)昆蟲(chóng)免受環(huán)境壓力和致病菌感染方面起著關(guān)鍵作用[10]。然而，這種堅(jiān)硬的外表也限制了昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育。為了避免這種情況，昆蟲(chóng)周期性地降解舊的角質(zhì)層，生成新的角質(zhì)層，完成生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。因此，昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育受到幾丁質(zhì)合成與降解平衡的影響，昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)和變態(tài)發(fā)育都依賴于幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)的可塑性[11]。

Cohen等[12]總結(jié)提出了從海藻糖到幾丁質(zhì)的合成途徑由多種酶催化完成，其中幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase，CHS）在合成的最后一步中起著關(guān)鍵作用。CHS基因的cDNA已被廣泛克隆，并在不同昆蟲(chóng)中進(jìn)行了鑒定[13-15]。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)物種中只存在兩種CHS，分別是CHS1和CHS2，也被稱為CHS-A和CHS-B[16,17]。其中CHS1主要在表皮層以及氣管等相關(guān)的外胚層細(xì)胞中表達(dá)，CHS2多在腸道上皮細(xì)胞中特異表達(dá)，并具有參與構(gòu)成圍食膜的功能[11,18]。

因此，本研究選取了茄二十八星瓢蟲(chóng)作為研究對(duì)象，對(duì)從茄二十八星瓢蟲(chóng)基因組獲得的HvCHS1序列進(jìn)行分析；測(cè)定并闡明了HvCHS1在茄二十八星瓢蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)模式；使用飼喂法RNAi，探究了沉默該基因?qū)η讯诵瞧跋x(chóng)中HvCHS1基因表達(dá)、存活和生長(zhǎng)發(fā)育以及表皮形成的影響，以豐富昆蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域關(guān)于CHS的研究?jī)?nèi)容，為實(shí)現(xiàn)基于HvCHS1的飼喂法RNAi的茄二十八星瓢蟲(chóng)的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

茄二十八星瓢蟲(chóng)于2018年5月在廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的龍葵上采集[8]。飼養(yǎng)茄二十八星瓢蟲(chóng)的茄子品種為萬(wàn)盛元帥圓茄苗，將瓢蟲(chóng)放在放有濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙用棉球保濕，置于人工氣候箱（溫度25 ℃±1 ℃，相對(duì)濕度70%±80%，光周期14L∶10D）。

1.2 分析HvCHS1在茄二十八星瓢蟲(chóng)中表達(dá)樣品的制備

收集茄二十八星瓢蟲(chóng)不同發(fā)育階段樣品（卵20粒、1～4齡幼蟲(chóng)各3頭、蛹2頭、雌雄成蟲(chóng)各1頭），分別從5頭4齡幼蟲(chóng)中收集不同組織樣品（中腸、馬氏管、脂肪體、表皮）。每個(gè)樣本分別收集3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用液氮快速冷凍，并在RNA的提取前于-80 ℃保存。

1.3 總RNA提取和第一鏈cDNA的合成

茄二十八星瓢蟲(chóng)不同發(fā)育階段和不同組織的樣品均使用TRIzol法進(jìn)行RNA提取。所有樣品的RNA使用10～100 μL的RNA-free水洗脫，并使用儀器NanoDrop OneC分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，United States）測(cè)定RNA濃度，所有樣本RNA的OD260/OD230在1.8～2.2。使用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，China），根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，1.0 μg的總RNA中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA稀釋10倍后用于后續(xù)的PCR、RT-qPCR和dsRNA的合成試驗(yàn)中。

1.4 HvCHS1序列生物信息學(xué)分析

從茄二十八星瓢蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)中獲得茄二十八星瓢蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶HvCHS1基因序列（GenBank登錄號(hào)：OK563729），利用OFR Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)HvCHS1的開(kāi)放閱讀框；利用 ExPASy translate tool（https://web.expasy.org/translate/）預(yù)測(cè)HvCHS1的氨基酸序列，利用 ExPASy ProtParam（https: //web.expasy.org/protparam/）工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，登陸NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），通過(guò)blastn程序比對(duì)，獲得相似序列。利用Geneious 7.0（https://www.geneious.com/）對(duì)氨基酸序列進(jìn)行剪切比對(duì)，并在MEGA 7.0中采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 HvCHS1基因在茄二十八星瓢蟲(chóng)的時(shí)空表達(dá)模式測(cè)定

根據(jù)1.4中獲得的序列設(shè)計(jì)HvCHS1特異性定量引物（表1），并選取RPS18和RPL13作為內(nèi)參基因[19]，進(jìn)行相對(duì)定量 RT-qPCR分析，基因的相對(duì)表達(dá)量采用 2―△△Ct法（Ct表示循環(huán)數(shù)）進(jìn)行計(jì)算[20]。RT-qPCR反應(yīng)程序參考本課題組已發(fā)表的論文[19]。

1.6 dsRNA的體外合成

根據(jù)1.4中獲得的茄二十八星瓢蟲(chóng)HvCHS1序列，并以綠色熒光蛋白基因GFP序列作為陰性對(duì)照，利用E-RNAi網(wǎng)站（https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//）設(shè)計(jì)HvCHS1和GFP[8]特異性dsRNA引物（表1）。PCR反應(yīng)體系及程序參照Pan等[21]發(fā)表的論文。利用DNA純化回收試劑盒（Universal DNA Purification Kit，TIANGEN，China）回收上述得到的兩種PCR產(chǎn)物，作為體外合成dsRNA的模版。使用MEGAscriptTMT7試劑盒（Thermo Fisher Scientific，USA），根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟來(lái)合成dsRNA。合成的dsRNA溶解于ddH2O中，使用NanoDrop OneC分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，USA）進(jìn)行濃度測(cè)定。此外，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dsRNA的質(zhì)量。

Based on heat-deficiency model, 40 healthy male SD rats, SPF grade, were housed for a week in an air-conditioned room (temperature, 22 oC; relative humidity, 55%) and were randomly divided into 4 groups (n = 10 per group): blank, model, ZM, and WDF (water decoction of Poria) groups.

1.7 飼喂體外合成dsHvCHS1對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)的影響

所有試驗(yàn)均在溫度25 ℃±1 ℃，濕度70%～80%，光周期14L∶10D的人工氣候箱中進(jìn)行。

為探究 dsHvCHS1對(duì)幼蟲(chóng)發(fā)育的潛在影響，我們挑取同一日齡的 1齡初幼蟲(chóng)用于生測(cè)試驗(yàn)。其中dsHvCHS1處理組和dsGFP對(duì)照組各設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭1齡幼蟲(chóng)，于濾紙和加濕棉球的培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)，分別用濃度為50 ng/μL、250 ng/μL和500 ng/μL的 dsHvCHS1溶液浸泡直徑為12 mm的圓形茄子葉片1 min，風(fēng)干后飼喂幼蟲(chóng)，每隔24 h更換一次葉片，飼喂dsHvCHS1浸泡的葉片兩天后，用未經(jīng)處理的茄子葉片飼喂幼蟲(chóng)。對(duì)照組采用500 ng/μL的dsGFP溶液飼喂，處理方法同處理組。試驗(yàn)開(kāi)始后，每天2次記錄幼蟲(chóng)死亡率和發(fā)育階段，連續(xù)記錄10天。

為探究dsHvCHS1對(duì)幼蟲(chóng)化蛹的影響，我們挑取同一日齡的4齡初幼蟲(chóng)用于生測(cè)試驗(yàn)。在50、100和200 ng/μL濃度的dsHvCHS1處理下，觀察其表型表達(dá)。以200 ng/μL dsGFP作為對(duì)照。新蛻皮的4齡幼蟲(chóng)饑餓處理6 h后，每頭幼蟲(chóng)飼喂1 μL dsHvCHS1或dsGFP液滴，幼蟲(chóng)以dsRNA液滴為食后，再用未處理的新鮮葉片為食。每個(gè)dsRNA濃度下共觀察30只4齡幼蟲(chóng)，每天記錄死亡率直到化蛹。

為了探究飼喂dsHvCHS1對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)HvCHS1基因表達(dá)的影響，從飼喂dsRNA開(kāi)始的第2 d和第4 d，分別收集飼喂50 ng/μL dsHvCHS1和dsGFP的1齡幼蟲(chóng)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)收集3頭茄二十八星瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)，用液氮速凍后儲(chǔ)存在-80 ℃中，然后提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于分析HvCHS1基因表達(dá)的變化。提取總RNA和cDNA合成方法同1.3。稀釋10倍的cDNA作為熒光定量PCR的模版。RT-qPCR分析方法同1.5。

1.8 dsRNA的菌液表達(dá)合成

選擇帶有雙T7啟動(dòng)子的L4440載體作為菌液表達(dá)dsRNA的載體，表1列出了用于構(gòu)建表達(dá)dsHvCHS1和dsGFP的特異性引物，目的片段擴(kuò)增的PCR程序參考1.4。在L4440載體上選擇BamHI和SacI作為酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶QuickCut?SacI和QuickCut?BamHI（TaKaRa）酶切L4440載體，利用通用DNA純化試劑盒（Universal DNA Purification Kit，TIANGEN，China）對(duì)PCR產(chǎn)物和線性化的L4440載體進(jìn)行純化。然后，純化后的L4440載體通過(guò)使用重組酶，使之與目的片段重組，將含有目的片段的重組載體轉(zhuǎn)化到具有IPTG誘導(dǎo)T7聚合酶活性的RNaseⅢ缺陷型大腸桿菌HT115（DE3）細(xì)胞中。在LB瓊脂平板上培養(yǎng)后，將含有目的片段的單菌落接種到含有Tet（10 μg/mL）和Amp（100 μg/mL）的4 mL LB液體培養(yǎng)基中，以210 r/min，37 ℃培養(yǎng)12～14 h。將500 μL菌液轉(zhuǎn)移至含有Amp（100 μg/mL）和Tet（10 μg/mL）的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，將菌液稀釋100倍擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌液的OD值在0.5～0.8之間。然后，將IPTG添加至菌液中使其終濃度為1 mmol/L，并在37 ℃，120 r/min下振蕩培養(yǎng)5 h誘導(dǎo)dsRNA。為了檢測(cè)在HT115（DE3）細(xì)胞中是否誘導(dǎo)出dsRNA，以5000 r/min離心10 min收集菌絲，使用HiPure總RNA微型試劑盒（Magen）從菌絲中提取總RNA，用TURBO-DNase（Thermo-Fisher-Scientific，USA）處理RNA以去除DNA。并使用由GoldViewⅠ染色的1.5%瓊脂糖凝膠來(lái)檢測(cè)dsRNA條帶。100 mL表達(dá)dsRNA的菌液以5000 r/min離心10 min收集菌絲，用10 mL無(wú)菌水懸浮菌絲，進(jìn)行飼喂法RNAi試驗(yàn)。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.9 飼喂菌液表達(dá)合成dsHvCHS1對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)存活的影響

試驗(yàn)中所使用的1齡、3齡幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)在經(jīng)過(guò)饑餓處理3 h以上后，分齡期放入放有濕潤(rùn)濾紙和棉球的培養(yǎng)皿中，每個(gè)齡期設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)含有10頭昆蟲(chóng)。將直徑為12 mm的圓形茄子葉片浸入菌液表達(dá)的dsRNA溶液中1 min，然后將葉片放在濾紙上風(fēng)干后飼喂，每個(gè)重復(fù)的1齡幼蟲(chóng)飼喂2片dsRNA處理的葉片，3齡和成蟲(chóng)飼喂20片。每隔24 h更換一次葉片，在飼喂dsRNA浸泡的葉片2 d后，用未經(jīng)處理的新鮮茄子葉片飼喂。在此過(guò)程中，培養(yǎng)皿置于人工氣候箱中。每隔24 h統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中茄二十八星瓢蟲(chóng)的死亡數(shù)目，并計(jì)算對(duì)照和不同處理?xiàng)l件下茄二十八星的存活率的差異。使用菌液表達(dá)合成的dsRNA分別處理茄二十八星瓢蟲(chóng)1齡、3齡幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)，處理的1齡和3齡幼蟲(chóng)持續(xù)觀察10 d，成蟲(chóng)持續(xù)觀察了14 d。

1.10 蘇木精&伊紅（H&E）染色

為了進(jìn)一步觀察dsHvCHS1干擾后對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)4齡幼蟲(chóng)蛻皮的影響，4齡初幼蟲(chóng)在飼喂了200 ng的dsRNAs（dsHvCHS1和dsGFP）后，我們對(duì)進(jìn)入預(yù)蛹期的4齡幼蟲(chóng)腹部表皮進(jìn)行解剖取樣，解剖獲得的腹部表皮使用4%戊二醛溶液固定后，進(jìn)行石蠟包埋，將4 μm石蠟切片粘在玻片上，進(jìn)行H&E染色[22]，使用Pannoramic掃描儀（P250，3D HISTECH，Hungary）對(duì)玻片進(jìn)行掃描，并利用Caseviewer C.V 2.3軟件查看玻片。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 茄二十八星瓢蟲(chóng)HvCHS1基因的序列分析

從茄二十八星瓢蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)中獲得幾丁質(zhì)合成酶1（HvCHS1）基因序列，預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框ORF長(zhǎng)4680 bp，編碼1559個(gè)氨基酸殘基，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為177.5 kDa，分子式為C8062H12574N2096O2284S67，理論等電點(diǎn)（pl）為6.97，包含177個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp＋Glu）和174個(gè)帶正電荷的氨基酸（Arg＋Lys），是一種中性蛋白，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為45.27，總平均親水系數(shù)為-0.091，為親水性蛋白。對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)CHS1與部分昆蟲(chóng)CHS1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，相似度都達(dá)到65%以上，表明CHS1在物種進(jìn)化中具有較高保守性（圖 1）?；诎被嵝蛄朽徑臃ń⒌南到y(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，茄二十八星瓢蟲(chóng)HvCHS1與鞘翅目赤擬谷盜Tribolium castaneum的CHS1親緣關(guān)系最近（83.88%）（圖2）。

圖2 昆蟲(chóng)CHS1氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)分析（鄰接法）Fig.2 Phylogenetic tree analysis of insect CHS1 amino acid sequences (neighbor-joining, NJ)

2.2 HvCHS1基因的時(shí)空表達(dá)模式

RT-qPCR結(jié)果表明，HvCHS1在不同發(fā)育階段的表達(dá)量（F7,16＝16.195，P＜0.0001）和不同組織中的表達(dá)量（F3,8＝27.196，P＜0.0001）均存在差異，其中表達(dá)量最高出現(xiàn)在1齡，最低在雌蟲(chóng)階段（圖3A）。不同組織中，HvCHS1在表皮中的表達(dá)量明顯高于中腸、脂肪體和馬氏管（圖3B）。

圖3 HvCHS1基因在茄二十八星瓢蟲(chóng)不同發(fā)育階段（A）和不同組織（B）的表達(dá)模式Fig.3 Expression profiles of HvCHS1 across developmental stages (A) and among different tissues (B) in H.vigintioctopunctata

2.3 飼喂體外合成dsHvCHS1對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)存活率和生長(zhǎng)發(fā)育的影響

使用不同濃度的體外合成的dsRNA處理茄二十八星瓢蟲(chóng)1齡幼蟲(chóng)，并持續(xù)觀察10 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與dsGFP對(duì)照組相比，dsHvCHS1處理組的死亡率明顯升高。在dsHvCHS1處理組中，dsRNA濃度越高，茄二十八星瓢蟲(chóng)的存活率越低。與對(duì)照組相比，50 ng/μL dsHvCHS1處理的致死率為42.00%（P＝0.0001，Exp (B)＝5.542），250 ng/μL dsHvCHS1處理的致死率為 82.00%（P＜0.0001，Exp (B)＝12.909），而 500 ng/μL dsHvCHS1處理的致死率最高，為94.00%（P＜0.0001，Exp (B)＝19.369）。與對(duì)照組相比，dsHvCHS1處理組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育受到明顯抑制，當(dāng)dsGFP對(duì)照組正常進(jìn)入2齡后，取食了dsHvCHS1的幼蟲(chóng)仍處于1齡狀態(tài)且大部分不能完成蛻皮，最終死亡（圖4）。

圖4 飼喂dsHvCHS1對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)1齡幼蟲(chóng)存活率（A）和發(fā)育（B）的影響Fig.4 The effects of ingestion of dsHvCHS1 on the survival rate (A) and development (B) of 1st instar larvae of H.vigintioctopunctata

為了探究dsHvCHS1對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)化蛹的影響，我們使用不同濃度的dsRNA處理4齡初幼蟲(chóng)。結(jié)果顯示，dsGFP對(duì)照組在7 d后正常化蛹，而dsHvCHS1處理組的個(gè)體出現(xiàn)化蛹異?；虬l(fā)育停止在預(yù)蛹期。與對(duì)照組相比，50、100和500 ng劑量處理下的幼蟲(chóng)，化蛹率分別為68.52%、34.07%和17.04%。這些異常的蛹顏色逐漸加深、干癟，最終死亡（圖5）。

對(duì)預(yù)蛹期幼蟲(chóng)的腹部表皮進(jìn)行H&E染色分析發(fā)現(xiàn)，dsGFP對(duì)照組進(jìn)入預(yù)蛹期后，舊表皮開(kāi)始從皮細(xì)胞層分離的同時(shí)，新表皮開(kāi)始形成。相反，dsHvCHS1處理組結(jié)果顯示，舊表皮與皮細(xì)胞層分離，但新表皮無(wú)法形成，最終導(dǎo)致蛻皮失?。▓D5）。

圖5 飼喂dsHvCHS1對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)化蛹的影響Fig.5 The effects of dsHvCHS1 on the pupation of H.vigintioctopunctata

2.4 飼喂體外合成dsHvCHS1對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)HvCHS1基因表達(dá)的影響

結(jié)果表明，1齡幼蟲(chóng)在dsHvCHS1處理下，HvCHS1的相對(duì)表達(dá)量在第4 d被顯著抑制，與對(duì)照組相比，顯著下降了2.83倍（F1,4＝222.698，P＜0.0001），而在第2 d的表達(dá)量與dsGFP對(duì)照組相比沒(méi)有顯著變化（F1,4＝0.901，P＝0.396）（圖6）。

圖6 飼喂dsHvCHS1對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)1齡幼蟲(chóng)HvCHS1基因表達(dá)的影響Fig.6 The effects of ingestion of dsHvCHS1 on HvCHS1 expression in the 1st instar larvae of H.vigintioctopunctata

2.5 飼喂菌液表達(dá)合成dsHvCHS1對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)存活率的影響

結(jié)果如圖7所示，經(jīng)菌液表達(dá)dsHvCHS1處理后的1齡及3齡幼蟲(chóng)均在第3 d開(kāi)始出現(xiàn)死亡，而菌液表達(dá)dsHvCHS1對(duì)成蟲(chóng)的存活率無(wú)影響。10 d后，1齡幼蟲(chóng)存活率達(dá)36.00%（P＜0.0001，Exp (B)＝8.967），3齡幼蟲(chóng)存活率達(dá)40.00%（P＜0.0001，Exp (B)＝7.827）。

圖7 菌液表達(dá)合成dsHvCHS1對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)1齡（A）、3齡（B）幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)（C）存活率影響Fig.7 The effects of bacterially expressed dsHvCHS1 on the survival rate of 1st (A), 3rd (B) instar larvae and adults (C) of H.vigintioctopunctata

3 討論

本研究揭示了飼喂法RNAi對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)及成蟲(chóng)存活和發(fā)育的影響。HvCHS1基因的敲除降低了茄二十八星瓢蟲(chóng)的存活率，抑制了其變態(tài)發(fā)育，表明HvCHS1基因可以作為茄二十八星瓢蟲(chóng)生物防治的潛在靶標(biāo)基因。

幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)上表皮和消化道圍食膜的重要組成部分。HvCHS1在茄二十八星瓢蟲(chóng)的表皮中高度表達(dá)，在增強(qiáng)昆蟲(chóng)的外骨骼結(jié)構(gòu)，保護(hù)昆蟲(chóng)免受環(huán)境脅迫和病原菌感染方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10]。本研究中，表皮中HvCHS1基因高表達(dá)與先前的報(bào)道結(jié)果類(lèi)似[23-27]，表明CHS1的組織表達(dá)模式具有顯著的組織特異性，且主要集中在表皮上。但前期研究結(jié)果表明，CHS1基因不同發(fā)育階段的表達(dá)模式在不同昆蟲(chóng)中存在差異。Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis的CHS1基因在卵期表達(dá)量最低，成蟲(chóng)期表達(dá)量最高；而在褐飛虱Nilaparvata lugens中，CHS1在若蟲(chóng)階段表達(dá)量最高，成蟲(chóng)階段表達(dá)量最低[28]。在本試驗(yàn)中，采用RT-qPCR方法對(duì)茄二十八星瓢蟲(chóng)不同發(fā)育階段中HvCHS1的表達(dá)量進(jìn)行了分析，雖然HvCHS1在茄二十八星瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)至成蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段都有表達(dá)，但是存在明顯的發(fā)育階段表達(dá)特異性，在1齡中表達(dá)量最高，在雌蟲(chóng)中表達(dá)量最低。茄二十八星瓢蟲(chóng)是完全變態(tài)的昆蟲(chóng)，它經(jīng)歷了卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)4個(gè)完整的生命階段。因此，需要周期性的蛻皮，以保證外骨骼的擴(kuò)張和個(gè)體的正常生長(zhǎng)，在此過(guò)程中需要幾丁質(zhì)的不斷積累，以形成新的外骨骼。且之前的研究已經(jīng)表明CHS1對(duì)于赤擬谷盜T.castaneum的卵殼形成及卵孵化起至關(guān)重要的作用[29]，而在棉鈴象甲Anthonomus grandis和褐飛虱的研究中，經(jīng)RNAi處理抑制CHS1表達(dá)的雌蟲(chóng)可以正常產(chǎn)卵，但顯著降低了卵孵化率[30,31]。這些結(jié)果表明CHS1在卵巢發(fā)育、卵殼形成和卵孵化過(guò)程中起重要作用。

RNAi技術(shù)近二十年來(lái)被有效地用于研究害蟲(chóng)抗藥性機(jī)制、昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育的功能分析，以及通過(guò)飼喂法或注射法RNAi挖掘害蟲(chóng)致死基因等[5,8,32]。我們的研究表明，在飼喂了dsHvCHS1第4 d，HvCHS1基因表達(dá)量顯著下降，并導(dǎo)致死亡率呈劑量效應(yīng)。用50 ng/μL、250 ng/μL和500 ng/μL dsHvCHS1飼喂1齡幼蟲(chóng)的致死率分別為42.00%、82.00%和94.00%；用50 ng、100 ng和200 ng劑量飼喂4齡幼蟲(chóng)的化蛹率分別為68.52%、34.07%和17.04%。取食dsRNA的劑量越高，幼蟲(chóng)的死亡率越高。本研究發(fā)現(xiàn)，dsHvCHS1抑制了茄二十八星瓢蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，大多數(shù)個(gè)體不能完成正常的蛻皮或出現(xiàn)異常的化蛹，最終導(dǎo)致死亡。表皮H&E染色分析表明，dsHvCHS1處理的幼蟲(chóng)出現(xiàn)舊的表皮細(xì)胞碎裂并與表皮細(xì)胞分離，但無(wú)法形成新表皮的現(xiàn)象，導(dǎo)致死亡。推測(cè)HvCHS1表達(dá)量的下降與幾丁質(zhì)合成的減少有關(guān)，導(dǎo)致新的角質(zhì)層不能正常形成，使幼蟲(chóng)無(wú)法完成蛻皮或化蛹。在細(xì)菌中大量表達(dá)dsRNA是近年來(lái)建立起的一種高效、低成本的dsRNA生產(chǎn)方法。本研究提供的證據(jù)表明，飼喂菌液表達(dá)的dsHvCHS1可有效引起RNAi效應(yīng)，從而導(dǎo)致較高的幼蟲(chóng)死亡率，1齡幼蟲(chóng)累計(jì)達(dá)到62%死亡率，3齡幼蟲(chóng)達(dá)到60%死亡率；對(duì)成蟲(chóng)的影響不大，推測(cè)可能是成蟲(chóng)期無(wú)需形成新的表皮。先前的研究中，陳靜等[33]干擾SfCHS1基因表達(dá)后，顯著降低了白背飛虱Sogatella furcifera的表達(dá)量和存活率；余志濤等[34]干擾OcCHS1基因表達(dá)，導(dǎo)致中華稻蝗Oxya chinensis蛻皮困難而死亡，少數(shù)存活的若蟲(chóng)腹部新表皮出現(xiàn)皺縮，無(wú)法正常羽化；注射 dsOfCHS1的亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis幼蟲(chóng)出現(xiàn)畸形，表現(xiàn)為幼蟲(chóng)身體不能完全脫離舊表皮而死亡或新形成的表皮皺縮[35]；用細(xì)菌表達(dá)的dsRNA干擾甜菜夜蛾Spodoptera exigua的CHSA基因后，幼蟲(chóng)出現(xiàn)蛻皮障礙呈現(xiàn)“雙頭”表型，即僅頭部舊表皮開(kāi)裂，其余身體被舊表皮包裹，無(wú)法形成新表皮[36]。此外，在柑橘全爪螨Panonychus citri，棉蚜Aphis gossypii，橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis和東亞飛蝗L.manilensis中也有相似的研究結(jié)果[23,37-39]。這些研究證實(shí)CHS1對(duì)昆蟲(chóng)表皮的形成具有重要作用，沉默CHS1表達(dá)會(huì)影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育。

近幾年，茄二十八星瓢蟲(chóng)已成為茄科蔬菜上的重要害蟲(chóng)。由于過(guò)量使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑，導(dǎo)致害蟲(chóng)抗藥性增強(qiáng)和環(huán)境污染日益嚴(yán)重。基于RNAi技術(shù)的害蟲(chóng)防控是一種新型的綠色害蟲(chóng)防控技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。通過(guò)在作物中表達(dá)靶標(biāo)基因的dsRNA實(shí)現(xiàn)對(duì)有害生物的控制，是更為高效的dsRNA遞送策略。使用表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米可以提高防治玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera的效率和持久性[40]，棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera取食表達(dá)dsHaHR3的轉(zhuǎn)基因棉花后，導(dǎo)致幼蟲(chóng)死亡率，畸蛹率和成蟲(chóng)畸形率增加[41]。此外，桃蚜Myzus persica和綠盲蝽Apolygus lucorumi在取食表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物后，靶標(biāo)基因mRNA水平顯著下調(diào)[42,43]。這些結(jié)果表明，在篩選出與害蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的靶標(biāo)基因后，可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)dsRNA或者直接噴施dsRNA進(jìn)行抑制目的基因的表達(dá)，從而達(dá)到防治害蟲(chóng)的目的。幾丁質(zhì)廣泛存在于甲殼動(dòng)物、昆蟲(chóng)和真菌中，但是在高等動(dòng)物中并不存在，因此HvCHS1可以安全應(yīng)用于茄二十八星瓢蟲(chóng)的生物防治中。

本研究在茄二十八星瓢蟲(chóng)中鑒定HvCHS1，通過(guò)飼喂法驗(yàn)證HvCHS1可以影響幼蟲(chóng)存活和發(fā)育，表明HvCHS1可以作為一個(gè)潛在的RNAi靶標(biāo)基因，用于茄二十八星瓢蟲(chóng)生物防治。